El documento describe los procedimientos para realizar una electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Se explica cómo preparar el gel de agarosa, cargar las muestras de ADN, realizar la electroforesis y visualizar los resultados. La electroforesis permite separar fragmentos de ADN en función de su tamaño y permite analizar el ADN.
Este documento describe las técnicas de extracción de ácidos nucleicos como el ADN y el ARN. Brevemente explica que el ADN y el ARN son macromoléculas formadas por nucleótidos que contienen la información genética de los seres vivos. Luego resume los principales métodos de extracción como fenol-cloroformo, Chelex, papel FTA, columnas de sílica y salting-out, destacando sus ventajas y desventajas. Finalmente, brinda detalles sobre las muestras, factores que a
Genética molecular de eucariotas, procariotas y virusJoyce Vera Cedeño
El documento trata sobre la expresión de la información genética. Explica que el dogma central de la biología molecular es "un gen, una proteína", pero que en realidad hay más complejidad, como genes que codifican varias proteínas, ARN que no se traducen y participan en regulación, y retrovirus que usan ARN como molde para ADN. También describe las diferencias entre la expresión genética en eucariotas y procariotas.
Este documento proporciona información sobre la técnica de electroforesis. Explica que la electroforesis es una técnica separativa que usa un campo eléctrico para mover partículas cargadas a través de un gel. Luego describe diferentes tipos de electroforesis como la electroforesis de zona, isoelectroenfoque y capilar. También cubre componentes del equipo electroforético, parámetros que afectan la movilidad, tipos de soporte como gel de agarosa, y aplicaciones como el análisis de proteínas, á
Este documento describe un protocolo para la extracción de ADN de sangre periférica utilizando el método CTAB. El protocolo implica la lisis celular y nuclear, precipitación de proteínas y ADN, y posterior purificación e hidratación del ADN aislado. El objetivo era extraer ADN de una muestra de sangre y comprender el proceso de aislamiento de ácidos nucleicos. Al aplicar el método, se observó la transformación del pellet y la obtención final de ADN en forma de grumos blanquecinos.
El documento describe los pasos para la extracción de ácidos nucleicos como ADN y ARN. Incluye las etapas de lisis celular mediante buffer y SDS, degradación proteica con enzimas proteasas, separación de fases con fenol-cloroformo, y purificación del ADN a través de precipitación con etanol y centrifugación. Finalmente, menciona la electroforesis como técnica para analizar los ácidos nucleicos extraídos.
Este documento describe tres tipos de medios de cultivo comúnmente usados en microbiología: agar sangre, agar de tripsicasa de soja y glucosa saboraud con cloranfenicol. El agar sangre contiene sangre ovina y se usa para ver la capacidad hemolítica de microorganismos. El agar de tripsicasa de soja apoya el crecimiento de bacterias semi-exigentes. La glucosa saboraud con cloranfenicol es para el aislamiento y cultivo de hongos, levaduras y dermatofitos.
El documento describe el corpúsculo de Barr, una estructura de cromatina condensada que se encuentra en el núcleo de las células femeninas. El corpúsculo de Barr se forma a partir de la condensación de uno de los cromosomas X inactivado. La hipótesis de Mary Lyon explica que en las células somáticas femeninas, uno de los dos cromosomas X se inactiva al azar para compensar la dosis génica entre machos y hembras. La inactivación de un cromosoma X asegura que amb
Este documento describe el proceso de precipitación de proteínas en la sangre mediante el método de "salting out". Se utiliza sulfato de amonio en dos concentraciones distintas (30% y 70% de saturación) para precipitar e insolubilizar las proteínas de la sangre sin desnaturalizarlas. El proceso implica la extracción de sangre, separación del plasma y los componentes celulares, y la adición gradual de sulfato de amonio al plasma y la hemoglobina para inducir la precipitación de las proteínas.
Este documento describe las técnicas de extracción de ácidos nucleicos como el ADN y el ARN. Brevemente explica que el ADN y el ARN son macromoléculas formadas por nucleótidos que contienen la información genética de los seres vivos. Luego resume los principales métodos de extracción como fenol-cloroformo, Chelex, papel FTA, columnas de sílica y salting-out, destacando sus ventajas y desventajas. Finalmente, brinda detalles sobre las muestras, factores que a
Genética molecular de eucariotas, procariotas y virusJoyce Vera Cedeño
El documento trata sobre la expresión de la información genética. Explica que el dogma central de la biología molecular es "un gen, una proteína", pero que en realidad hay más complejidad, como genes que codifican varias proteínas, ARN que no se traducen y participan en regulación, y retrovirus que usan ARN como molde para ADN. También describe las diferencias entre la expresión genética en eucariotas y procariotas.
Este documento proporciona información sobre la técnica de electroforesis. Explica que la electroforesis es una técnica separativa que usa un campo eléctrico para mover partículas cargadas a través de un gel. Luego describe diferentes tipos de electroforesis como la electroforesis de zona, isoelectroenfoque y capilar. También cubre componentes del equipo electroforético, parámetros que afectan la movilidad, tipos de soporte como gel de agarosa, y aplicaciones como el análisis de proteínas, á
Este documento describe un protocolo para la extracción de ADN de sangre periférica utilizando el método CTAB. El protocolo implica la lisis celular y nuclear, precipitación de proteínas y ADN, y posterior purificación e hidratación del ADN aislado. El objetivo era extraer ADN de una muestra de sangre y comprender el proceso de aislamiento de ácidos nucleicos. Al aplicar el método, se observó la transformación del pellet y la obtención final de ADN en forma de grumos blanquecinos.
El documento describe los pasos para la extracción de ácidos nucleicos como ADN y ARN. Incluye las etapas de lisis celular mediante buffer y SDS, degradación proteica con enzimas proteasas, separación de fases con fenol-cloroformo, y purificación del ADN a través de precipitación con etanol y centrifugación. Finalmente, menciona la electroforesis como técnica para analizar los ácidos nucleicos extraídos.
Este documento describe tres tipos de medios de cultivo comúnmente usados en microbiología: agar sangre, agar de tripsicasa de soja y glucosa saboraud con cloranfenicol. El agar sangre contiene sangre ovina y se usa para ver la capacidad hemolítica de microorganismos. El agar de tripsicasa de soja apoya el crecimiento de bacterias semi-exigentes. La glucosa saboraud con cloranfenicol es para el aislamiento y cultivo de hongos, levaduras y dermatofitos.
El documento describe el corpúsculo de Barr, una estructura de cromatina condensada que se encuentra en el núcleo de las células femeninas. El corpúsculo de Barr se forma a partir de la condensación de uno de los cromosomas X inactivado. La hipótesis de Mary Lyon explica que en las células somáticas femeninas, uno de los dos cromosomas X se inactiva al azar para compensar la dosis génica entre machos y hembras. La inactivación de un cromosoma X asegura que amb
Este documento describe el proceso de precipitación de proteínas en la sangre mediante el método de "salting out". Se utiliza sulfato de amonio en dos concentraciones distintas (30% y 70% de saturación) para precipitar e insolubilizar las proteínas de la sangre sin desnaturalizarlas. El proceso implica la extracción de sangre, separación del plasma y los componentes celulares, y la adición gradual de sulfato de amonio al plasma y la hemoglobina para inducir la precipitación de las proteínas.
El documento describe los pasos para la extracción y purificación de ADN, incluyendo la preparación de la muestra, la lisis celular, la remoción de contaminantes, y la purificación final del ADN. Explica que el método de extracción debe seleccionarse en función del tipo de muestra, la cantidad y calidad de ADN requerida, y la presencia potencial de inhibidores. El ADN extraído debe evaluarse para confirmar la cantidad y calidad obtenida.
María Ángeles Baridon: Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicosBiocientificaSA
Presentación de María de los Ángeles Baridon: "Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos" en el Curso Básico y Taller de PCR en Tiempo Real. HIGA Rossi La Plata, 22 y 23 de Noviembre, 2012.
Organiza: Laboratorio de Virología y Biología Molecular
H.I.G.A. R. Rossi - La Plata.
