2. Definición
Cuantificación de la potencia o actividad de una
sustancia activa determinada comparando las
concentraciones de una muestra y de una preparación
patrón o de referencia que producen el mismo efecto,
obteniéndose así una potencia relativa cuantitativa.
En el caso de las valoraciones microbiológicas de los
antibióticos, la determinación de su potencia se basa en
la comparación cuantitativa de la inhibición del
crecimiento de un microorganismo de ensayo en un
medio adecuado.
El microorganismo de ensayo debe ser susceptible al
antibiótico a valorar y el medio de cultivo permitir un
crecimiento rápido y abundante en ausencia del
antibiótico.
(Cerra et al., 2013)
3. ¿Cuándo usar un método microbiológico para cuantificar un antibiótico?
Están indicados cuando así lo
especifican las Farmacopeas o
cuando es el único método aplicable
Por la naturaleza química del
antibiótico o a que la misma es
desconocida.
Determina la potencia a través
de la medición de la inhibición
del crecimiento y no de
propiedades físicas o
estructuras químicas.
El método microbiológico puede
constituir una alternativa de
elección por su elevada
sensibilidad y especificidad
Las muestras que pueden ser analizadas
por métodos microbiológicos incluyen
sustancias activas puras y productos
compuestos.
Tienen compuestos constituidos por
mezclas de sustancias relacionadas
químicamente pero que difieren
cualitativamente y cuantitativamente en
sus efectos biológicos o por mezclas de
sustancias no relacionadas químicamente
pero que tienen actividad biológica.
(Cerra et al., 2013)
4. Propósito
Ensayos de
Biodisponibilidad en
fluidos corporales
Control de calidad de
materias primas y
productos finales
Investigación y desarrollo
de nuevas sustancias
activas
Seguimiento de
procesos fermentativos
de producción de
antibióticos
Las características de los ensayos microbiológicos dependerán de estos propósitos
(Cerra et al., 2013)
5. Determinación de la potencia (actividad) de un antibiótico por métodos microbiológicos
Realización de la
curva Dosis –
Respuesta
• Rango de concentraciones del
ensayo
• Transformaciones de datos
para linealizar la respuesta
2
Elección del diseño
experimental
• Examinar la validez del modelo
matemático para calcular la
potencia
• Estimar el intervalo de
confianza de la potencia
calculada
3
Consulta bibliográfica
• Preparaciones de referencia y
unidades
• Técnicas sugeridas
• Microorganismos de ensayo y
preparación de inóculos
• Medios de cultivo
• Diluyentes
• Rangos de concentraciones de
las sustancias activas
• Temperaturas de incubación
1
Ensayo
microbiológico
propiamente
dicho
4
Análisis de la
validez del
ensayo
6
Cálculo de la
potencia y de su
intervalo de
confianza
7
Descarte y
reemplazo de
datos aberrantes
5
Etapas para la determinación de la potencia antibiótica por métodos microbiológicos
(Cerra et al., 2013)
6. Preparaciones de referencia y unidades
Es fundamental tener patrones de referencia que sean estables, homogéneos y disponibles en
cantidades adecuadas por un tiempo prolongado, con el fin de realizar ensayos microbiológicos de
antibióticos y comparar su eficacia con un patrón.
Preparación de las soluciones de patrones y muestras
Las Farmacopeas indican los compuestos químicos y la composición de los diluyentes para crear
soluciones concentradas y de trabajo. Debido a que la exactitud de las soluciones de referencia
depende de las mediciones de volumen y de peso, es importante tener cuidado para evitar errores; una
cantidad demasiado pequeña o excesiva pueden provocar errores.
Microorganismos de ensayo y preparación de inóculos
Las muestras microbianas usadas para los ensayos de Farmacopeas deben ser almacenadas de
acuerdo con estándares internacionales para garantizar su pureza, especialmente en términos de
genética. Los inóculos se estandarizan normalmente mediante mediciones de absorbancia en células
vegetativas y contajes de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) para los esporos.
