MICROARREGLOS DE DNA
BIOLOGIA MOLECULAR
DRA. MA. DE LA LUZ MIRANDA BELTRÁN
Mayra Janeth Hernández González
Octavio Yair Ro...
¿QUE SON LOS MICROARREGLOS?
 Es un conjunto ordenado
de genes en una pequeña
superficie (10,000
muestras por cm2). Los
mi...
SECUENCIACIÓN SISTEMÁTICA DE LOS
GENOMAS
 La secuenciación sistemática de los genomas
completos y los avances en la sínte...
SECUENCIACIÓN SISTEMÁTICA DE LOS
GENOMAS
 Actualmente se pueden
adquirir las colecciones
completas de los genes
de varios...
SECUENCIACIÓN SISTEMÁTICA DE LOS
GENOMAS
Arabidopsis thaliana E. coli.
IMPRESIÓN DE MICROARREGLOS
 En la actualidad existen varios tipos de
impresores para los microarreglos y los
podemos sepa...
IMPRESORES DE CONTACTO
 Son los más económicos; su uso es
relativamente sencillo y no se requiere una gran
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robot la superficie (c) conteniendo la microplaca co...
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IMPRESORES DE CONTACTO
 Los robots impresores de contacto cuentan
con una cabeza en la que se pueden colocar
de 1 a 48 ap...
APLICADORES DE CONTACTO
 Los aplicadores, son
pequeñas agujas con una
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ASPECTOS IMPORTANTES PARA LA IMPRESION
DE LOS MICROARREGLOS
 De la biblioteca genómica que se desea imprimir
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ASPECTOS IMPORTANTES PARA LA IMPRESION
DE LOS MICROARREGLOS
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debe ser fijado a la...
OBTENCION DE RNA
 El aislamiento del RNA para su utilización en
microarreglos, se deben tener en cuenta los
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OBTENCION DE RNA
Fotografía de RNA total de levadura, corrido en un gel
desnaturalizante de agarosa 1%.
MARCADO DE RNA
 Para el marcado del RNA se utiliza la síntesis invitro de
cDNA de cadena sencilla.
 Se coloca el RNA tot...
MARCADORES FLUORECENTES
 dUTP-Cy3
 dUTP-Cy5
 dUTP-alexa3
 dUTP-alexa5
 También se pueden obtener los mismos
fluorófor...
MARCADO DE RNA
Gel de electroforesis en el que se corrieron
RNA total y RNA mensajero, marcados con
los fluoróforos descri...
LECTURA DE MICROARREGLOS
LECTURA DE MICROARREGLOS
En los lectores con
cámaras digitales se
registra la imagen
fluorescente como si
se tomara una
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LECTURA DE MICROARREGLOS
 Lectores confocales hacen la
reconstrucción de la imagen
utilizando los principios de la
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LECTURA DE MICROARREGLOS
 En dos tipos de lectores se utiliza un láser para
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LECTURA DE MICROARREGLOS
LECTURA DE MICROARREGLOS
LECTURA DE MICROARREGLOS
 Para este experimento se marcó la muestra
experimental en rojo y la control en verde, todos
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LECTURA DE MICROARREGLOS
Cámara de hibridización para microarreglos
LECTURA DE MICROARREGLOS
Fluorescencia para un microarreglo hibridizado con una sonda marcada
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LECTURA DE MICROARREGLO
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 Para la obtención de los valores cuantitativos
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CUANTIFICACIÓN DE MICROARREGLOS
CUANTIFICACIÓN DE MICROARREGLOS
 Se debe considerar la aplicación de un
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CUANTIFICACION DE MICROARREGLOS
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CUANTIFICACION DE MICROARREGLOS
 Definidos estos parámetros el programa
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CUANTIFICACION DE MICROARREGLOS
Las primeras cuatro columnas corresponden a las coordenadas de cada gen en el
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CUANTIFICACION DE MICROARREGLOS
EJEMPLO DEL USO DE LOS
MICROARREGLOS DE DNA
 Estudio con microarreglos de cáncer cérvico uterino. De una paciente
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IMAGEN OBTENIDA DE MICROARREGLO
Fragmento del microarreglo hibridizado, en donde vemos la señal de
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TABLA OBTENIDA DE MICROARREGLO
Grafica del logaritmo de la señal “N” eje X contra la señal “C” eje Y. Se
observa que ambas...
