Este documento describe varias técnicas histoquímicas y enzimohistoquímicas utilizadas para identificar sustancias a nivel celular y tisular. Explica técnicas para hidratos de carbono como PAS, azul alcián y azul de toluidina; para proteínas como rojo Congo y Fontana-Masson; y para grasas como Oil Red O y Sudán. También cubre técnicas para colágeno, ácidos nucleicos y otros componentes, proporcionando detalles sobre sus protocolos y usos diagnósticos.

1. PROCESAMIENTO
CITOLÓGICO Y TISULAR
TEMA 5
Aplicación de técnicas
histoquímicas y
enzimohistoquímicas

2. 1. Técnicas de tinción
histoquímicas
• La histoquímica se define como: la aplicación de
reacciones químicas sobre tejidos histológicos con el fin
de localizar y determinar ciertas sustancias o su
actividad y microorganismos.
• Se pueden distinguir distintas sustancias químicas que
van a ser la base de reacciones que teñirán de distintos
colores las sustancias a reconocer en el microscopio:
– Hidratos de carbono o glúcidos. Los polisacáridos son
glúcidos formados por la unión de muchas moléculas de
monosacáridos (>10).
– Lípidos o grasas.
– Proteínas.
– Iones y pigmentos.
– Microorganismos.

3. Técnica Tiñe Uso
Azul alcián
Mucina ácida: azul, núcleo: rojo,
citoplasma: rosa
Identificar
mucosustancias
Amarillo alcián Moco: amarillo, bacteria: azul H. Pylori
Azul de toluidina Mastocitos: violeta, fondo :azul Mastocitosis, cistitis
Bodian’s
Fibras nerviosas y neurofibrillas:
negro, núcleo: negro, resto de tejido:
azul
Tumores neurales
Diff-Quick (Giemsa
modificado)
H. Pylori: azul oscuro, otras
bacterias: azul, núcleo: azul oscuro,
citoplasma: rosa
Gastritis crónica
Elásticas (Verhoeff-van
Gieson)
Fibras elásticas: negro azulado,
núcleo: azul a negro, colágeno: rojo
Identificar arterias y
venas, elastofibroma
TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS MÁS HABITUALES

4. Técnica Tiñe Uso
Fontana-Masson
Melanina, gránulos argentafines y
cromafines, lipofuchina: negro;
núcleo: rojo
Melanomas y tumores
neuroendocrinos
Giemsa
Bacterias (H. Pylori): azul, parásitos
(leishmania, Plasmodium): púrpura,
núcleo: azul
Núcleos, bacterias y
parásitos
Gram
Bacterias Gram+: azul y Gram-:
rojo; núcleo: rojo
Bacterias, actinomices,
hongos y amebas
Grimelius
Gránulos argentafines y argirófilos:
marrón oscuro-negro, núcleo:rojo
Tumores
neuroendocrinos
Hematoxilina-eosina Núcleo: azul, citoplasma: rosa Tinción de rutina
Hierro coloidal Hierro: azul, citoplasma: rosado
Biopsias de médula
ósea y carcinoma
cromófobo renal
Mallory, hematoxilina
fosfotúngstica
Glía: azul, núcleo: azul, neuronas:
rojizo, colágeno: rojizo, fibrina: azul,
músculo esquelético: azul
Lesiones neurales y de
músculo esquelético

5. Técnica Tiñe Uso
Mucicarmín Mucina: rojizo, núcleo: negro
Adenocarcinomas,
criptococos
Oil red, Sudán Grasa: rojo, núcleo: azul Grasa o tejido adiposo
PAS
Mucopolisacáridos, mucinas,
membranas basales, coloide y
hongos: rojo
Múltiples
PAS-diastasa
El glucógeno (mucopolisacárido
simple) desaparece
Detecta
mucopolisacáridos
neutros
Plata metenamina
Hongos y neumocistis: negro,
tejido: verdoso
Infeccioso
Reticulina (Gomori,
Gordon-Sweet)
Reticulina: negro, colágeno tipo I:
marrón, tipos III y IV: negro
Médula ósea e hígado
(fibrosis)
Tricrómico de Masson
Colágeno tipo I: azul oscuro, tipos
III y IV: azul claro. Mucina: verde o
azul, núcleo: negro, queratina y
músculo liso: rojo
Hígado, riñón, …