Auspicia: Servicio de Docencia e Investigación - HIGA Rossi La Plata y Comunidad Vita - Biocientífica S.A.
La electroforesis separa y analiza moléculas como proteínas y ácidos nucleicos en función de su movilidad cuando se aplica un campo eléctrico, dependiendo de su carga eléctrica. Existen dos tipos principales: la electroforesis libre, donde las moléculas se mueven en disolución con poca resolución, y la electroforesis de zona, donde un soporte retiene las moléculas ofreciendo un alto poder de resolución. La electroforesis de proteínas se realiza comúnmente en geles de acrilamida
ADN es la abreviatura del ácido desoxirribonucleico (en inglés, DNA). Constituye el material genético de los organismos. Es el componente químico primario de los cromosomas y el material del que los genes están formados.
El documento describe diferentes métodos para la extracción de ADN, ARN y proteínas. Explica brevemente la historia de la extracción de estas biomoléculas y los métodos convencionales como la extracción con tiocianato de guanidina-fenol-cloroformo y la extracción alcalina. También cubre métodos más especializados como la extracción CTAB y la centrifugación en gradiente de densidad. En general, el documento ofrece una introducción a los principales métodos para aislar y purificar ácidos nucleicos y proteínas de material biol
3.1 Fundamento de la tinción de Feulgen.
La tinción de Feulgen es una técnica de tinción descubierta por Robert Feulgen y usada en histología para teñir selectivamente el material cromosómico o ADN en células. Depende de la hidrólisis ácida del ADN.
Esta técnica consiste en la hidrolización del DNA mediante una dilución débil de ácido clorhídrico que libera las bases púricas, quedando libres los radicales aldehídos de las pentosas, y en la coloración con leucofuscina, que pone de manifiesto los grupos aldehído.
El fundamento de este método se basa en la identificación altamente específica de ácidos nucleicos del ADN a partir del reconocimiento de los grupos aldehídos de la pentosa (azúcar). Para esto se realizan 2 pasos fundamentales:
1) Hidrólisis ácida:
Se utiliza para romper los puentes de hidrogeno que unen a la doble hélice, mediante la desnaturalización de la cadena. Para esto se utiliza ácido clorhídrico (HCl), que es el componente reactivo más crítico del método, controlando la concentración del ácido, temperatura y tiempo, que depende del tipo de tejido (compactación de cromatina) y fijador empleado.
Durante la hidrólisis ácida suave la mayor parte del RNA se divide en sustancias solubles y se pierde del tejido, sin ser removidos los grupos ribosil debido a la presencia de un grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa, por lo que, este material no reacción posteriormente con el reactivo de Schiff. Mientras tanto el DNA es parcialmente hidrolizado siendo removidas y liberadas las bases púricas (A y G) de los residuos de deoxiribosa (depurinización) formando ácido apurínico y generando grupos aldehído (CHO) en el C1 de la pentosa, donde se encontraba unida la base nitrogenada.
Este es un paso crítico por lo que hay que tener en cuenta las variables de tiempo de exposición a la hidrólisis acida, pH ([ H+]) al que se lleve a cabo la reacción, temperatura, el fijador utilizado en el tejido y el grado de compactación de la cromatina que depende de la naturaleza del tejido.
2) Tinción con Reactivo de Schiff:
Los grupos aldehídos liberados por la hidrólisis de Feulgen son teñidos con reactivo de Schiff. Cualquier grupo aldehído libre endógeno y preexistente producido por el fijador (ej. glutaraldehído), tejido elástico inmaduro o algunos lípidos son removidos tratando el tejido con boro hidrato de sodio antes de ser teñido. (Ortiz, 2019)
3.2 Describir y explicar la Técnica completa.
Opcionalmente, la muestra se puede contrateñir con Light Green SF amarillento. Finalmente, se deshidrata con etanol, se aclara con xileno y se monta en un medio resinoso. (Perez)
3.3 Características de las muestras que podemos teñir con esta técnica.
Solamente el método de Feulgen puede considerarse estequiométrico en donde es posible observar una intensidad de coloración proporcional a la concentración de DNA, por lo que es posible determinar cuantitativamente el DNA presente en el núcleo de las células, lo que se aplica en patología
Este documento proporciona una introducción a la electroforesis. Define la electroforesis como la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico. Explica que las partículas migran hacia el cátodo o ánodo dependiendo de su carga, peso molecular y estructura. También resume los diferentes tipos de electroforesis como la electroforesis de límite móvil, zonal e isoelectroenfoque. Además, describe los diferentes medios de electroforesis como el papel, gel, capilar y otros. Finalmente, ident
Este documento describe las ventajas y aplicaciones de la PCR en tiempo real. Permite la detección y cuantificación de ADN o ARN en cada ciclo de reacción a través del uso de reporteros fluorescentes. Esto ofrece una mayor sensibilidad y especificidad en comparación con la PCR estándar. La PCR en tiempo real se ha convertido en una herramienta importante para aplicaciones de diagnóstico clínico, investigación biomédica y estudios de expresión génica.
El documento explica cómo diferenciar bacterias Gram positivas de Gram negativas a través de la tinción de Gram. El procedimiento involucra extender la muestra, fijarla, teñirla con cristal violeta y lugol, decolorarla con alcohol, y contrateñirla con safranina para que las bacterias Gram positivas se vean violetas y las Gram negativas se vean rosadas bajo el microscopio.
Este documento describe diferentes técnicas de siembra para cultivar microorganismos en un laboratorio de microbiología. Describe métodos como la siembra en placa, que incluye técnicas de siembra en superficie y en profundidad, y métodos para contar colonias como el recuento estándar en placa. También explica técnicas de recuento celular como el recuento microscópico directo y el uso de sistemas electrónicos. Finalmente, detalla procedimientos específicos como siembras en tubos, técn
Radioinmunoensayo, ELISA y Western BlotBryan Priego
A continuación, te proporciono información detallada sobre los tipos de ELISA, inmunoensayo y Western Blot, incluyendo los pasos a seguir, la técnica, el fundamento, los materiales, la historia y las aplicaciones. Espero que esta explicación te ayude a comprender mejor cómo se llevan a cabo estas técnicas y para qué se utilizan. Si tienes alguna duda, no dudes en preguntar, estaré encantado de ayudarte.
El ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) es una técnica de ensayo inmunológico ampliamente utilizada para detectar y cuantificar la presencia de una sustancia específica, como un antígeno o un anticuerpo, en una muestra biológica. Existen diferentes tipos de ELISA, incluyendo el competitivo, directo, indirecto y sándwich.
En el ELISA competitivo, el antígeno de interés compite con un antígeno marcado previamente conocido por su unión a un anticuerpo. La cantidad de antígeno presente en la muestra se determina midiendo la cantidad de antígeno marcado que se une al anticuerpo.
En el ELISA directo, el antígeno de interés se une directamente a una superficie sólida (como un pozo de una placa de microtitulación) y se detecta utilizando un anticuerpo marcado que se une específicamente al antígeno.
En el ELISA indirecto, se utilizan dos anticuerpos: uno primario, que se une específicamente al antígeno, y otro secundario, marcado con una enzima, que se une al anticuerpo primario. La enzima proporciona una señal detectable para cuantificar la presencia del antígeno.
En el ELISA sándwich, se utilizan dos anticuerpos: uno de captura, que se une al antígeno, y otro de detección, que se une a otra región del antígeno. El antígeno se "sándwicha" entre los dos anticuerpos, lo que permite una alta sensibilidad en la detección.
El inmunoensayo es una técnica general que utiliza anticuerpos para detectar y cuantificar antígenos o anticuerpos específicos. El ELISA es un ejemplo de inmunoensayo, pero también existen otras técnicas, como el radioinmunoensayo (RIA), que utiliza isotopos radiactivos, y los inmunoensayos enzimáticos basados en enzimas para la detección.