CONCLUSIÓN
 Un microarreglo es una distribución ordenada de
genes en una pequeña superficie, y mediante con
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  1. 1. MICROARREGLOS DE DNA BIOLOGIA MOLECULAR DRA. MA. DE LA LUZ MIRANDA BELTRÁN Mayra Janeth Hernández González Octavio Yair Robles Meléndez Fernando Daniel Rosas Reyes UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA CU LAGOS
  2. 2. ¿QUE SON LOS MICROARREGLOS?  Es un conjunto ordenado de genes en una pequeña superficie (10,000 muestras por cm2). Los microarreglos de DNA son una nueva herramienta de la biología molecular y las ciencias genómicas.
  3. 3. SECUENCIACIÓN SISTEMÁTICA DE LOS GENOMAS  La secuenciación sistemática de los genomas completos y los avances en la síntesis artificial de DNA, ya sea por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o la síntesis química de desoxioligonucleotidos, actualmente es posible obtener en el laboratorio el genoma completo de un organismo, generando cada uno de los marcos de lectura abierta completos o fragmentos de cada uno de ellos.
  4. 4. SECUENCIACIÓN SISTEMÁTICA DE LOS GENOMAS  Actualmente se pueden adquirir las colecciones completas de los genes de varios organismos como: Humano, Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisiae y E. coli.
  5. 5. SECUENCIACIÓN SISTEMÁTICA DE LOS GENOMAS Arabidopsis thaliana E. coli.
  6. 6. IMPRESIÓN DE MICROARREGLOS  En la actualidad existen varios tipos de impresores para los microarreglos y los podemos separar en dos clases principales:  Los de contacto  Los piezoeléctricos Estos últimos son tecnologías muy recientes y no abundaremos en ellos
  7. 7. IMPRESORES DE CONTACTO  Son los más económicos; su uso es relativamente sencillo y no se requiere una gran infraestructura para fabricar microarreglos de DNA con estos equipos.  Básicamente se trata de un brazo robótico con movimiento en los ejes X, Y y Z y su característica más importante es, poderse desplazar en cualquiera de estas direcciones con una resolución de una décima de milímetro
  8. 8. Diagrama de un impresor de microarreglos de contacto. En este tipo de robot la superficie (c) conteniendo la microplaca con las muestras (a) y las laminillas (b), se desplaza en las direcciones X y Y, mientras que la cabeza con los aplicadores (d) sube y baja, depositando las muestras , siguiendo el eje Z.
  9. 9. Diagrama de un impresor de microarreglos de contacto. En este tipo de robot la superficie (c) conteniendo la microplaca con las muestras (a) y las laminillas (b) es fija, mientras que la cabeza con los aplicadores (d) es un brazo mecánico con movimiento en las tres direcciones (X, Y y Z).
  10. 10. IMPRESORES DE CONTACTO  Los robots impresores de contacto cuentan con una cabeza en la que se pueden colocar de 1 a 48 aplicadores.
  11. 11. APLICADORES DE CONTACTO  Los aplicadores, son pequeñas agujas con una ranura en la punta similar a la punta de una pluma fuente y al igual que en ésta, la muestra se toma y se deposita por capilaridad. Los aplicadores más comunes tienen una capacidad de 0.25 μl y pueden hacer al menos 100 aplicaciones, es decir 0.0025 μl por aplicación.
  12. 12. ASPECTOS IMPORTANTES PARA LA IMPRESION DE LOS MICROARREGLOS  De la biblioteca genómica que se desea imprimir se debe tener la mayor cantidad de información de cada gen y esta información tiene que estar ordenada en una base de datos;  El DNA que se va a imprimir, debe tener la misma calidad que se requiere cuando se va a secuenciar;  La cantidad de DNA de cada muestra debe ser la misma y en una solución con un contenido especifico de sales.  Controlar la humedad y la temperatura
  13. 13. ASPECTOS IMPORTANTES PARA LA IMPRESION DE LOS MICROARREGLOS  Una vez impresas las laminillas, el DNA debe ser fijado a la superficie. Esto se puede lograr horneando los microarreglos a 80°C por cuatro horas o con un entrecruzador de luz ultravioleta. Adicionalmente se delimita la región donde se encuentra el microarreglo y se identifica cada laminilla, ya sea con un código de barras o un numero se serie.