6. Técnica Tiñe Uso
Von Kossa Calcio: negro, tejido: rojo Calcio, malacoplaquia
Warthin-Starry
Espiroquetas: negro,
bacilos: negro, tejidos:
amarillento a marrón
claro
Infeccioso
Wrights
Gránulos eosinofílicos:
rosa, neutrófilicos:
púrpura, citoplasma y
linfocitos: azul
Sangre
Ziehl-Neelsen
Bacilos ácido-alcohol
resistentes (TBC):rojo,
tejido: azul
Micobacterias

7. 2. Tipos de tinciones histoquímicas
• 2.1. Reacciones histoquímicas para hidratos de
carbono.
Se basan en la demostración de grupos carbonilo (un átomo de C con
doble enlace a uno de O) formados sobre los hidratos de carbono por
oxidación previa.
Las más importantes son: la técnica de PAS, la del azul alcián, la del azul
de toluidina, la del azul alcián-PAS y otros.
– 2.1.2. Técnica de PAS (ácido peryódico de Schiff).
Es la más utilizada. Consiste en oxidar los tejidos mediante el ácido
peryódico (HIO4) para incrementar el número de grupos carbonilo (aldehído
o cetona) presentes en ellos, de forma que puedan ser mostrados
posteriormente. El material PAS positivo se ve rojo oscuro o magenta.
Detecta polisacáridos simples (glucosa, celulosa) y complejos (neutros,
mucoproteínas). Son negativos los mucopolisacáridos ácidos que no
pueden ser oxidados por el ácido peryódico.
Se usa para ver moco o sustancias mucinosas, membranas basales y
muchos hongos y parásitos. La variante PAS-digestión con diastasa sirve
para distinguir si el material PAS positivo es glucógeno, en cuyo caso
desaparece con la diastasa.
La técnica de PAS se utiliza, por ejemplo, en el diagnóstico de tumores con
glucógeno, como el sarcoma de Ewing, rabdomiosarcoma (tumor maligno
de músculo estriado) o tumores renales, enfermedades de glomérulos de
riñón, adenocarcinomas poco diferenciados o infecciones por hongos.

8. Corte histológico
mostrando gastro-
esófago de Barrett
con células
caliciformes. PAS
40x
Corte histológico
mostrando gastro-
esófago de Barrett
con células
caliciformes. H-E
40x

9. Candidiasis mostrada con la tinción de PAS

10. – 2.1.2. Azul alcián.
Técnica para determinar mucopolisacáridos
ácidos. El pH debe estar en torno a 2,4-2,6 y
los mucopolisacáridos ácidos (carboxilos y
sulfatos) se tiñen de azul. Si se usa un pH
inferior a 1 ó 0,5 sólo se tiñen de azul los
mucopolisacáridos ácidos sulfatados.
Las soluciones empleadas en esta técnica
son estables durante dos semanas,
aproximadamente y hay que filtrarlas antes
de usarlas.

11. Corte histológico de esófago teñido con azul alcián. Células caliciformes en
azul y células columnares en color claro.

12. Metaplasia pilórica en la mucosa. Azul alcián 100x.

13. – 2.1.3. Azul de toluidina.
Es la técnica de metacromasia más habitual. Indica un
cambio de color cuando un colorante puro tiñe una
estructura tisular de color diferente al de la solución
diluida. Las estructuras responsables de este cambio se
llaman cromotropas y pueden ser mucopolisacáridos
ácidos, ácidos nucleicos, lípidos de carácter ácido y
partículas de sílice. Las sustancias con carácter
metacromático se verán de color rojo y el resto se verá en
azul. La reacción metacromática presenta grandes
variaciones ante pequeñas modificaciones del medio
donde se produce.
Los baños en alcohol etílico inhiben la metacromasia, por
lo que deben realizarse preparaciones testigo.
Protocolo:
•Desparafinar e hidratar.
•Teñir con azul de toluidina, 2-5 min.
•Lavar en solución tamponada.
•Tratar los cortes en la solución de molibdato, 10 min.
•Lavar con agua.
•Deshidratar, aclarar y montar.

14. Corte histológico de carcinoma cromofóbico de células renales.
Tinción de azul de toluidina.

15. – 2.1.4. Técnica del azul alcián-PAS.
Sirve para diferenciar mucopolisacáridos ácidos,
neutros y glicoproteínas. Se verán los
mucopolisacáridos ácidos de color azul, los
mucopolisacáridos neutros y glicoproteínas de color
rojo o rosa y el resto de color morado (si se usa
hematoxilina).
Técnica del azul alcián-
PAS. Mucocitos
epiteliales de color azul,
Mucopolisacáridos
neutros y glicoproteínas
en rosa. Oreja de mar
haliotis.