El Western Blot, también conocido como inmunotransferencia, es una técnica utilizada para detectar proteínas específicas en una muestra. Consiste en separar las proteínas de la muestra mediante electroforesis en gel, transferirlas a una membrana y luego incubar la membrana con anticuerpos específicos para las proteínas de interés. Los anticuerpos marcados permiten la detección de las proteínas mediante reacciones enzimáticas o quimioluminiscencia.
Twitter.com/@bryanpriegop
Este documento describe la técnica de electroforesis de ADN. Explica que la electroforesis permite separar fragmentos de ADN en función de su tamaño mediante la aplicación de un campo eléctrico a través de un gel. También describe los diferentes tipos de geles que se pueden usar como agarosa o poliacrilamida, así como técnicas avanzadas como la electroforesis de campo pulsado que permite separar moléculas de ADN muy grandes.
Calibraciones, formas de calculo y materialesWilfredo Gochez
El proceso de la calibracion en Quimica Clinica es uno de los pasos mas criticos que define la calidad de los resultados en las pruebas.
Sin embargo en la literatura tradicional se encuentra muy poco material que explique de forma clara, precisa y facil como realizarlo de manera que los principiantes en esta materia comprendan de manera practica y teorica en que consiste la calibracion de las pruebas. Ademas la automatizacion de los analisis en quimica clinica han dotado a los laboratorios de modernos equipos de Quimica clinica, con caracteristicas modernas y de vanguardia, pero que aun necesitan de los criterios que el profesional en laboratorio clinic debera considerer para poder validar las calibraciones del equipo.
Este documento describe un método de extracción de ADN llamado salting-out. El método utiliza reactivos de baja toxicidad para lisar las células, lavar el pellet celular y precipitar el ADN genómico con alcohol isopropílico, permitiendo visualizar la hebra de ADN. El protocolo consta de 14 pasos que incluyen lisis celular, lavado del pellet, tratamiento con proteasa K y precipitación del ADN con sal y alcohol.
Microbiologia, Bacteriologia. Tipos de tinciones.Tinción negativaIsa Mtz.
La tinción negativa es una técnica que utiliza colorantes neutros o ácidos que no se unen a las bacterias, permitiendo observar su morfología y estructuras como las cápsulas. Se aplica tinta china o nigrosina para contrastar las cápsulas, ya que no se tiñen. Esto permite determinar la virulencia de microorganismos como Klebsiella y Cryptococcus al mostrar la presencia de cápsulas.
El agar hierro de Kligler se utiliza para diferenciar enterobacterias mediante la fermentación de lactosa y glucosa y la producción de ácido sulfhídrico. Esto se observa por el cambio de color del medio de rojo a amarillo. La fermentación de glucosa sólo se observa en el fondo del tubo, mientras que la fermentación de lactosa cambia el color en toda la superficie y fondo.
La PCR es un método para amplificar segmentos específicos de ADN. Se realiza haciendo múltiples copias de un segmento de ADN mediante la repetición de ciclos de calentamiento y enfriamiento. Cada ciclo duplica la cantidad de ADN, permitiendo la producción de billones de copias de una secuencia de ADN en pocas horas. La PCR fue inventada en 1984 y se ha convertido en una herramienta fundamental de la biología molecular con amplias aplicaciones.
Este documento describe las herramientas moleculares utilizadas en ingeniería genética, incluyendo enzimas de restricción, sistemas de modificación-restricción y plásmidos. Explica cómo las enzimas de restricción cortan el ADN en secuencias específicas y cómo los sistemas de modificación-restricción protegen el ADN bacteriano. También resume los tipos de plásmidos, su clasificación, replicación y aplicaciones como vehículos de clonación.
El documento describe un método para aislar bacterias mediante la técnica de siembra por agotamiento en cajas de Petri. Se tomó una muestra de aire y se cultivó en agar nutritivo y McConkey para identificar si contenía bacterias Gram positivas o Gram negativas. Solo hubo crecimiento en el agar nutritivo, indicando la presencia de bacterias Gram positivas o Gram negativas en la muestra de aire. La técnica permitió aislar algunas colonias para su posterior estudio y caracterización.
El documento describe dos métodos de electroforesis, en papel y en gel, que se usan para separar biomoléculas aplicando una corriente eléctrica. La electroforesis en papel separa sustancias de bajo peso molecular como aminoácidos y péptidos, mientras que la electroforesis en gel se basa en el tamaño, forma e isoelectrico de las moléculas y se usa para separar ácidos nucleicos y proteínas desnaturalizadas. Ambos métodos permiten la migración diferencial de las moléculas hacia los electrodos op
La práctica describe el uso de la electroforesis en gel para separar fragmentos de ADN o ARN basándose en su tamaño. Se explican los materiales, métodos y protocolo para preparar un gel de agarosa al 1% y realizar la electroforesis. Los resultados muestran la formación del gel y la separación de moléculas a través de la formación de bandas, aunque estas no pudieron observarse sin luz UV. La conclusión es que la electroforesis permite determinar el tamaño de los fragmentos obtenidos por PCR.
Este documento presenta una introducción a la electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE), un método para separar grandes fragmentos de ADN. Explica que la PFGE aplica campos eléctricos alternantes de diferentes orientaciones para forzar la reorientación periódica de los fragmentos de ADN y lograr su separación según su tamaño. También describe los componentes del equipo necesario para realizar una PFGE y los pasos para preparar las muestras de ADN de gran tamaño que se analizarán.
El documento describe los pasos para la extracción y purificación de ADN, incluyendo la preparación de la muestra, la lisis celular, la remoción de contaminantes, y la purificación final del ADN. Explica que el método de extracción debe seleccionarse en función del tipo de muestra, la cantidad y calidad de ADN requerida, y la presencia potencial de inhibidores. El ADN extraído debe evaluarse para confirmar la cantidad y calidad obtenida.
María Ángeles Baridon: Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicosBiocientificaSA
Presentación de María de los Ángeles Baridon: "Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos" en el Curso Básico y Taller de PCR en Tiempo Real. HIGA Rossi La Plata, 22 y 23 de Noviembre, 2012.
Organiza: Laboratorio de Virología y Biología Molecular
H.I.G.A. R. Rossi - La Plata.
Auspicia: Servicio de Docencia e Investigación - HIGA Rossi La Plata y Comunidad Vita - Biocientífica S.A.
La electroforesis separa y analiza moléculas como proteínas y ácidos nucleicos en función de su movilidad cuando se aplica un campo eléctrico, dependiendo de su carga eléctrica. Existen dos tipos principales: la electroforesis libre, donde las moléculas se mueven en disolución con poca resolución, y la electroforesis de zona, donde un soporte retiene las moléculas ofreciendo un alto poder de resolución. La electroforesis de proteínas se realiza comúnmente en geles de acrilamida
ADN es la abreviatura del ácido desoxirribonucleico (en inglés, DNA). Constituye el material genético de los organismos. Es el componente químico primario de los cromosomas y el material del que los genes están formados.
El documento describe diferentes métodos para la extracción de ADN, ARN y proteínas. Explica brevemente la historia de la extracción de estas biomoléculas y los métodos convencionales como la extracción con tiocianato de guanidina-fenol-cloroformo y la extracción alcalina. También cubre métodos más especializados como la extracción CTAB y la centrifugación en gradiente de densidad. En general, el documento ofrece una introducción a los principales métodos para aislar y purificar ácidos nucleicos y proteínas de material biol
3.1 Fundamento de la tinción de Feulgen.
La tinción de Feulgen es una técnica de tinción descubierta por Robert Feulgen y usada en histología para teñir selectivamente el material cromosómico o ADN en células. Depende de la hidrólisis ácida del ADN.
Esta técnica consiste en la hidrolización del DNA mediante una dilución débil de ácido clorhídrico que libera las bases púricas, quedando libres los radicales aldehídos de las pentosas, y en la coloración con leucofuscina, que pone de manifiesto los grupos aldehído.
El fundamento de este método se basa en la identificación altamente específica de ácidos nucleicos del ADN a partir del reconocimiento de los grupos aldehídos de la pentosa (azúcar). Para esto se realizan 2 pasos fundamentales:
1) Hidrólisis ácida:
Se utiliza para romper los puentes de hidrogeno que unen a la doble hélice, mediante la desnaturalización de la cadena. Para esto se utiliza ácido clorhídrico (HCl), que es el componente reactivo más crítico del método, controlando la concentración del ácido, temperatura y tiempo, que depende del tipo de tejido (compactación de cromatina) y fijador empleado.