(Cerra et al., 2013)
7. Técnicas
En ambos casos los principios son los mismos:
1. La comparación del efecto de una muestra (actividad desconocida) con el de un patrón de referencia
(actividad conocida)
2. La medición del efecto inhibidor sobre el crecimiento del microorganismo de ensayo
3. La existencia de alguna forma de relación cuantitativa entre las concentraciones de la sustancia activa y
la respuestas
4. Que la relación cuantitativa sea la misma para el patrón y la muestra (condición de similitud).
Técnica en placas o de difusión
en medios gelificados
Técnica en tubos o
turbidimétrica
Gradiente de
concentración
del antibiótico
Respuestas: Halos
de inhibición
Solución de la
sustancia activa en
el medio de cultivo
Respuestas:
Absorbancia
Transmitancia
(Cerra et al., 2013)
8. Técnica en placas
Preparación del inóculo
Cultivo “stock”
Cultivo fresco
Suspensión estandarizada
Inoculación
Medio fundido (45°C)
Homogeneizar
Medio inoculado
(N0/ml)
Placas con o sin base
Placas inoculadas
+
Sustancia activa
Predifusión
Incubación
Lectura y registro de
Resultados
Absorbancia
Recuento (esporos)
Volumen medido
Gelificar
Añadir Reservorios
Sol. Trabajo
Sol. Trabajo
Sol. Madre
Preparación
Patrón
Muestra
Lectura y registro de Resultados
Diluy. Diluy.
Esquema simplificado de la técnica en placas
(difusión en medios gelificados)
(Cerra et al., 2013)
9. Pasos de la técnica en
placas son críticos
para su
reproducibilidad:
Inocular un volumen medido de suspensión
estandarizada garantiza la reproducibilidad del
número inicial de microorganismos.
La distribución de medio inoculado en las placas
de Petri debe ser uniforme para asegurar que el
espesor del cultivo sea el mismo. Esto garantiza
que la difusión de la sustancia activa desde el
reservorio se realice de forma radial, logrando así
una mayor respuesta.
Es indispensable mantener la misma temperatura
durante la incubación para garantizar una
multiplicación y difusión de los microorganismos y
antibióticos adecuadas.
(Cerra et al., 2013)
10. Técnica en tubos
1. Se colocan 1ml de cada solución en tubos de
ensayo y se agregan 9ml de medio inoculado
con un microorganismo de ensayo.
2. Los tubos se incuban aproximadamente 4
horas para interrumpir el crecimiento
microbiano.
3. Se realizan lecturas espectrofotométricas
contra un blanco de lectura para cuantificar la
absorbancia/transmitancia del crecimiento del
microorganismo de ensayo.
Los ensayos microbiológicos de antibióticos
se realizan preparando soluciones de la
sustancia activa (patrón y muestra) en un
medio de cultivo.
Proceso
(Cerra et al., 2013)
11. Técnica en tubos
Factores que modifican la magnitud de la respuesta
La magnitud de la
respuesta depende
del número inicial y
la velocidad de
crecimiento de los
microorganismos, así
como del tiempo de
incubación.
Un aumento de 1º C
producirá una
diferencia en la
velocidad de
crecimiento, resultando
en una población
mayor.
Los ensayos en tubos
consideran la
multiplicación de
microorganismos de
ensayo como el único
fenómeno.
Esto puede
provocar errores
considerables en
los ensayos
microbiológicos.
(Cerra et al., 2013)
12. Curva dosis – Respuesta
Se realiza una curva D-R para seleccionar un rango de
concentraciones de una sustancia activa, con el fin de que la
relación cuantitativa entre la dosis y la respuesta sea lineal y
se obtenga una regresión significativa.
El gráfico muestra la relación entre las respuestas y la dosis,
estudiada mediante transformaciones matemáticas. Se
observan rangos de dosis con linealidad y regresión, lo que
permite un análisis detallado de los resultados obtenidos.
Curva Dosis – Respuesta
(Cerra et al., 2013)
13. Para los ensayos microbiológicos
de antibióticos, el análisis
estadístico dependerá de si el
patrón de respuesta es lineal
respecto a la dosis o al logaritmo
de la misma.
Si es lineal, se aplicará el modelo
de relación de pendientes, y si
es logarítmica, se usarán rectas
paralelas.
