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Biología molecular Biología molecular Presentation Transcript

  • Fundamentos de Biología molecular Fco Javier Casas Ciria. UGC Análisis Clinicos. Hospital de La Linea. S.A.S. 22 de febrero 2010
  • Estructura DNA
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  • Extracción DNA
    • 10-25 mg tejido en 180 ul de Tampón ATL
    • Añadir 20 ml de proteinasa K y mezclar con vortex. Incubar a 55 ºC. Mezclar con vortex ocasionalmente durante la incubación para mezclar. Incubación 1-3 horas.
    • Vortex 15 segundo
    • Añadir buffer AL 200 ul, vortex e incubar a 70º 10 minutos.
    • Añadir 200 ul de etanol absoluto, vortex.
    • Pipetear todo en una columna de Dneasy spin. Que se coloca en un tubo de recolección de 2 ml.
    • Centrifugar a 6000 g durante 1 minuto y descartar lo que pasó al tubo de recolección
  • Extracción DNA
    • Colocar la columna en otro tubo de recolección. Añadir 500 ml de buffer AW1.
    • Centrifugar 1 minuto a 6000 g y descartar lo del tubo de recolección
    • Colocal la columna en otro tubo de recolección y añadir 500 ml de buffer AW2.
    • Centrifugar a velocidad máxima durante 3 minutos.
    • Colocar la columna en un tubo de microcentrifuga y pipetear 200 ul de buffer AE.
    • Mantener 1 minuto a temperatura ambiente y centrifugar 1 a 6000 g.
    • Repetir los dos últimos pasos y guardar todo el eluido para estudio del DNA.
  • Detección por Sondas de hibridación
    • Sondas: segmentos de RNA o DNA marcados con radioisotopos, emzimas o sustancias quimioluminiscentes.
      • De 15 a 25 nucleótidos
      • Se unen a secuencias complementarias de ácidos nucleicos con gran especificidad.
      • Diseñadas para identificar gérmenes o segmentos genéticos detectando secuencias específicas.
      • Formatos de reacción empleados: fase líquida, fase sólida, in situ
  • Detección por Sondas de hibridación
      • Fase líquida: sonda marcada con ester de acridina se incuba con la cadena de ácido nucleíco diana.
        • Tras la hibridación se produce la hidrólisis alcalina. Aquel ester de acridina que está unido a un dímero de DNA está protegido de la hidrólisis y la sonda unida es medida en un luminometro tras la adición de peroxidasa.
        • La hibridación no requiere retirada de sondas de una sola cadena no unidas o aislamiento de los dímeros de ácidos nucleicos unidos.
      • Fase sólida.
        • El DNA en estudio es unido a membrana de nitrocelilosa o nylon y son hibridados con la sonda en solución.
        • La sonda no unida se retira tras lavados y se detecta la sonda unida mediante fluorescencia luminiscencia, radiactividad o desarrollo de color.
  • Detección por Sondas de hibridación
    • Hibridación in situ: el ácido nucleico se encuentra en tejido o células que están fijadas a un porta de microscopio.
      • Se emplea tejido fijado en formalina o embebido en parafina
    • Baja sensibilidad, limitado a a situaciones en que el número de gérmenes es muy grande.
      • Faringitis por grupo A; uretritis por C. trachomatis y N. gonorrhoeae
      • Más usado para confirmación de cultivo de micobacterias y hongos dimórficos.
  • Detección por Sondas de hibridación
    • Sondas de ácido nucleico peptídico (PNA, peptide nucleic acid)
        • Similares aDNA pero el esqueleto de fosfato es remplezado por esqueleto peptídico.
          • A causa de que no están cargadas no tienen que sobrepasar la repulsión electrostática que existe entre dos cadenas de DNA hibridadas.
          • Por ello la sonda de PNA se une más rapidamente y con más fuerza y por su caracter hidrofóbico son más útiles en hibridación in situ al penetrar las membranas.
        • Utilizadas para detección directa de bacterias desde el frasco de hemocultivos y de Mycobacterium tuberculosis de baciloscopias positivas.