Durante la hidrólisis ácida suave la mayor parte del RNA se divide en sustancias solubles y se pierde del tejido, sin ser removidos los grupos ribosil debido a la presencia de un grupo hidroxilo en la posición 2' de la ribosa, por lo que, este material no reacción posteriormente con el reactivo de Schiff. Mientras tanto el DNA es parcialmente hidrolizado siendo removidas y liberadas las bases púricas (A y G) de los residuos de deoxiribosa (depurinización) formando ácido apurínico y generando grupos aldehído (CHO) en el C1 de la pentosa, donde se encontraba unida la base nitrogenada.
Este es un paso crítico por lo que hay que tener en cuenta las variables de tiempo de exposición a la hidrólisis acida, pH ([ H+]) al que se lleve a cabo la reacción, temperatura, el fijador utilizado en el tejido y el grado de compactación de la cromatina que depende de la naturaleza del tejido.
2) Tinción con Reactivo de Schiff:
Los grupos aldehídos liberados por la hidrólisis de Feulgen son teñidos con reactivo de Schiff. Cualquier grupo aldehído libre endógeno y preexistente producido por el fijador (ej. glutaraldehído), tejido elástico inmaduro o algunos lípidos son removidos tratando el tejido con boro hidrato de sodio antes de ser teñido. (Ortiz, 2019)
3.2 Describir y explicar la Técnica completa.
Opcionalmente, la muestra se puede contrateñir con Light Green SF amarillento. Finalmente, se deshidrata con etanol, se aclara con xileno y se monta en un medio resinoso. (Perez)
3.3 Características de las muestras que podemos teñir con esta técnica.
Solamente el método de Feulgen puede considerarse estequiométrico en donde es posible observar una intensidad de coloración proporcional a la concentración de DNA, por lo que es posible determinar cuantitativamente el DNA presente en el núcleo de las células, lo que se aplica en patología
Este documento proporciona una introducción a la electroforesis. Define la electroforesis como la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico. Explica que las partículas migran hacia el cátodo o ánodo dependiendo de su carga, peso molecular y estructura. También resume los diferentes tipos de electroforesis como la electroforesis de límite móvil, zonal e isoelectroenfoque. Además, describe los diferentes medios de electroforesis como el papel, gel, capilar y otros. Finalmente, ident
Este documento describe las ventajas y aplicaciones de la PCR en tiempo real. Permite la detección y cuantificación de ADN o ARN en cada ciclo de reacción a través del uso de reporteros fluorescentes. Esto ofrece una mayor sensibilidad y especificidad en comparación con la PCR estándar. La PCR en tiempo real se ha convertido en una herramienta importante para aplicaciones de diagnóstico clínico, investigación biomédica y estudios de expresión génica.
El documento explica cómo diferenciar bacterias Gram positivas de Gram negativas a través de la tinción de Gram. El procedimiento involucra extender la muestra, fijarla, teñirla con cristal violeta y lugol, decolorarla con alcohol, y contrateñirla con safranina para que las bacterias Gram positivas se vean violetas y las Gram negativas se vean rosadas bajo el microscopio.
Este documento describe diferentes técnicas de siembra para cultivar microorganismos en un laboratorio de microbiología. Describe métodos como la siembra en placa, que incluye técnicas de siembra en superficie y en profundidad, y métodos para contar colonias como el recuento estándar en placa. También explica técnicas de recuento celular como el recuento microscópico directo y el uso de sistemas electrónicos. Finalmente, detalla procedimientos específicos como siembras en tubos, técn
Radioinmunoensayo, ELISA y Western BlotBryan Priego
A continuación, te proporciono información detallada sobre los tipos de ELISA, inmunoensayo y Western Blot, incluyendo los pasos a seguir, la técnica, el fundamento, los materiales, la historia y las aplicaciones. Espero que esta explicación te ayude a comprender mejor cómo se llevan a cabo estas técnicas y para qué se utilizan. Si tienes alguna duda, no dudes en preguntar, estaré encantado de ayudarte.
El ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) es una técnica de ensayo inmunológico ampliamente utilizada para detectar y cuantificar la presencia de una sustancia específica, como un antígeno o un anticuerpo, en una muestra biológica. Existen diferentes tipos de ELISA, incluyendo el competitivo, directo, indirecto y sándwich.
En el ELISA competitivo, el antígeno de interés compite con un antígeno marcado previamente conocido por su unión a un anticuerpo. La cantidad de antígeno presente en la muestra se determina midiendo la cantidad de antígeno marcado que se une al anticuerpo.
En el ELISA directo, el antígeno de interés se une directamente a una superficie sólida (como un pozo de una placa de microtitulación) y se detecta utilizando un anticuerpo marcado que se une específicamente al antígeno.
En el ELISA indirecto, se utilizan dos anticuerpos: uno primario, que se une específicamente al antígeno, y otro secundario, marcado con una enzima, que se une al anticuerpo primario. La enzima proporciona una señal detectable para cuantificar la presencia del antígeno.
En el ELISA sándwich, se utilizan dos anticuerpos: uno de captura, que se une al antígeno, y otro de detección, que se une a otra región del antígeno. El antígeno se "sándwicha" entre los dos anticuerpos, lo que permite una alta sensibilidad en la detección.
El inmunoensayo es una técnica general que utiliza anticuerpos para detectar y cuantificar antígenos o anticuerpos específicos. El ELISA es un ejemplo de inmunoensayo, pero también existen otras técnicas, como el radioinmunoensayo (RIA), que utiliza isotopos radiactivos, y los inmunoensayos enzimáticos basados en enzimas para la detección.
El Western Blot, también conocido como inmunotransferencia, es una técnica utilizada para detectar proteínas específicas en una muestra. Consiste en separar las proteínas de la muestra mediante electroforesis en gel, transferirlas a una membrana y luego incubar la membrana con anticuerpos específicos para las proteínas de interés. Los anticuerpos marcados permiten la detección de las proteínas mediante reacciones enzimáticas o quimioluminiscencia.
Twitter.com/@bryanpriegop
Este documento describe la técnica de electroforesis de ADN. Explica que la electroforesis permite separar fragmentos de ADN en función de su tamaño mediante la aplicación de un campo eléctrico a través de un gel. También describe los diferentes tipos de geles que se pueden usar como agarosa o poliacrilamida, así como técnicas avanzadas como la electroforesis de campo pulsado que permite separar moléculas de ADN muy grandes.
Calibraciones, formas de calculo y materialesWilfredo Gochez
El proceso de la calibracion en Quimica Clinica es uno de los pasos mas criticos que define la calidad de los resultados en las pruebas.
Sin embargo en la literatura tradicional se encuentra muy poco material que explique de forma clara, precisa y facil como realizarlo de manera que los principiantes en esta materia comprendan de manera practica y teorica en que consiste la calibracion de las pruebas. Ademas la automatizacion de los analisis en quimica clinica han dotado a los laboratorios de modernos equipos de Quimica clinica, con caracteristicas modernas y de vanguardia, pero que aun necesitan de los criterios que el profesional en laboratorio clinic debera considerer para poder validar las calibraciones del equipo.
Este documento describe un método de extracción de ADN llamado salting-out. El método utiliza reactivos de baja toxicidad para lisar las células, lavar el pellet celular y precipitar el ADN genómico con alcohol isopropílico, permitiendo visualizar la hebra de ADN. El protocolo consta de 14 pasos que incluyen lisis celular, lavado del pellet, tratamiento con proteasa K y precipitación del ADN con sal y alcohol.
Microbiologia, Bacteriologia. Tipos de tinciones.Tinción negativaIsa Mtz.