16. – 2.1.5. Otros (hierro coloidal, mucicarmín, etc.).
Técnica de mucicarmín.
Biopsia de sinovial. Cápsula
del microorganismo
cryptococcus en rojo, 400x.

17. – 2.1.6. Uso de las diferentes tinciones para
mucopolisacáridos:
• MPS neutros: se pueden encontrar en las glándulas del tracto
gastrointestinal y en la próstata. Son PAS positivos, pero no se
tiñen con azul alcián, hierro coloidal, mucicarmín o colorantes
metacromáticos.
• MPS ácido simple (no sulfatado) epitelial: son las mucinas
típicas de las células epiteliales que contienen ácido siálico. Se
tiñen con PAS, azul alcián a pH 2,5, hierro coloidal y colorantes
metacromáticos. Resisten la digestión hialuronidasa.
• MPS ácido simple, mesenquimal: contienen ácido hialurónico y
se encuentran en el estroma. Son positivos con azul alcián a pH
2,5, hierro coloidal y colorantes metacromáticos y PAS
negativos. Se digieren con ácido hialurónico. Se pueden
encontrar en sarcomas.
• MPS ácido complejo (sulfatado) epitelial: típicos de los
adenocarcinomas. PAS positivos, azul alcián positivo a pH 1,
hierro coloidal, mucicarmín y colorantes metacromáticos
también positivos. Resisten la digestión con hialuronidasa.
• MPS ácido complejo, mesenquimal: se encuentra en estroma,
cartílago y hueso. Son PAS negativos y positivos con azul alcián
a pH 0,5.

18. • 2.2. Histoquímica de grasas, proteínas y
ácidos nucleicos.
A pesar de la pérdida de vigencia de los
métodos histoquímicos desde la aparición de los
inmunohistoquímicos, que permiten caracterizar
genéticamente la mayor parte de las proteínas,
siguen empleándose algunos:
– Rojo Congo: permite detectar la presencia de la
proteína amiloide.
Depósitos amiloides
perivasculares teñidos
con rojo Congo (x400)

19. – Fontana-Masson: para detectar la presencia de
melanina, gránulos argentafines y cromafines o
pigmentos como lipofucsina. Técnica usada para
diagnosticar melanomas y tumores neuroendocrinos.
Hiperpigmentación
cutánea: aumento del
pigmento melánico e
incontinencia pigmenti.
H&E (izquierda) y Fontana-
Masson (derecha).

20. – Grimelius: técnica empleada
antiguamente para diagnosticar
tumores neuroendocrinos,
porque detectaba las proteínas
de los gránulos argentafines y
argirófilos.
– Reticulina: lás técnicas de
reticulina (Gomori, Gordon-
Sweet) sirven para distinguir
diferentes tipos de colágeno,
bien el maduro o tipo I, bien los
inmaduros y los tipos III y IV.
Se tiñen de marrón los
primeros y de negro los últimos
(III y IV). También distinguen en
negro las membranas basales
que tienen colágeno de tipo IV.
Criptococosis renal. Se
distinguen los distintos
tipos de colágeno gracias
a la impregnación
argéntica de Gomori.

21. – Tricrómico de Masson: técnica muy utilizada que
combina distintos colorantes que tiñen de manera
diversa las distintas sutancias: colágeno tipo I de azul
oscuro, tipos III y IV de azul claro; mucina de color
verde o azul; núcleos de negro o violeta; citoplasma
de rosa; queratina, músculo liso y nervios de rojo. Los
usos más habituales son en biopsias de hígado, riñón
o corazón.
Corte histológico de lengua
teñido con la técnica
tricrómica de Masson.

22. – Reacción de Feulgen: en condiciones normales los
ácidos nucleicos se conjugan con proteínas básicas
para formar nucleoproteínas, por ello la realización de
una hidrólisis ácida permite separar el componente
proteico y así poder demostrar la presencia de ácidos
nucleicos. Un ejemplo de las técnicas que permiten
separar el ADN de otras estructuras es la reacción de
Feulgen.

23. – Sudán y Oil Red O: la identificación de grasa, lípidos
o tejido adiposo es importante porque se disuelven
con la mayoría de los fijadores durante el procesado.
Es mejor usar material en congelación y criostato.
Lás técnicas más habituales son Sudán rojo (III y IV)
y negro, y Oil Red O.
Oil Red O stain showing
abundant intracellular lipid in a
renal cell carcinoma .