  • Técnicas de amplificación
    • La PCR, la técnica más desarrollada, que tiene 25 años, aunque existen muchas otras técnicas y varias con utilidad clínica.
    • Ctcas:
      • Tienen una sensibilidad única en el laboratorio de medicina
      • Han aportado oportunidades para el cuidado del paciente
      • El nuevo "gold standard" en varios diagnósticos.
  • Amplificación de la señal
    • No se produce el aumento en concentración de la diana.
    • Se produce el aumento en la concentración de moléculas marcadas unidas al ácido nucleico diana. Para ello se ha empleado:
      • Multiples enzimas
      • Múltiples sondas
      • Multiples capas de sonda
      • Reducción del "ruido" de fondo
    • Ventaja de la amplificación de la señal:
      • El número de moléculas dianas no se altera. La señal es directamente proporcional a la cantidad de secuencia diana presente en la muestra clínica. Se reduce los falsos positivos debido a contaminación cruzada y simplifica el desarrollo de técnicas cuantitativas.
      • Como no depende de sistemas enzimáticos no se afectan por la presencia de inhibidores enzimáticos en las muestras clínicas y el proceso de extracción de DNA puede ser más simple.
      • Los niveles de RNA se pueden medir directamente sin la síntesis de DNAc intermediario.
    • Técnicas:
      • BDNA (branched DNA)
      • Hybrid Capture Assay
    Amplificación de la señal
  • Técnicas de bDNA
    • El sistema de amplificación de la señal es un sistema de hibridación en sandwich que incorpora multiples sets de sondas sintéticas. La clave de la tecnología es la molécula amplificadora, una molecula de DNA ramificada con 15 ramas idénticas y cada una puede unir a tres sondas marcadas.
    • La detección se realiza por incubar el complejo con dioxetano, enzima que activa el sustrato y mide la emisión de luz con un luminometro. La señal resultante es directamente proporcional a la cantidad de diana en la muestra
    • Para reducir ruido de fondo por la hibridación inespecífica se emplea isocitidina e isoguanosina en las sondas marcadas y preamplificador de la señal. Forman parejas de base uno con otro pero no con ninguna de las cuatro bases naturales. Así se incrementa la amplificación de la señal específica de la diana sin incrementarse la señal de fondo.
    • Empleado para cuantificación de DNA HBV, RNA HCV, RNA HIV-1
  • Técnicas de bDNA
  • Técnicas de captura-hibridación
    • El DNA diana de la muestra está desnaturalizado y luego hibridado con una sonda específica de RNA
    • Los hibridos DNA-RNA son capturados por anticuerpos antihíbridos que son usados para para cubrir la superficie de un tubo
    • Luego se añaden anticuerpos antihibridos conjugados con fosfatasa alcalina.
    • El anticuerpo conjugado es detectado con un sustrato quimioluminiscente y la luz emitida es medida en un luminometros.
    • Son multiples conjugados de fosfatasa alcalina los que se unen a cada molécula de híbrido lo que amplifica la señal y la luz emitida es proporcional a la cantidad de DNA diana.
    • Empleado en detección de gonococo, C. Trachomatis, HPV, CMV
  • Técnicas de captura-hibridación
  • Amplificación de la diana
    • Realización de múltiples copias de la secuencia diana mediante un sistema enzimático.
    • Producción de millones a billones de copias en horas
    • Proclive a la contaminación cruzada con material de otras muestras pudiendo dar falsos positivos
  • Amplificación de la diana
    • Para evitar contaminación: Diseño del laboratorio
  • PCR
    • Reacción que permite la sintesis de una cantidad sin límite de la secuencia de ácido nucleico diana.