La tinción negativa es una técnica que utiliza colorantes neutros o ácidos que no se unen a las bacterias, permitiendo observar su morfología y estructuras como las cápsulas. Se aplica tinta china o nigrosina para contrastar las cápsulas, ya que no se tiñen. Esto permite determinar la virulencia de microorganismos como Klebsiella y Cryptococcus al mostrar la presencia de cápsulas.
El agar hierro de Kligler se utiliza para diferenciar enterobacterias mediante la fermentación de lactosa y glucosa y la producción de ácido sulfhídrico. Esto se observa por el cambio de color del medio de rojo a amarillo. La fermentación de glucosa sólo se observa en el fondo del tubo, mientras que la fermentación de lactosa cambia el color en toda la superficie y fondo.
La PCR es un método para amplificar segmentos específicos de ADN. Se realiza haciendo múltiples copias de un segmento de ADN mediante la repetición de ciclos de calentamiento y enfriamiento. Cada ciclo duplica la cantidad de ADN, permitiendo la producción de billones de copias de una secuencia de ADN en pocas horas. La PCR fue inventada en 1984 y se ha convertido en una herramienta fundamental de la biología molecular con amplias aplicaciones.
Este documento describe las herramientas moleculares utilizadas en ingeniería genética, incluyendo enzimas de restricción, sistemas de modificación-restricción y plásmidos. Explica cómo las enzimas de restricción cortan el ADN en secuencias específicas y cómo los sistemas de modificación-restricción protegen el ADN bacteriano. También resume los tipos de plásmidos, su clasificación, replicación y aplicaciones como vehículos de clonación.
El documento describe un método para aislar bacterias mediante la técnica de siembra por agotamiento en cajas de Petri. Se tomó una muestra de aire y se cultivó en agar nutritivo y McConkey para identificar si contenía bacterias Gram positivas o Gram negativas. Solo hubo crecimiento en el agar nutritivo, indicando la presencia de bacterias Gram positivas o Gram negativas en la muestra de aire. La técnica permitió aislar algunas colonias para su posterior estudio y caracterización.
El documento describe dos métodos de electroforesis, en papel y en gel, que se usan para separar biomoléculas aplicando una corriente eléctrica. La electroforesis en papel separa sustancias de bajo peso molecular como aminoácidos y péptidos, mientras que la electroforesis en gel se basa en el tamaño, forma e isoelectrico de las moléculas y se usa para separar ácidos nucleicos y proteínas desnaturalizadas. Ambos métodos permiten la migración diferencial de las moléculas hacia los electrodos op
La práctica describe el uso de la electroforesis en gel para separar fragmentos de ADN o ARN basándose en su tamaño. Se explican los materiales, métodos y protocolo para preparar un gel de agarosa al 1% y realizar la electroforesis. Los resultados muestran la formación del gel y la separación de moléculas a través de la formación de bandas, aunque estas no pudieron observarse sin luz UV. La conclusión es que la electroforesis permite determinar el tamaño de los fragmentos obtenidos por PCR.
Este documento presenta una introducción a la electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE), un método para separar grandes fragmentos de ADN. Explica que la PFGE aplica campos eléctricos alternantes de diferentes orientaciones para forzar la reorientación periódica de los fragmentos de ADN y lograr su separación según su tamaño. También describe los componentes del equipo necesario para realizar una PFGE y los pasos para preparar las muestras de ADN de gran tamaño que se analizarán.
El documento describe un protocolo para extraer ADN de muestras vegetales y animales utilizando tres pasos: trituración de la muestra con detergente y sal, adición de una enzima proteolítica para romper las células, y precipitación del ADN con alcohol. El ADN extraído puede observarse como material pegajoso flotando en la capa de alcohol.
Este documento describe la técnica de electroforesis, la cual permite separar mezclas complejas de biomoléculas como ácidos nucleicos, proteínas y otras, basándose en su carga eléctrica, peso molecular y estructura. Explica que las partículas se mueven a través de un gel bajo la influencia de un campo eléctrico, y que su velocidad y dirección de migración depende de estos factores. También resume los diferentes tipos de electroforesis y los reactivos empleados, así como cómo se interpretan
Este documento lista el número cromosómico de 30 vegetales comunes como la cebolla con 16 cromosomas, el tomate con 24 y la patata con 48. También indica que el helecho Ophioglussum recitulatum tiene el mayor número de cromosomas con 1260. Además, provee ejemplos de números cromosómicos de plantas diploides como el arvejilla con 14 y poliploides como el trigo pan con 42 cromosomas. Finalmente, menciona que cultivos como la papa, banana y alfalfa son polip
Este documento describe el proceso de extracción de ADN a partir de tejido animal (hígado de pollo). Se explican los pasos de trituración del tejido, filtración, adición de agentes desnaturalizantes y precipitación del ADN con alcohol. Finalmente, se obtuvieron hebras blancas de ADN puro. Adicionalmente, se discuten los conceptos teóricos sobre la estructura y características del ADN que permiten su extracción y purificación.
La electroforesis es una técnica para separar moléculas basadas en su movilidad en un campo eléctrico. Existen diferentes tipos como la electroforesis en gel, en acetato de celulosa y libre. Para un paciente que necesita determinar la cantidad de lipoproteínas como el colesterol LDL, se aplicaría la electroforesis de proteínas séricas en gel, la cual mide proteínas específicas en la sangre.
Este documento describe la electroforesis, un método para separar moléculas cargadas usando un campo eléctrico. Explica que las moléculas se mueven a diferentes velocidades dependiendo de su carga y tamaño, lo que permite separar mezclas complejas. También resume los diferentes tipos de electroforesis como la electroforesis en gel, en papel y bidimensional, así como los parámetros que afectan la movilidad de las moléculas.
Este documento describe el proceso de electroforesis y sus fundamentos. La electroforesis permite separar biomoléculas como proteínas y ácidos nucleicos mediante la aplicación de un campo eléctrico. Existen varios tipos de electroforesis que difieren en el medio de separación utilizado y los factores que influyen en la velocidad de migración, como la carga, tamaño y estructura de las moléculas. La electroforesis es una técnica ampliamente utilizada en análisis genético y bioquímico.
La electroforesis es una técnica que separa partículas aprovechando su traslado mediante la aplicación de campos eléctricos. Existen dos tipos principales: la electroforesis de frente móvil y la electroforesis de zona. La electroforesis de zona obliga a las muestras a desplazarse sobre un soporte sólido como el papel o el gel, separando las moléculas en bandas discretas. La electroforesis en papel se utiliza para separar proteínas séricas en fracciones como la albúmina y las glob
Este documento trata sobre electroquímica y la doble capa eléctrica. Explica conceptos fundamentales como soluciones de electrolitos, ácidos y bases. Luego describe procesos de transporte en electrolitos y el equilibrio de transferencia de carga en sistemas electroquímicos heterogéneos. Finalmente, se enfoca en la doble capa eléctrica, explicando las teorías de Helmholtz, Gouy-Chapman y Stern, y los métodos para estudiarla, como los fenómenos electrocinéticos.
La electroforesis es una técnica de separación de moléculas cargadas mediante la aplicación de un campo eléctrico. Se desarrolló inicialmente en el siglo XIX y fue mejorada por Tiselius en la década de 1930, lo que le valió el Premio Nobel. Existen dos tipos principales: electroforesis de frente móvil, donde las moléculas migran libremente, y electroforesis de zona, donde se usa un soporte sólido. Factores como la carga, tamaño y estructura de las moléculas determinan su
La práctica tuvo como objetivos estudiar la ecuación de Nernst aplicada a una celda galvánica Zn/Zn+2//Cu+2/Cu a diferentes concentraciones y la ley de Faraday para la electrolisis del agua. Se midieron los voltajes de la celda galvánica y se calcularon las actividades iónicas. Luego, se electrolizó una solución acuosa de NaOH y se midió la masa de H2 producida, calculando el error con respecto a la ley de Faraday.
