Este documento describe la composición química de las aceitunas. Se componen principalmente de agua, aceite, azúcares, proteínas y compuestos fenólicos. El aceite se acumula en la pulpa y está formado por triglicéridos, que son sintetizados a través de la ruta de Kennedy en el retículo endoplasmático a partir de ácidos grasos producidos de novo en los plastos. La biosíntesis de lípidos depende de factores como la luz y la temperatura.

1. Composición Química de la Aceituna María de la Luz Hurtado P. Ing. Agr. Mg. Sc. Agosto 2004

2. Aceituna Botánica Drupa : Fruto monospermo de mesocarpo carnoso y endocarpio leñoso Dimensiones: 1 - 4 cm longitud 0,6 - 2 cm diámetro Crecimiento fruto: 6 - 7 meses Curva doble sigmoidea

3. Partes de la aceituna (epicarpio; piel: epidermis + cutícula) (pulpa) (hueso, carozo) Endocarpo Exocarpo Mesocarpo Componentes de la aceituna (%) Fuente: diversos autores (Barile, Barranco, Kiritsakis)

4. Mesocarpo (pulpa) Cell parenquimáticas: isodiamétricas gran aumento tamaño (dess) grandes espacios intercelulares Etapas División celular (6 - 8 semanas dp floración) Expansión celular: (desde 8 semanas en adelante), crecimiento mesocarpo exclusivamente por EXPANSIÓN celular ¿Donde se acumula el aceite? En la VACUOLA de las células parenquimáticas del mesocarpo

5. Composición química Componentes Agua Aceite (lípidos, materia grasa) Azúcares reductores (3 - 4%): glucosa, fructosa, sacarosa Polisacáridos (4%): celulosa, hemicelulosa, lignina Pectina (0,3 - 0,6% en pulpa) Proteínas (1 - 3%): arginina Compuestos fenólicos (1 - 3%) Acidos orgánicos (cítrico, oxálico, malónico, tartárico,...) Pigmentos

6. Biosíntesis de Lípidos Lípidos: Biomoléculas orgánicas formadas por carbono, hidrógeno y oxígeno (menor %). Pueden contener f ósforo , nitrógeno y azufre . Son insolubles en agua y solubles en disolventes orgánicos Clasificación de los lípidos: Lípidos insaponificables (s/ ac. grasos) - Terpenos - Esteroides - Prostaglandinas simples complejos Lípidos saponificables (c/ ac. grasos) - Acilglicéridos - Ceras - Fosfolípidos - Glucolípidos

7. Acidos grasos: Larga cadena hidrocarbonada lineal, con número par de átomos de carbono. Tienen un grupo carboxilo (-COOH). Clasificación de los ácidos grasos: Biosíntesis de Lípidos Ac. grasos saturados Tienen enlaces simples entre los átomos de carbono. Ac. grasos insaturados Tienen uno o varios dobles enlaces en su cadena y sus moléculas presentan codos, (cambio de dirección)

8. Estructura ácidos grasos Biosíntesis de Lípidos saturado insaturado poliinsaturado 18:0 18:1 18:2 18:4 Ac. esteárico Ac. oleico Ac. linoleico Ac.araquidónico

9. Ac.Miristico C14:0 Ac.Palmitico C16:0 Ac.Estearico C18:0 Biosíntesis de Lípidos Acidos grasos saturados Acidos grasos Insaturados Monoinsaturados Poliinsaturados Ac.Oleico C18:1 Ac.Elaidico C18:1 Ac.Erucico C22:1 Ac.Linoleico C18:2w6 Ac.Linolénico C18:3w3 Ac.Araquidonico C20:4w6 Ac.Eicosapentanoico C20:5w3 Ac.Docosahexanoico C22:6w3 Acidos grasos

10. Biosíntesis de Lípidos

11. Las aceitunas acumulan lípidos en forma de triacilglicéridos (triglicéridos) ¿Qué es un triglicérido? Biosíntesis de Lípidos Monoinsaturado  -9 Saturado ¿Cómo se producen? 9

12. Contribución del fruto y de las hojas en la asimilación de lípidos Biosíntesis de Lípidos Fuente de C atmosférico Fuentes de fotosintatos: Precursor de la síntesis de lípidos Durante la foss., los fotosintatos fijan CO 2 atm. y se produce glucosa

13. Aceituna : La pulpa es capaz de sintetizar diferentes glicerolípidos usando diversos precursores (glucosa C 6 .........bicarbonato C 2 ) La aceituna puede funcionar como: Un “sink” o atrapador de moléculas fijadas en otros lugares Un órgano fotosintético ¿Que significa esto?: el fruto puede metabolizar fotosintatos fijados en hojas y transportados vía floema el fruto puede fijar CO 2 atmosférico en sus cloroplastos El pericarpio verde es muy activo Dependencia de la LUZ: Luz dependiente: vía ribulosa 1,5 difosfato (ciclo Calvin) Oscuridad: fijación bicarbonato por fosfoenol piruvato carboxilasa con producción de oxaloacetato Biosíntesis de Lípidos