    • Realizado por la acción de una enzima, la DNA polimerasa , que bajo ciertas condiciones adecuadas puede copiar DNA
    • La PCR se realiza en el laboratorio por un coctel de sustancias: DNA diana, un exceso de dos oligonucleotidos cebadores (primers), una DNA polimerasa estable al calor, una mezcla equimolecular de desoxiribonucleotido trifosfatos (dATP, DCTP, DGTP, DTTP), MgCl2, KCl y tampón Tris-HCl
    • Cada primer se une a una cadena de DNA flanqueando un segmento de la doble cadena menor de 100 pares de nucletidos
    • Para iniciar la PCR, la mezcla se calienta para separar las dos cadenas de DNA diana y luego enfriado para permitir al primer alinearse con el DNA diana.
  • PCR
    • La DNA polimerasa inicia entoces la extensión de los primer en su extremo 3'
    • Los productos de la extensión de los primers son disociados del DNA diana por calor y cada producto de la extensión así como el DNA diana sirve como modelo para ciclos posteriores de alienación de los primers y extensión.
    • Al final de cada ciclo el producto de la PCR es doblado.
    • Todo el proceso es realizado en un termociclador que controla de manera precisa la temperatura de cada paso, el tiempo de cada pasoy el número de ciclos.
  •  
  • RT-PCR
    • Desarrollada para amplificar RNA diana
    • Primero se produce DNA complementario del RNA diana por transcripción inversa y luego el DNAc es amplificado mediante PCR
    • Para ello se usa una DNA polimerasa del Thermus thermophilus que funciona tanto como retrotranscriptasa y como DNA polimerasa y es termoestable.
    • Esto es importante porque antes se empleaba una retrotranscriptasa del virus de la mieloblastosis aviar que no era termoestable y la formación del DNAc se tenía que hacer a temperatura muy baja, por debajo de la temperatura óptima de alineación, dando a alineamiento inespecíficos y provocando resultados ineficientes.
  • PCR-multiplex
    • Uso de dos o más parejas de primers en el mismo tubo de reacción para amplificación de varias secuencias dianas y posibilidad de detección de varios patógenos o genes en un mismo tubo de reacción
    • Los primers a emplear tienen que tener igual temperatura de alienamiento y carecer de complementariedad.
    • Desarrollados paneles para el estudio de patógenos del SNC y de patógenos viarels respiratorio.
  • PCR-multiplex
    • De la más estudiadas es el sistema LabMAP (Luminex Corp)
      • Usa microesferas de poliestireno coloreadas con dos fluorocromos distintos
      • Usando cocientes muy precisos de estos dos fluorocromos se ha creado hasta 100 grupos de microesferas diferentes cada con unas características espectrales distintas.
      • Cada grupo de microesfera puede poseer un reactante diferente sobre su superficie. Para estudio de ácidos nucleicos se unen las sondas de oligonucleotidos a la superficie de las microesferas. Como cada esfera puede distinguirse con su diferente longitud de onda pudiendo medirse hasta 100 parámetros distintos
      • Estas microesferas se miden medinate un citometros de flujo específico y como cientos de esferas pueden ser analizadas por segundo pueden medirse hasta 100 diferentes reacciones en un único tubo de reacción en pocos segundos.
  • PCR en tiempo real
    • La amplificación y la detección tienen lugar simultaneamente en el mismo tubo
    • El software registra la emisión de fluorescencia en cada ciclo y genera una curva de amplificación para cada reacción
    • La cantidad de diana en una muestra desconocida es determinada por medir el ciclo en que la muestra sobrepasa un umbral y usar una curva estandard con una diana a concentración conocida.
    • Las sondas son marcadas con colorantes fluorescentes
  • PCR en tiempo real
  • Deteción y análisis postamplificación análisis en gel
    • Visualización en gel de agarosa con bromuro de etidio tras electroforesis
  • Análisis en gel También puede luego transferirse a una membrana de nitrocelulosa o nylon y hibridarse a una sonda específica para aumentar la sensibilidad y especificidad de la detección
  • Sistema en placa de microtiter colorimetrica
    • El producto amplificado es capturado en una placa de mirotiter por sondas específicas que cubren la superficie de plástico.
    • El producto unido se detecta por un cambio de color que aparece tras añadir un conjugado enzimático y el sustrato adecuado.
    • Durante la amplificación se usan primers marcados con biotina.