Este documento presenta un trabajo sobre el cálculo numérico de la movilidad electroforética de partículas coloidales en soluciones de electrolitos débiles. Explica que la electroforesis es una técnica para separar moléculas según su movilidad en un campo eléctrico. Luego describe cómo se desarrolló una teoría numérica para considerar valores arbitrarios de la constante de disociación-recombinación del equilibrio para partículas coloidales en soluciones de electrolitos débiles. Finalmente, concluye
La electroforesis es una técnica que separa moléculas como ácidos nucleicos, proteínas y otras biomoléculas según su carga y masa en un campo eléctrico. Se usa comúnmente para determinar el peso molecular, punto isoeléctrico y estructura de proteínas. La técnica aprovecha que las moléculas se mueven a través de un gel o matriz en respuesta a un voltaje aplicado, dependiendo de su carga neta, peso molecular y estructura. Esto permite separar mezclas complejas de biom
Este documento introduce los métodos electroanalíticos, explicando que son menos utilizados que otros métodos analíticos debido a un menor conocimiento y menor automatización. Además, ofrecen ventajas como mayor especificidad y proporcionar información sobre actividad en lugar de concentración. Describe las reacciones electroquímicas y los procesos farádicos y no farádicos que ocurren en los electrodos. Finalmente, explica las etapas de un proceso electrodíco, incluyendo la transferencia de masa, reacciones químicas
1. El documento describe la estructura y propiedades del átomo, incluyendo que está compuesto por un núcleo central rodeado por electrones.
2. Explica que el número de protones determina el elemento químico, mientras que el número de neutrones determina el isótopo. También describe las diferentes teorías históricas sobre la estructura atómica.
3. Finalmente, resume la evolución del modelo atómico a través de la historia, desde el modelo inicial de Dalton hasta los modelos modernos desarrollados en el siglo XX.
La electroforesis es una técnica para separar moléculas según su movilidad en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, separándolas por tamaño molecular y carga eléctrica. Se describen varias técnicas de electroforesis capilar como la electroforesis capilar en zona o en disolución libre (CZE), la electroforesis capilar electrocinética micelar (MEKC) y la electroforesis capilar en gel (CGE). También se menciona la electroforesis de partículas para separar partícul
La electroforesis es una técnica desarrollada por Arne Tiselius en 1937 para separar proteínas aplicando un campo eléctrico. Las moléculas se separan según su movilidad en el campo eléctrico debido a su carga y tamaño. Actualmente, la electroforesis en gel es la variante más común, usando geles de agarosa o poliacrilamida para fraccionar mezclas de proteínas y ácidos nucleicos.
1) El documento describe los semiconductores, materiales cuya conductividad eléctrica depende de factores como la temperatura o la presencia de impurezas. 2) Explica que los semiconductores más comunes como el silicio y el germanio tienen una estructura cristalina de diamante, donde los átomos comparten electrones de valencia para formar enlaces covalentes. 3) A temperaturas elevadas, la vibración térmica rompe algunos enlaces, liberando electrones y "huecos" que pueden conducir electric
Este documento describe una práctica de laboratorio sobre electroquímica. La práctica involucra el uso de una celda electrolítica para depositar níquel en electrodos de cobre a través de reacciones de oxidación y reducción. El documento explica los conceptos teóricos de electroquímica relevantes y detalla los materiales, procedimientos y observaciones de tres partes experimentales para lograr el electrodepósito bajo diferentes condiciones.
Este documento presenta los objetivos, marco teórico, materiales, procedimiento y cuestionario de una práctica de laboratorio sobre electroquímica. La práctica busca aplicar conocimientos de electroquímica para obtener un electrodepósito mediante la aplicación de corriente eléctrica a una solución electrolítica. El marco teórico explica conceptos clave como reacciones redox, tipos de electrodos, procesos controlados por transferencia de masa o carga. El procedimiento describe tres partes para depositar cobre
El documento describe diferentes técnicas de electroforesis capilar, incluyendo la electroforesis capilar en zona, isotacofóresis, electroforesis capilar en geles y cromatografía electrocinética micelar. Explica los fundamentos básicos de la electroforesis capilar como la movilidad electroforética y el flujo electroosmótico, así como los componentes básicos de un sistema de electroforesis capilar como la fuente de alto voltaje, la introducción de muestra y los sistemas de detección.
Este documento describe los principios fundamentales de la electroforesis capilar. En resumen: (1) La electroforesis capilar es una técnica de separación que se basa en las diferentes velocidades de migración de especies cargadas a través de un capilar al que se aplica un campo eléctrico; (2) El flujo electroosmótico mueve todas las especies a través del capilar hacia el detector, permitiendo la detección de cationes, aniones y especies neutras; (3) La alta eficacia de la electroforesis capilar, con
1) La conductividad eléctrica depende de la estructura atómica y molecular del material, y mide la capacidad de un material para conducir la corriente eléctrica. 2) Los metales son buenos conductores debido a que tienen una estructura con electrones débilmente unidos que pueden moverse libremente. 3) La conductividad en sólidos se debe al movimiento de electrones, mientras que en líquidos depende de la presencia de iones que transportan la corriente eléctrica.
La conductividad eléctrica depende de la estructura atómica y molecular del material. Los metales son buenos conductores debido a que tienen una estructura con muchos electrones con vínculos débiles que permiten su movimiento, mientras que los aislantes son malos conductores. La conductividad también depende de factores como la temperatura y de si el material es un sólido, líquido o gas.
Similar a Electroforesis de Acidos Nucleicos en Geles de Agarosa - Genetica UNAH (20)
El documento describe el albinismo, una condición genética hereditaria caracterizada por la ausencia de pigmentación en la piel, el cabello y los ojos. Existen diferentes tipos de albinismo que varían según la afectación de la piel y el defecto enzimático involucrado. El albinismo se debe a defectos genéticos que impiden la producción o distribución de melanina. No tiene cura, pero el tratamiento se enfoca en proteger la piel y los ojos del sol.
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Electroforesis de Acidos Nucleicos en Geles de Agarosa - Genetica UNAH
1. LABORATORIO DE GENETICA
1
INTRODUCCION
Electroforesis De Ácidos Nucleicos En Geles De Agarosa
“Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida”, la electroforesis es el movimiento de
partículas cargadas en un campo eléctrico. A diferencia de las proteínas, las cuales pueden
tener una carga positiva o negativa, los ácidos nucleicos están cargados de forma negativa
debido a su esqueleto de grupos fosfato. Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos
nucleicos migrarán hacia el polo positivo, es decir, el ánodo. Además de la poliacrilamida, la
agarosa puede ser utilizada como soporte para la corrida electroforética. La agarosa es un
polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado
sólido a temperatura ambiente pero que a altas temperaturas se torna líquida. Esta
característica permite una fácil preparación de una matriz porosa para ser usada en
electroforesis: simplemente se pesa la cantidad de agarosa requerida, se disuelve en un
amortiguador adecuado, se calienta y se “chorrea” sobre un molde particular. Una ventaja
que posee la agarosa sobre la acrilamida es que no es un compuesto tóxico y además
permite el análisis de ácidos nucleicos con pesos moleculares muy variados. Sin embargo,
su poder de resolución es menor que el de los geles de poliacrilamida. La concentración de
agarosa típicamente utilizada para electroforesis está entre el 0.5 % y el 2%. La
concentración a usar se escoge según el tamaño del ácido nucleico a analizar. Esto porque
la concentración de agarosa define el tamaño de los poros de la matriz, a mayor
concentración, menor el tamaño de los poros y viceversa. Durante la electroforesis, los
ácidos nucleicos lineales con un alto peso molecular migrarán al ánodo más lentamente que
ácidos nucleicos lineales con un menor peso molecular. La razón de esto es que los ácidos
nucleicos de alto peso tardan más tiempo en atravesar los poros de agarosa. En el caso de
ácidos nucleicos no linealizados, como plásmidos circulares en conformación nativa, la
migración no solo dependerá del peso molecular sino también de otros aspectos como el
grado de superenrrollamiento que ésteposeea. Generalmente en una preparación de
plásmido se pueden observar distintas conformaciones de la misma molécula, la forma
superenrrollada, la forma semirelajada y una relajada. Dependiendo de las condiciones
externas como pH y salinidad se pueden observar todas las formas o solo una (s).