24. • 2.3. Métodos para la identificación de
pigmentos e iones metálicos.
• 2.3.1. Azul de Perls.
Se utiliza para detectar hierro, tanto en forma iónica, formando sales ferrosas y
férricas, como ligado a proteínas. Sirve para detectar hemosiderina (pigmento de
color amarillo - dorado o pardo y aspecto granuloso o cristalino que deriva de la
hemoglobina cuando hay más hierro del necesario en el cuerpo. Consiste en
agregados micelares de ferritina, cuya función es servir de reservorio de hierro). Se
observa el hierro en azul y los núcleos en rojo.
Esta técnica se utiliza en preparaciones de tejidos, frotis de sangre o frotis de médula
ósea. Habitualmente se encuentran cantidades minúsculas de ácido férrico en la
médula ósea y el bazo. Las cantidades anómalas de hierro pueden indicar
hemocromatosis y hemosiderosis. La identificación de falta de hierro puede indicar
una anemia por deficiencia.

25. Protocolo:
– Desparafinar e hidratar.
– Tratar con la mezcla de ferrocianuro de
potasio al 10% y ácido clorhídrico (10’).
– Lavar con agua destilada (el hierro se ve
azul).
– Se puede contrastar con una solución rojo
nuclear al 1% durante 2-3’.
– Deshidratar, aclarar y montar.
El tiempo de tinción depende de la cantidad
de hierro existente en los tejidos.

26. • 2.3.2. Von Kossa.
Se emplea para detectar sales de Ca, tanto el presente
en condiciones normales en huesos y dientes, como el
que aparece de manera esporádica en diferentes
lesiones o áreas de calcificación en tejidos desprovistos
de ellas. Se observan los iones calcio o calcificación en
negro y los núcleos de las células en rojo.
Protocolo:
Desparafinar e hidratar.
Tratar con la solución de
nitrato de plata al 1% a plena
luz durante 30-60’.
Lavar con agua destilada.
Lavar en solución de
tiosulfato al 2,5% durante 5’.
Lavado en agua destilada.
Contrastar con rojo neutro al
1% durante 2-3’.
Deshidratar, aclarar y montar.
Calcificación de la arteria
aorta en una iguana.

27. • 2.4. Técnicas para microorganismos.
• 2.4.1. Giemsa.
Tinción muy habitual e importante que está formada por varios colorantes:
azul de metileno (colorante metacromático) como tinte básico y eosina
como tinte ácido, que dan una amplia gama de colores. El pH de la solución
de coloración es crítico y se debe ajustar idealmente, según diversos
fijadores, en un rango entre 6,4 y 6,9. Se usa para ver con más detalle los
núcleos y las características de la cromatina, identificar células cebadas o
mastocitos y tinción de bacterias y parásitos. Es especialmente útil para
detectar Helicobacter pylori, rickettsias y protozoos.
Se observa el citoplasma de color rosa, los núcleos azules, los glóbulos
rojos naranja, los gránulos de las células cebadas de color púrpura, las
bacterias azules y los parásitos azules.
Tinción de Giemsa en
biopsia de mucosa gástrica
en la que se observan los
bacilos de Helicobacter
pylori.

28. • 2.4.2. Ziehl Neelsen.
Técnica usada para detectar micobacterias,
sobre todo bacilos ácido-alcohol resistentes,
como el bacilo de Koch, causante de la
tuberculosis.

29. • 2.4.3. Gram.
En el tema anterior ya se estudió esta
técnica que distingue bacterias
grampositivas y gramnegativas, las
primeras las tiñe de azul y las segundas
de rojo.

30. • 2.4.4. Plata metenamina y otras técnicas de
plata.
Técnica usada para detectar hongos y
Pneumocystis, que se ven de color negro.

31. 3. Fundamentos, controles y
aplicaciones de las técnicas de
histoquímica enzimáticas.
La histoquímica enzimática se basa en la
metabolización de un sustrato mediante
enzimas. La visualización se realiza con un
colorante insoluble combinado con la ventaja de
localizar en el microscopio la actividad
enzimática. Prácticamente cualquier enzima
puede ser detectada. Debido al uso de la
inmunohistoquímica y de técnicas de patología
molecular, su uso actualmente se ha reducido
mucho.

32. • 3.1. Fundamentos.
Ejemplos de bases bioquímicas de las
reacciones de histoquímica enzimática:
– Vía deshidrogenasa: consiste en quitar dos
átomos de hidrógeno a los sustratos o los
compuestos, oxidándose y usando el cloruro
de tetrazolio como indicador de esta reacción,
lo que produce un cambio de color. La
lactatodeshidrogenasa o el succinato
deshidrogenasa son fundamentales en el
metabolismo de la célula, en el ciclo de
Krebs.