    • Tras la amplificación, se fijan a la placa con una sonda de captura,
    • El producto unido es detectado con un conjugado streptavidina-enzima
    • Y se le añade un sustrato cromogénico
  • Line probe assay Producto de PCR marcado con biotina se hibrida de manera específica con sondas inmobilizadas sobre una tira Tras hibridación estreptavidina cojugada con fosfatasa alcalina reacciona con el sustrato añadido en ultimo lugar.
  • Automatización
    • Tres pasos en la PCR: Extracción, amplificación y detección.
    • Ventajas de automatización en la extracción:
      • Facilidad de uso
      • Limita el manejo de la muestra con las manos
      • Aumenta la reproductibilidad
      • Disminuye la contaminación
    • Inconvenientes de automatización:
      • Coste elevado
      • Obligado a trabajar por lotes de un número fijo de muestras
      • Gran tamaño de algunos de estos aparatos.
  • Automatización
      Aparatos completamente automatizado de amplio rendimiento (MagNa Pure, Roche y m2000 de Abbot)
    Aparatos diseñados para un pequeño número de muestras como BioRobot EZ1 de Qiagen Grandes progresos en extracción
  • Automatización
    • El progreso en la amplificación ha venido dado por el desarrollo de la PCR en tiempo real.
    • El tiempo del análisis viene dado por el tiempo que dura la amplificación y este depende de la velocidad en que el termociclador cambie de temperatura, habiendo alguno que cambia hasta 20 ºC por segundo.
    • Estos sistemas de PCR en tiempo real usan gran variedad de sistemas opticos de detección de fluorescencia.
      • Lampara de tungsteno como origen de excitación y filtros seleccionables para excitación y detección de la longitus de onda detectada
      • Dispositivos de excitación por laser o diodos
    • Los nuevos aparatos permiten emplear hasta 5 colorantes fluorogénicos diferentes simultaneamente en la misma reacción
  • Automatización
    • Ejemplos:
      • LyghtCycler (Roche)
      • Taqman (Roche)
      • SmartCycler (Cepheid)
    • Automatización completa
      • AmpliPrep-COBAS TaqMan
      • M2000 (Abbot)
      • GeneXpert (Cepheid)
  • Buena practica
    • Una sensibilida analítica sin parangón conlleva la desventaja de una predisposición a la contaminación cruzada
    • Toma de la muestra transporte y procesamiento.
      • Para HIV-1 carga viral el plasma debe separarse de las células antes de 6 horas despues de su extracción para minimizar la degradación celular. Una vez separado debe congelarse desde -20 a -70ºC.
  • Buena practica
    • Prevención de contaminación:
      • Manejo cuidadoso de muestras para evitar salpicaduras
      • Abrir solo un tubo de muestra cada vez
      • Realizar un pulso a los tubos en la centrífuga previamente a abrirlo
      • Usar tubos con tapón de rosca para evitar aerosoles
      • Descontaminar superficies de trabajo
      • Usar puntas de pipetas con filtros
      • Regularmente "limpiar" pipetas con papel humedecida en etanol (¡NO DEJAR QUE ENTRE ETANOL DENTRO DE LA PIPETA)
      • Pipetas que siempre se usen para la misma función.
      • Desechos en bolsas de plásticos de un solo uso.
      • Usar guantes durante todo el proceso
  • Inactivación enzimática
    • Inactivación enzimática del producto amplificado se puede realizar con uracil-N - glicosilasa (UNG), enzima que repara el DNA y presente en muchas especies
    • En la PCR se reemplaza dUTP por DTTP, así que DUTP es incorporado en la cadena de DNA que se sintetiza
    • Si el producto conteniendo UTP está presente como contaminante, la adición de UNG a la reacción en la retirada de residuos de desoxiuracilo destruyendo el DNA contaminante.
    • Por ello incubamos previamente a 56 ºC, la UNG destruye todo el DNA con UMP.
      • Luego calentamos a 95ºC y se inactiva la UNG y se activa la Taqpolimerasa.
  • Gracias por su atención