2. LABORATORIO DE GENETICA
2
MARCO TEORICO
Electroforesis De Ácidos Nucleicos En Geles Agarosa
La electroforesis en gel es un método que se emplea para separar macromoléculas en
función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. El término electroforesis
describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico.
«Electro» se refiere a la electricidad y «foresis», del griego phoros, significa «trasladar». Así
pues, la electroforesis en gel es una técnica consistente en aplicar corriente eléctrica a las
moléculas para que atraviesen una placa de gel. La fuerza motriz de la electroforesis es la
tensión eléctrica aplicada a los electrodos en ambos extremos del gel. Las propiedades de
una molécula determinan la velocidad con que un campo eléctrico puede desplazarla a
través de un medio gelatinoso. Muchas macromoléculas biológicas importantes (por ejemplo,
los aminoácidos, los péptidos, las proteínas, los nucleótidos y los ácidos nucleicos) poseen
grupos ionizables y, a un pH determinado, existen en solución como especies cargadas
eléctricamente, sean cationes (+) o aniones (-). Según la naturaleza de la carga neta, las
partículas cargadas migrarán hacia el cátodo o hacia el ánodo. Así, por ejemplo, cuando se
aplica un campo eléctrico a un gel con pH neutro, los grupos fosfato del ADN cargados
negativamente lo harán migrar hacia el ánodo (Westermeier, 1997).
La electroforesis en gel de agarosa es un método normalizado que se utiliza para separar,
identificar y purificar fragmentos de ADN. Se trata de una técnica sencilla y rápida que
permite diferenciar fragmentos de ADN que no pueden separarse adecuadamente con otros
procedimientos. Por otra parte, el ADN puede localizarse en el gel tiñendo con una
concentración baja de bromuro de etidio, que es un agente intercalante fluorescente que se
utiliza como colorante. En las siguientes secciones se presentan los principios físicos, los
componentes (matriz de gel, tampón, tampón de carga y marcador) y los procedimientos
para preparar la electroforesis en gel de agarosa (Sambrook et al., 1989).
a electroforesis en gel es una técnica que se emplea para separar los ácidos nucleicos y las
proteínas. La separación de las macromoléculas depende de dos variables: carga y masa.
Cuando una muestra biológica, como por ejemplo el ADN, se mezcla en una solución
tampón y se aplica a un gel, esas dos variables actúan conjuntamente. La corriente eléctrica
de un electrodo repélele las moléculas, al tiempo que el otro electrodo las atrae. La fuerza de
fricción del material de gel actúa como «tamiz molecular», separando las moléculas en
función de su tamaño. Durante la electroforesis, las macromoléculas son empujadas a través
de los poros,
de pendiendo su tasa de migración por el campo eléctrico de los siguientes factores:
•fuerza del campo
•tamaño y forma de las moléculas
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•hidrofobicidad relativa de las muestras
•fuerza iónica y temperatura del tampón en que se desplazan las moléculas.
Para tener una idea cabal del proceso de separación de las partículas cargadas en la
electroforesis en gel, conviene tener presentes las simples ecuaciones referidas a esta
técnica. Cuando se aplica tensión a los electrodos se genera un gradiente de potencial (E),
que puede expresarse con la siguiente ecuación:
E = V/d donde V, medida en voltios, es la tensión aplicada y de la distancia en cm entre los
electrodos. Al aplicarse el gradiente de potencial (E) se genera una fuerza (F) en una
molécula cargada, que puede expresarse con la siguiente ecuación: F = Eq donde q
corresponde a la carga en culombios que lleva la molécula. Esta es la fuerza, medida en
Newton, que empuja la molécula cargada hacia el electrodo. Existe asimismo una resistencia
de fricción que ralentiza el desplazamiento de las moléculas cargadas. Esta fuerza de
fricción es función de los siguientes factores:
•tamaño hidrodinámico de la molécula
•forma de la molécula
•tamaño de poro del medio en que tiene lugar la electroforesis
•viscosidad del tampón.
La velocidad v de una molécula cargada en un campo eléctrico depende del
gradiente de potencial, la carga y la fuerza de fricción de la molécula, y puede expresarse
con la siguiente ecuación: v = Eq / f donde f es el coeficiente de fricción. La movilidad
electroforética (M) de un ión puede entonces determinarse dividiendo la velocidad del ión por
el gradiente de potencial:
M = v / E Además, de la ecuación se infiere que la movilidad electroforética M expresarse
de modo equivalente como la carga de la molécula (q) dividida por el coeficiente de fricción
(f): M = q / f Cuando se aplica una diferencia de potencial, las moléculas que poseen
distintas cargas globales comenzarán a separarse debido a sus diferentes movilidades
electroforéticas. La movilidad electroforética es un parámetro significativo y característico de
las moléculas o partículas cargadas y depende del valor de pK del grupo cargado y del
tamaño de la molécula o partícula. Incluso las moléculas con cargas semejantes empezarán
a separarse si sus tamaños moleculares son distintos por cuanto estarán sometidas a
fuerzas de fricción diferentes. El ADN bicatenario lineal migra por las matrices de gel a
velocidades inversamente proporcionales al log10del número de pares de bases. Las
moléculas más grandes migran más despacio debido a la mayor resistencia de fricción y a la
menor eficacia del desplazamiento a través de los poros del gel. La corriente que atraviesa
la solución entre los electrodos es conducida principalmente por los iones del tampón, si bien
una pequeña proporción lo es por los iones de la muestra. La relación entre intensidad I,
tensión V y resistencia R se expresa según la ley de Ohm: R = V / I .Esta ecuación muestra
que, para una resistencia R dada, es posible acelerar la separación electroforética
aumentando la tensión V aplicada, lo cual dará lugar al correspondiente incremento de la
intensidad de la corriente I. La distancia migrada será proporcional a la intensidad y al
tiempo. Con todo, el aumento de tensión (V)y el incremento correspondiente de intensidad
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(I) ocasionaría uno de los principales problemas que plantea la mayor parte de las formas de
electroforesis, a saber, la generación de calor. Este fenómeno queda ilustrado con la
siguiente ecuación, en la que la potencia (W, medida en vatios) generada durante la
electroforesis equivale al producto de la resistencia multiplicado por el cuadrado de la
intensidad: W = I2R
Dado que la mayor parte de la potencia producida en el proceso electroforético se disipa en
forma de calor, pueden producirse los siguientes efectos perjudiciales:
•aumento de la tasa de difusión de los iones de la muestra y del tampón, con el consiguiente
ensanchamiento de las muestras separadas
•formación de corrientes de convección, con la consiguiente mezcla de las
muestras separadas.
•inestabilidad térmica de las muestras, que son bastante sensibles al calor (por ejemplo,
desnaturalización del ADN)
•disminución de la viscosidad del tampón y, por ende, reducción de la resistencia del medio.
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1. Tape los extremos de la bandeja con cinta aislante, colóquela en una superficie plana
y horizontal.
2. Prepare suficiente tampón TBE 0.5x (150 ml) para llenar el tanque electroforético.
Asegúrese que sea el mismo utilizado para preparar el gel.
3. Lleve la agarosa a ebullición; dejar enfriar a 60 °C; agregar el bromuro de etidio
(concentración final de 0.5 µg/ml), mezcle bien.
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4. Colocar el peine de 0.5 – 1.0 mm arriba del fondo de la bandeja y vierta la agarosa.
Dejar solidificar a temperatura ambiente. El gel debe tener de 3 a 5 mm de grosor.
5. Una vez solidificado retire la cinta aislante, sumergir el gel en el tanque electroforético
y retirar el peine.
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6. Agregue suficiente tampón TBE 0.5x para cubrir el gel aproximadamente 1mm.
7. Prepare la muestra de ADN a analizar agregándoles el buffer de cargada.
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8. Utilizando una micropipeta, aplique despacio en cada uno de los diferentes pocillos
del gel sumergido 10 µl de las muestras preparadas. En los extremos colocar los
marcadores de peso molecular y de concentración.