  14. 14. OBTENCION DE RNA  El aislamiento del RNA para su utilización en microarreglos, se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:  Obtenerlo lo más concentrado posible;  Que la banda ribosomal grande sea al menos dos veces mas que la banda pequeña (este relación nos permite tener una idea de la integridad del mRNA);  Se requieren al menos 30μg de RNA total para realizar un experimento;  No se requiere aislar el RNA mensajero y puede no ser importante la presencia de DNA genómico.
  15. 15. OBTENCION DE RNA Fotografía de RNA total de levadura, corrido en un gel desnaturalizante de agarosa 1%.
  16. 16. MARCADO DE RNA  Para el marcado del RNA se utiliza la síntesis invitro de cDNA de cadena sencilla.  Se coloca el RNA total junto con un deoxioligonucleótido poli T y un conjunto de hexámeros al azar, permitiendo que reconozcan sus sitios en el RNA mensajero.  Posteriormente se agregan los deoxinucleótidos A, C, G y T, mas una proporción de deoxinucleótido T marcado con una molécula fluorescente.  A la mezcla se agrega transcriptasa inversa que sintetiza el cDNA a partir del mRNA, incorporando el deoxinucleótido T marcado en dos reacciones estándar.  Finalmente el cDNA marcado se purifica para eliminar el deoxinucleótido fluorescente no incorporado al cDNA y se tiene la sonda marcada, lista para probarla en un microarreglo.
  17. 17. MARCADORES FLUORECENTES  dUTP-Cy3  dUTP-Cy5  dUTP-alexa3  dUTP-alexa5  También se pueden obtener los mismos fluoróforos unidos a dCTP)
  18. 18. MARCADO DE RNA Gel de electroforesis en el que se corrieron RNA total y RNA mensajero, marcados con los fluoróforos descritos. Sondas marcadas con los fluoróforos Cy3 rojo y Cy5 verde, corridas en un gel desnaturalizante de poliacrilamida de 12.5%.
  19. 19. LECTURA DE MICROARREGLOS
  20. 20. LECTURA DE MICROARREGLOS En los lectores con cámaras digitales se registra la imagen fluorescente como si se tomara una fotografía común.
  21. 21. LECTURA DE MICROARREGLOS  Lectores confocales hacen la reconstrucción de la imagen utilizando los principios de la microscopía confocal, que consiste en la utilización de fotomultiplicadores para registrar la señal  Permiten obtener una imagen de muy alta resolución
  22. 22. LECTURA DE MICROARREGLOS  En dos tipos de lectores se utiliza un láser para excitar las moléculas fluorescentes unidas al cDNA y poder obtener la imagen de cada una de las muestras contenidas en el microarreglo.  Este procedimiento se hace para cada uno de los fluoróforos obteniéndose dos imágenes  Para la obtención de estas imágenes se debe ajustar la intensidad del láser y la sensibilidad de la cámara o de los fotomultiplicadores, de tal forma que ambas imágenes den valores semejantes de fluorescencia total.
  23. 23. LECTURA DE MICROARREGLOS
  24. 24. LECTURA DE MICROARREGLOS
  25. 25. LECTURA DE MICROARREGLOS  Para este experimento se marcó la muestra experimental en rojo y la control en verde, todos aquellos puntos que se ven rojos o tonalidades anaranjadas, pueden ser interpretados como genes que aumentaron su expresión.  Los puntos verdes o tonalidades entre el amarillo y el verde serán aquellos genes que disminuyeron su expresión. Y finalmente los puntos amarillos representan a los genes que en ambas condiciones se expresan de igual forma.
  26. 26. LECTURA DE MICROARREGLOS Cámara de hibridización para microarreglos
  27. 27. LECTURA DE MICROARREGLOS Fluorescencia para un microarreglo hibridizado con una sonda marcada con dUTP-Cy3 (rojo) y una sonda marcada con dUTP-Cy5 (verde).