34. – Vía fosfatasa y esterasa: la reacción enzimática quita grupos
fosfato o naftilo y en este caso el indicador colorimétrico son
sales de diazonio.
En el capítulo de inmunohistoquímica se muestra de qué
manera se utilizan como marcadores enzimas capaces de hacer
cambiar de color un sustrato incoloro. Las enzimas más
frecuentemente utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina.
Estas enzimas hacen cambiar de color los sustratos de
diaminobenzidina (color pardo), aminoetilcarbazol (color rojo) y
nitroazul de tetrazolio (color azul). Pueden usarse a la vez, en
combinación. Esta reacción enzimática puede hacerse
directamente sobre el anticuerpo primario o indirectamente,
mediante anticuerpos secundarios o sustancias como biotina.
Todas las técnicas deben tener controles positivos y negativos.
Habitualmente se incluye un pequeño cilindro de reactividad
conocida en cada porta.

35. 4. Técnicas de tinción para la
determinación de enzimas
• En casi todas las técnicas histoquímicas que se
han venido utilizando para ver las enzimas y
localizarlas en los tejidos, el producto final de la
reacción debe ser insoluble. El resultado de
estas técnicas puede ser visible en función de
tener alguna de las siguientes propiedades:
– Opaco a la luz blanca, luz ultravioleta o haz de
electrones en microscopía electrónica.
– Luminiscencia, tanto fluorescencia como
fosforescencia.
– Incremento del índice refractivo.
– Reflectividad (fracción de radiación incidente reflejada
por una superficie).

36. • 4.1. Manejo de los tejidos.
Casi todas las técnicas se realizan con tejido
congelado, porque la mayoría de las enzimas se
inactivan por fijación con formol. Se recomienda
congelar las muestras en hielo seco (CO2) a -80
ºC o en isopentano en un congelador (-25 ºC),
en un pequeño tubo Eppendorf (biopsias) o
bolsa de plástico (resecciones quirúrgicas).
Es importante el espesor mínimo de sección en
criostato. Es recomendable realizar cortes finos.
En algunas técnicas resulta complicado el uso
de controles o muestras de referencia con una
actividad enzimática conocida o estandarizada,
que suelen estar disponibles comercialmente.

37. • 4.2. Aplicaciones.
– La acetilcolinesterasa es la más comúnmente usada. Es clave
para el diagnóstico de la enfermedad de Hirschprung
(enfermedad congénita en la que faltan células del sistema
nervioso de la pared del colon).
– La fosfatasa alcalina es una enzima importante en la barrera
hematoencefálica, la mucosa dental y el túbulo proximal del
riñón. Una disminución de la actividad enzimática de la fosfatasa
alcalina indica deterioro funcional grave.
– Un aumento de actividad de la fosfatasa alcalina lisosomal es un
marcador temprano de lesiones isquémicas (falta de oxígeno)
de los tejidos.
– La clasificación de enfermedades musculares, miopatías y
distrofias.
– Las reacciones de histoquímica enzimática más frecuentemente
usadas son ATPasa a pH 4,5 y 9,4, deshidrogenasa succínica,
NADH, fosforilasa y citocromo C oxidasa (COX).

39. 5. Histoquímica de las lectinas y
aplicaciones
• Las lectinas son proteínas que se unen a oligosacáridos o carbohidratos de
manera específica y pueden utilizarse como los anticuerpos en
inmunohistoquímica para obtener una reacción colorimétrica. Distintos usos
en la identificación de carbohidratos característicos de distintos tipos de
tejidos como glía, neuronas, epitelios, tejido conectivo, etc., son muy útiles
en histología y patología para identificar distintos tipos de tumores.
• Se pueden clasificar según el ligando (sustancia que forma un complejo con
una biomolécula) que reconocen:
– Glucosa-manosa: por ejemplo, GNA, LCH, ConA.
– Galactosa: por ejemplo, PNA, RCA, VVL.
– N-acetilglucosamina: por ejemplo, WGA.
– N-acetilglucosamina ácida: por ejemplo, SNA, MAL, MAH.
– Fucosa: por ejemplo, UEA (Ulex europeus), AAL.
Los usos podrían agruparse como:
– Marcadores tumorales.
– Quistes odontogénicos.
– Microbiología.
– Serología.
– Inflamación.