9. Tape el tanque electroforético y colocar los electrodos de manera que el ADN migre
hacia el ánodo (terminal roja). Aplique un voltaje de 1 – 5 v/cm. Para los minigeles se
aplican 100V por 30 minutos. El azul de bromofenol en la solución de cargada marca
el frente de la electroforesis.
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10. Desconecte la fuente de tención. Saque el gel de la bandeja y obsérvelo con el
transiluminador de UV. Use gafas protectoras. Fotografié el gel.
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DATOS
Investigue otros protocolos de electroforesis
Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida. Análisis de proteínas
de hojas de Arabidopsisthaliana.
PROTOCOLO A REALIZAR
Preparación del gel de poliacrilamida
En la presente práctica se van a preparar mini-geles de 0,75 mm de espesor. Las cantidades
indicadas para la preparación de las soluciones en el anexo corresponden a la preparación
de dos geles. Cada uno de ellos consta de un gel concentrador de aproximadamente 2 cm
de longitud que contiene los pocillos para cargar las muestras, y un gel separador de
aproximadamente 6 cm. En la figura 4, se ilustra el montaje del sistema de electroforesis, la
preparación de los geles y el procedimiento a seguir.
1. Se prepara el sistema de electroforesis mini-gel.
2. Preparación del gel separador al 13%.
3. Se mezcla en un matraz (capacidad aproximada de 100 mL) los componentes con
cuidado, utilizando una pipeta Pasteur, se añade la mezcla en el interior del molde
hasta una altura aproximada de 2 cm del borde superior de la placa mayor, de forma
que quede suficiente espacio para el gel concentrador (se debe calcular 1 cm más de
la longitud de los pocillos del peine)A continuación, usando una pipeta limpia, se
cubre la superficie del gel con isobutanol, isopropanol o agua destilada. Esto previene
el contacto del oxígeno con el gel que inhibe la reacción de polimerización. La
polimerización del gel debe de ocurrir en unos 30 minutos.
4. Preparación del gel concentrador al 3%.Se elimina el alcohol que cubre el gel
separador, y se lava la parte superior del gel 2-3 veces con agua destilada para
eliminar cualquier residuo de acrilamida no polimerizada. Se seca el líquido restante
en la parte de superior del gel con papel de filtro con cuidado de no dañar el gel.
Preparación de las muestras
En el tiempo de espera durante la polimerización se preparan las muestras que se van a
cargar en el gel. Con ayuda de una micropipeta P-20 se toman 20 µl de extracto proteico de
Arabidopsis preparado en tampón de carga (ver anexo) en un tubo eppendorf.
No se olvide preparar un tubo eppendorf con las proteínas estándar de peso molecular
conocido. Se fijan las tapas de los tubos y se calientan en un termobloque a 100ºC durante 5
minutos. Se centrifugan 15 segundos a máxima velocidad para concentrar el volumen en el
fondo del tubo.
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Electroforesis
1. Se insertan las placas con los geles polimerizados en la unidad de electroforesis Se
prepara el tampón de electroforesis a partir de la solución concentrada (ver anexo) y
se añade en los reservorios interior y exterior. Se retiran, si las hubiera, las burbujas
de aire y restos de acrilamida del interior de los pocillos, introduciendo tampón de
electroforesis en los mismos.3
2. Se aplican las muestras con ayuda de una micropipeta P-20 (hasta 20 µl) en los
pocillos, en un orden predeterminado y previamente. No se olvide añadir, en un carril,
la solución de proteínas estándar, de peso molecular conocido.
3. Se conectan los electrodos a la cubeta de electroforesis y a la fuente de alimentación
y se aplica corriente eléctrica. La corriente eléctrica recomendada para geles de 0,75
mm de grosor es un voltaje constante de 100-200V.
4. La duración aproximada del proceso es de 40-45 minutos. Una vez acabada la
electroforesis, cuando el frente de azul de bromofenol alcanza la parte inferior del gel,
se desconecta la fuente de alimentación, retirándose los electrodos y sacando los
geles de la cubeta de electroforesis. Estos se depositan en la mesa de trabajo.
5. Se sacan los geles de acrilamida del interior del molde, separando cuidadosamente
con ayuda de una espátula ambos cristales Se elimina el gel concentrador y se hace
una muesca al gel en una de las esquinas para orientar la posición de las muestras
(por ejemplo en la esquina inferior contraria al patrón de proteínas).
6. Tinción del gel con azul de coomassie
Las bandas de proteínas, una vez terminada la electroforesis, se visualizan tiñendo
los geles con una solución de azul de coomasie. La tinción se realiza con agitación
suave durante, al menos, 30 min.7.
7. Se trasfiere el gel de la placa de vidrio a un recipiente que contiene la solución de
tinción de coomassie. Se deja el gel en agitación suave con suficiente volumen de
esta solución a temperatura ambiente durante 1 hora.
8. Se elimina la solución de tinción con una pipeta y se conserva para futuras tinciones.
9. Se añade solución decolorante y se incuba en agitación para eliminar el exceso de
coloración hasta que sólo queden teñidas de azul las proteínas, cambiando la
solución decolorante tantas veces como sea necesario. El gel puede estar en esta
solución toda la noche pero se pueden empezar a observar las proteínas en 20
minutos.
10. Se elimina la solución de desteñido y se añade agua destilada (o acético al 10%). Los
geles pueden conservarse de esta forma durante largos periodos de tiempo de forma
casi indefinida a 4ºC.
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¿Qué otras aplicaciones puede tener la electroforesis?
Las enormes aplicaciones de electroforesis son más evidentes en la industria de la salud o
médica, incluyendo los antibióticos y el análisis de la vacuna. El análisis de las proteínas y
ADN son también importantes aplicaciones de la electroforesis. Aparte de permitir a los
investigadores localizar y ver las diferencias en el código genético de las especies en la
tierra, el análisis de ADN electroforético también proporciona una herramienta fiable en
investigaciones forenses.
Explique la función del gel de agarosa en la electroforesis
La electroforesis en gel es una técnica que se emplea para separar los ácidos nucleicos y
las proteínas. La separación de las macromoléculas depende de dos variables: carga y
masa. Cuando una muestra biológica, como por ejemplo el ADN, se mezcla en una solución
tampón y se aplica a un gel, esas dos variables actúan conjuntamente
.La agarosa, coloide natural que se extrae de las algas, es un polisacárido lineal (con un
peso molecular medio de ~12 000 Da) formado por la repetición de la unidad básica, la
agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa. La
agarosa es muy frágil y las manipulaciones pueden destruirla con facilidad. Los geles de
agarosa poseen grandes «poros» y se emplean fundamentalmente para separar las
moléculas grandes con un peso molecular de más de 200 kD. Los geles de agarosa
permiten una electroforesis rápida, pero con una resolución limitada por cuanto las bandas
que se forman en los geles tienen tendencia a ser difusas y a esparcirse. Ello obedece al
tamaño de los poros y no puede controlarse. Los geles de agarosa se obtienen por
suspensión de agarosa seca en polvo en un tampón acuoso, tras lo cual se hace hervir la
mezcla hasta que la agarosa se funde y se convierte en una solución transparente. A
continuación, se vierte esta solución en un molde para gel y se deja enfriar a temperatura
ambiente hasta que se forma un gel rígido. Al endurecerse, la agarosa forma una matriz
cuya densidad viene determinada por su concentración.
¿Para qué se utiliza la solución tampón TBE?
El TBE se utilizaba inicialmente a una concentración de trabajo de 1x en el caso de la
electroforesis en gel de agarosa. No obstante, una solución de trabajo de 0,5x proporciona
un poder más que suficiente y en la actualidad prácticamente toda las electroforesis en gel
de agarosa se practican utilizando esta concentración.
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BIBLIOGRAFIA
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n5.pdf
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Rabanales.
Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida. Análisis de proteínas de
hojas de Arabidopsisthaliana.
http://www.uco.es/dptos/bioquimicabiolmol/pdfs/16%20ELECTROFORESIS%20GELE
S%20PAA.pdf.
http://www.ehowenespanol.com/lista-aplicaciones-electroforesis-sobre_117270/