14. ¿Quién contribuye más? Estudios realizados para determinar contribución relativa: ramas SIN hojas, con aceitunas ramas CON hojas, aceitunas en oscuridad Después de 20 semanas de estudio: hubo reducción del contenido de aceite en ambas aceitunas la reducción fue de aprox. 30% La formación de aceite en las aceitunas requiere de el aporte de ambas fuentes de fotosintatos Biosíntesis de Lípidos

15. Formación del PRECURSOR en la síntesis de ácidos grasos ( ACETIL-CoA) En PLASTO celular, se degrada 1 molécula de glucosa (C 6 ) vía glicólisis y produce ACETIL-CoA, por enzima Piruvato Deshidrogenasa Glucosa + 2 ADP + 2Pi + 2 NAD + ==>2 Acido pirúvico + 2 ATP + 2 NADH + 2 H + + 2 Agua Biosíntesis de Lípidos Precursor

16. Formación del PRECURSOR en la síntesis de ácidos grasos ( ACETIL-CoA) (cont....) En MITOCONDRIA, la enzima Piruvato Deshidrogenasa produce ACETIL-CoA, que es hidrolizado a Ac. Acético, éste cruza membrana sub-celular y en el Plasto es activado a Acetil-CoA LA SÍNTESIS DE ACIDOS GRASOS TIENE LUGAR EN EL PLASTO CELULAR En la aceituna, tanto el acetato como el piruvato pueden ser incorporados en lípidos acilados Biosíntesis de Lípidos

18. ETAPAS: - SÍNTESIS DE NOVO de ácidos grasos - Modificación del ácido graso - Ensamblaje de lípidos: RUTA KENNEDY - Almacenamiento de TAG SÍNTESIS DE NOVO de ácidos grasos Ocurre en el Plasto Requiere de 2 enzimas: Acetil-CoA carboxilasa (ACC) Acido graso sintetasa (FAS) Biosíntesis de Lípidos

19. Biosíntesis de Lípidos (síntesis de NOVO) condensación Acetil-CoA + Bicarbonato Acetil-CoA carboxilasa ACC Malonil-CoA (intermedio) enzima Malonil-CoA - ACP transacilasa Malonil-ACP (proteína transportadora de Acilos) enzima Ciclo de Elongación Acido graso sintetasa FAS:  -cetoacil-ACP sintetasa I, II, III (KAS I, II III)  -cetoacil-ACP reductasa  -hidroacil-ACP dehidrasa enoil-ACP reductasa Malonil-ACP + Acetil-CoA condensación KAS III enzima

20. Biosíntesis de Lípidos (síntesis de NOVO) Acetoacil-ACP  -cetoacil-ACP reductasa enzima  -hidroxiacil-derivado reducción deshidratación  -hidroxiacil-ACP dehidrasa enzima reducción enoil-ACP reductasa Butiril (derivado 4C) Acil-ACP Ciclo de Condensaciones sucesivas KAS I enzima Utiliza Acil-ACP como sustrato inicial, y no Actil-CoA Palmitoil-ACP (Palmitato C16) KAS II enzima Estearoil-ACP (Estearato C18) elongación Este paso determina relación C16/C18 del pool resultante de ac. grasos

21. La enzima KAS III determina relación C16/C18 La relación C16/C18 determina el grado de insaturación del pdto. final Palmitato (C16) es el ac. graso saturado mas frecuente Los ácidos grasos C18 insaturados son los principales productos de la formación de ac. gr. en plantas ¿Cómo termina la cadena en la síntesis de ac. grasos? Actividad enzimática de: aciltransferasas tioesterasas En aceituna, la acil-ACP tioesterasa tiene una actividad óptima con Oleil-ACP (C18) Oleato Biosíntesis de Lípidos (síntesis de NOVO)

24. Modificación del ácido graso En Plasto está enzima Estearil-ACP  9 desaturasa El ESTEARATO (C18) no se acumula como tal El OLEATO es el principal producto de la síntesis de novo A través de una serie de desaturaciones, se forman ac. gr. poliinsaturados Estas desaturaciones pueden ocurrir en el plasto o en el Retículo endoplasmático Oleato Linoleato  -linoleato Biosíntesis de Lípidos