(Cerra et al., 2013)
14. Elecciòn del
diseño
experimental
Estos diseños permiten verificar la
validez del modelo matemático y
calcular el error, y están diseñados
para controlar las variables que
influyen en las unidades
experimentales.
Los diseños experimentales mayormente
empleados en los ensayos microbiológicos
de antibióticos son los
diseños factoriales con
separación en bloques (técnica
en placas) o sin separación en
bloques (técnica en tubos)
Los diseños factoriales incluyen
relación de dosis constante,
separación en bloques, número
de dosis del patrón y de la
muestra iguales, y número de
respuestas por tratamiento
iguales, para facilitar el análisis
estadístico.
El diseño factorial más simple
para analizar criterios de
validez del ensayo es 2x3 o
3+3, usando 3 concentraciones
del patrón y 3 de la muestra. El 2x2 o
2+2 se usa menos, pero no permite
demostrar que no hay curvatura. Estos
diseños se han reemplazado por los
factoriales.
(Cerra et al., 2013)
15. Descarte y reemplazo de datos aberrante
Los datos a descartar
pueden obedecer a:
Fallas reconocidas durante la realización
del ensayo
Posibles fallas descubiertas después de tabular las
respuestas
Atribuibles a irregularidades durante el ensayo
Causa desconocida. En este caso se debe realizar el
análisis de datos aberrantes para saber si corresponde
descartarlos.
Para el análisis de datos aberrantes en experimentos con 2 o más tratamientos:
1. se debe ordenar las respuestas de cada tratamiento en orden creciente o decreciente
de magnitud
2. calcular el Rango (K) de cada tratamiento
3. obtener el valor de R dividiendo el mayor K por la sumatoria de todos los K
4. compararlo con el valor crítico de R de tablas en las que k es el número de
tratamientos y f es el número de respuestas por tratamiento.
(Cerra et al., 2013)
16. Tests de validez
Los ensayos microbiológicos válidos
determinan la potencia de un antibiótico en
un ensayo y el intervalo de confianza de
dicha potencia. Estos ensayos tienen en
cuenta varias fuentes de variación, como
preparaciones, regresión, desviación del
paralelismo, curvaturas y bloques. Esto
ayuda a asegurar que los resultados
obtenidos sean confiables y precisos.
Regresión:
Significativa (p < 0,05)
Muy significativa (p < 0,01)
Desviación del paralelismo: no significativa (p >
0,05)
Curvatura combinada: no significativa (p > 0,05)
Curvatura opuesta: no significativa (p > 0,05
(Cerra et al., 2013)
17. CÁLCULO DE LA POTENCIA Y SU INTERVALO DE CONFIANZA
Estos métodos permiten determinar la potencia de una muestra con un intervalo de confianza para una
probabilidad específica, proporcionando una herramienta valiosa para la evaluación de los resultados de los
ensayos microbiológicos.
Cálculo gráfico
Cálculo analítico
Cálculos
(Cerra et al., 2013)
18. RD = antilog MD
POTENCIA CALCULADA de D = RD x Potencia supuesta de D
La potencia supuesta se define como la potencia que tendría la muestra para que las
soluciones de trabajo del patrón y de la muestra fueran idénticas:
Hay una confianza del 95% de que la potencia del desconocido esté
entre PS y PI. Si el intervalo de confianza excede los límites
establecidos en la monografía correspondiente, significa que el
ensayo no tiene la precisión adecuada.
PS (límite superior) = RS x Potencia supuesta
PI (límite inferior) = RI x Potencia supuesta
(Cerra et al., 2013)
19. Para informar la potencia de una muestra de un antibiótico,
obtenida a partir de un ensayo microbiológico se deben
cumplir:
• El ensayo debe cumplir con los criterios de validez
• El intervalo de confianza de la potencia debe estar
dentro de los límites establecidos
Conclusión
20. Bibliografía
Cerra, H., Fernández, M. C., Horak, C., Lagomarsino, M.,
Torno, G., & Zarankin, E. (2013). Manual de
microbiología aplicada a las industrias farmacéutica,
cosmética y de productos médicos.Capítulo IV.5.
(Cerra et al., 2013)