  28. 28. LECTURA DE MICROARREGLO Combinación de microarreglo
  29. 29. CUANTIFICACIÓN DE MICROARREGLOS  Para la obtención de los valores cuantitativos de cada una de las señales de fluorescencia contenidas en el microarreglo, se requiere del análisis de las imágenes y de programas de computo
  30. 30. CUANTIFICACIÓN DE MICROARREGLOS
  31. 31. CUANTIFICACIÓN DE MICROARREGLOS  Se debe considerar la aplicación de un filtro para depurar la imagen de pequeñas imperfecciones o señales no deseadas que pudieran encontrarse entre las muestras.  Posteriormente se genera una retícula en la que se definen las áreas que se van a cuantificar
  32. 32. CUANTIFICACION DE MICROARREGLOS En el cuadro dentro del circulo amarillo, está la zona para obtener la densidad real, entre el circulo amarillo y el azul está la zona no considerada y entre él circulo azul y el rojo la zona para determinar la señal de fondo. Cuantificación de la señal de un microarreglo, definición y ajuste de la retícula.
  33. 33. CUANTIFICACION DE MICROARREGLOS  Definidos estos parámetros el programa calcula la densidad de los pixeles en cada área definida, dando como resultado una tabla con las coordenadas, los valores de densidad, fondo y señal para cada una de las muestras en el microarreglo
  34. 34. CUANTIFICACION DE MICROARREGLOS Las primeras cuatro columnas corresponden a las coordenadas de cada gen en el microarreglo y estas coordenadas nos permiten relacionar ambas tablas
  35. 35. CUANTIFICACION DE MICROARREGLOS
  36. 36. EJEMPLO DEL USO DE LOS MICROARREGLOS DE DNA  Estudio con microarreglos de cáncer cérvico uterino. De una paciente con diagnóstico de cáncer cérvico uterino se obtuvo un fragmento de biopsia fresca y sin incluir en parafina. También se consiguió una muestra de la misma región de tejido de una paciente sana (de cadáver) manteniendo las mismas condiciones para ambas muestras.  De las muestras se aisló el RNA total y se marco (comúnmente se marca la sonda control con el fluoróforo Cy5 y la experimental con Cy3). Ambas sondas marcadas, se juntaron y se hibridizó un microarreglo con 10,000 de los genes mejor identificaos en el humano.  De la lectura de este microarreglo se obtuvieron las imágenes y se cuantificó la señal de fluorescencia para cada sonda. Con los datos obtenidos se obtuvo la grafica de fluorescencia, donde se puede comprobar que los valores de fluorescencia son simétricos, lo que significa que tanto la reacción de marcado así como la hibridización y la lectura del microarreglos son correctos.
  37. 37. IMAGEN OBTENIDA DE MICROARREGLO Fragmento del microarreglo hibridizado, en donde vemos la señal de fluorescencia de Cy3 (rojo) para el RNA de la biopsia del paciente enfermo (C); la señal de fluorescencia de Cy5 (verde) para el RNA sin cáncer (N) y la combinación de ambas imágenes para ver la relación (C/N). A estas imágenes se hizo el procedimiento previamente descrito para obtener los valores numéricos.
  38. 38. TABLA OBTENIDA DE MICROARREGLO Grafica del logaritmo de la señal “N” eje X contra la señal “C” eje Y. Se observa que ambas señales se ajustan a una recta con un coeficiente de 0.9986, lo que indica un buen marcado, hibridización y lectura
  39. 39. CONCLUSIÓN  Un microarreglo es una distribución ordenada de genes en una pequeña superficie, y mediante con hibridación con el ADN problema se puede obtener respuesta instantánea de la actividad o la expresión de múltiples genes en un solo análisis.  La intensidad de la fluorescencia es directamente proporcional al nivel de expresión del gen.  La interpretación de los marcajes indicara un patrón de colores, así cada punto en el soporte del microarreglo se asocia con el gen localizado según su color
  40. 40. GRACIAS POR SU ATENCION

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