25. Ensamblaje de lípidos: RUTA KENNEDY Ocurre en el retíulo endoplasmátio de la célula Incorporación de ácidos grasos a lípidos complejos Producción de TRIGLICERIDOS (TAG) Sustrato mas abundante Oleil-CoA (Oleato) Enzimas participantes son Transferasas Biosíntesis de Lípidos glicerol sn -1 sn -2 sn -3

26. Biosíntesis de Lípidos (ruta Kennedy) Glicerol 3-fosfato (G 3-P) Glicerol 3-fosfato aciltransferasa (G3PAT) 1-Acil-G 3-P lisofosfatidato aciltransferasa (LPAAT) Fosfatidato Fosfatidato fosfohidrolasa (PAP) Diacilglicerol (DAG) Diacilglicerol aciltransferasa (DAGAT) Triacilglicerol (TAG)

27. Acilación sucesiva del glicerol para producir Fosfatidato El Fosfatidato es desfosforilado para producir DAG El DAG es finalmente acilado para producir TAG La especificidad de las enzimas Aciltransferasas determinan la composición del TAG Son 4 enzimas: G 3PAT: presenta mayor afinidad por el Palmitato  se espera mayor posición de Palmitato en sn -1 También opera bien con Oleato En aceituna, análisis de estereoespecificidad muestran mayor proporción de Linoleato en sn -1 Esto sugiere que linoleil-CoA es un sustrato efectivo para la enzima G3PAT de la aceituna Biosíntesis de Lípidos (ruta Kennedy)

28. Son 4 enzimas: LPAAT : es la 2ª enzima en actuar tiene mayor afinidad por Oleato manipulación genética en plantas (*) PAP: controla la velocidad de acumulación de los TAG se trasloca desde citosol al retículo endoplasmático, donde es mucho más activa DAGAT: para control de flujo, esta enzima representa una limitante en la ruta Kennedy, para aquellas plantas donde hay gran acumulación de aceite estudios de mutaciones de DAGT muestran menor actividad enzimática, menor velocidad acumulación de TAG e incremento de DAG (inter1/2) Biosíntesis de Lípidos (ruta Kennedy)

29. Almacenamiento de TAG En semillas oleaginosas, los TAG se almacenan en cuerpos oleosos, en cuyo proceso participa una proteína, Oleosina En la aceituna, el aceite se acumula en la pulpa, y no posee cuerpos oleosos En aceituna, los TAG tienden a fusionarse y formar gotas de aceite, que crecen durante el desarrollo y maduración del fruto (30  m) Esto ocurre porque en la aceituna NO está presente la proteína Oleosina Esto también explica porqué se puede extraer el aceite de oliva mediante medios mecánicos (molienda) Biosíntesis de Lípidos

30. Algunos factores ambientales: Luz: diversos estudios han relacionado la producción de aceite con la posición de la fruta en la canopia del árbol. Aceitunas en la parte superior reciben mayor irradiación, presentan mayor peso y un mayor contenido de aceite estudios del contenido de aceite entre aceitunas ubicadas en distintas partes del árbol demuestran que una alta irradiación mejora el rendimiento de aceite Temperatura: estudios han demostrado que la síntesis de TAG se ve reducida a Tº mayores de 40ºC Biosíntesis de Lípidos

31. Consideraciones finales en la biosíntesis de lípidos: El precursor Acetil-CoA y los cofactores proviene del metabolismo de los azúcares, existe una correlación negativa entre el contenido de aceite y los azúcares reductores de la pulpa, durante el desarrollo y maduración del fruto. Finalmente, la capacidad de síntesis de lípidos decrece progresivamente, hasta anularse. El contenido total de aceite en la aceituna permanece constante. Olivos que sufren estrés hídrico al final del verano (ppo otoño) muestran un anormal rendimiento graso, debido a la reducción de la capacidad de síntesis de lípidos que genera el estrés . Fruto y variaciones de peso (agua) ¿Cómo saber cuándo se ha completado la formación de aceite en el fruto? Expresar el rendimiento base materia seca Biosíntesis de Lípidos

33. Cromatograma de ácidos grasos en una muestra de aceite de oliva

34. Aroma del Aceite de Oliva Virgen (A.O.V.) está formado por una compleja mezcla de sustancias volátiles: Aldehidos, Alcoholes, Cetonas, Hidrocarburos, Ésteres Flavor (sabor y olor) Comptos. Volátiles AROMA Comptos. Fenólicos SABOR Off-flavor: aromas desagradables defectos Los volátiles menores pueden caracterizar al A.O. Según: Variedad Grado madurez Sistema de extracción Origen geográfico Biogénesis del Aroma Flavor Aceite Oliva La calidad volátiles A.O.V. es similar, pero la cantidad puede variar según estos factores

35. Variedad: enzimas (responsables generar aromas), dependen características genéticas º madurez: principales volátiles llamados “volátiles verdes” varían según madurez aceituna Sistema extracción: prensa o centrífuga Zona producción: aspectos agronómicos y pedoclimáticos Biogénesis del Aroma

36. Biogénesis del Aroma

37. Biogénesis del Aroma

39. Biogénesis del Aroma

40. Biogénesis del Aroma

41. Biogénesis del Aroma

42. Perfil de compuestos volátiles A.O.V. (calidad) tiene perfil mas simple, cuyos comptos. volátiles provienen de Rutas Bioquímicas responsables flavor A.O. mala calidad tiene perfil mas complejo, con mayor cantidad de comptos. volátiles Biogénesis del Aroma

43. Atrojado Rancio Varietal Coratina Tiempo: 70 min Tiempo: 35 min

44. Génesis de compuestos volátiles Aceituna Los volátiles flavor, provienen de la aceituna Los volátiles son metabolitos directos, producidos en órganos planta, por Rutas Biogénicas Intracelulares Fruto inmaduro sintetiza str  PM ( Lípidos , proteínas, polisacáridos) Maduración fruto (fisiológicos y metabólicos): producción de etileno aumento respiración síntesis proteínas (enz) aumento actividad enzimática aumento permeabilidad membrana Biogénesis del Aroma Influyen en la génesis de volátiles ¿Cómo?

45. Al aumentar actividad y síntesis de enzimas se acumulan metabolitos que son sustratos para la síntesis de volátiles (ácidos grasos, aminoácidos) Maduración fruto rutas catabólicas, generando volátiles Proceso Los volátiles se forman rápidamente durante la ruptura de la estructura celular Se pone en contacto enzimas-sustrato, mas la presencia de O 2 Se llaman Comptos. Volátiles Secundarios o Tecnológicos, responsables del aroma a “verde” del A.O.V. Precursores: ac. grasos: linoleico y linolénico aminoácidos: leucina, valina, isoleucina Biogénesis del Aroma  metabolismo

46. RUTA DE LA LIPOXIGENASA (LOX) Biogénesis del Aroma Lípido complejo (TAG) Acil hidrolasa (lipasa) Ac. graso poliinsaturado (Linolénico) Lipoxigenasa + O 2 Hidroperóxido Hidroperóxido liasa Aldehido Alcohol deshidrogenasa Alcohol Ésteres Alcohol aciltransferasa

47. Aldehido Alcohol Éster

48. Algunos compuestos volátiles generados en ruta LOX Estos 8 compuestos representan entre el 60 - 80% de los volátiles del aceite de oliva (E)-2-hexenal es el compuesto mayoritario (aldehido) Los aldehidos de 6C y sus derivados, son los responsables del aroma “verde” En proceso, la ruta LOX comienza con la MOLIENDA del fruto, y se mantiene activa durante el BATIDO de la pasta Biogénesis del Aroma

49. Los volátiles producidos por esta ruta se incorporan al aceite de oliva El aroma del aceite dependerá de la actividad relativa de las enzimas que componen Ruta LOX, las cuales pueden ser alteradas por las condiciones de extracción Especificidad de LOX por el sustrato: Linolénico > Linoleico Control de proceso: Temperatura Tiempo Algunos estudios: Var. Coratina y Frantoio, tpo: 5-120 min; Tº: 25-30ºC, aumento continuo del total de volátiles (Angerosa et al., 1998) disminución de acetato de 3-hexenilo después de 30 min, por baja actividad alcohol aciltransferasa (Morales et al., 1999) Máxima formación hexanal a 15ºC, rango: 0-30ºC (Salas y Sánchez, 1999) Biogénesis del Aroma Batido pasta regulación de aromas

50. Pigmentos: Clorofila y carotenos, pigmentos responsables del color el aceite Durante maduración frutos, estos pigmentos disminuyen La relación carotenos/clorofila aumenta de manera considerable Evolución del color se usa como índice de madurez (verde - amarillo- negro) Finalmente se acumulan antocianinas (rojo-púrpura) El cambio de color es desde el exterior al interior Clorofila en A.O. : 5 - 24 ppm Carotenos en A.O. : 3,1 - 9,2 mg/kg Composición química

51. Carbohidratos Azúcares > ía son reductores: glucosa, fructosa, sacarosa. Disminuyen durante la maduración del fruto. Importante para el proceso de fermentación de aceitunas de mesa Pectinas: condicionan la textura de la aceituna. El ácido galacturónico disminuye en la cadena péctica, con la maduración del fruto, con esto se disminuye también el índice de textura. Éste se relaciona con el grado de dificultad de la pasta durante la elaboración. Composición química