1. DETERMINACION DE METABOLITOS
- Diagnóstico bioquímico – clínico
- Seguimiento de una reacción enzimática por detección de
metabolitos secundarios
Agosto 10, 2006

2. METABOLITOS A DETERMINAR:
•GLUCOSA
•COLESTEROL
•HDL / LDL
•TRIGLICERIDOS
•UREA

3. Glucosa
Oxidasa
D-glucosa + O2
ácido D- glucónico + H2
O2
H2
O2
+ p-HBA + 4-AAP compuesto coloreado+ H2
O
peroxidasa
DETERMINACIÒN DE GLUCOSA POR
PRUEBA ENZIMÀTICA

4. Prueba de Tolerancia a la Glucosa
Se puede evaluar la eficiencia del metabolismo de glucosa
cuantificando los niveles de glucosa en sangre luego de una
carga de glucosa oral. La tolerancia a la glucosa implica que
luego de esta carga no se observe glucosa en la orina
(glucosuria) y que la glucosa en sangre siga una curva típica a
la largo del tiempo (ver figura).

5. Curva de Tolerancia Promedio
después de la ingestión de 100 g de glucosa
0
50
100
150
200
250
300
350
0 50 100 150 200
minuto s d es p ués
d e la ing es tió n
glucosa(mg/dL)
normal
daño hepático
diabetes ligera
diabetes severa

6. Las condiciones clínicas que pueden estar asociadas con un resultado
anormal de tolerancia a la glucosa (fuera de la diabetes) son las
siguientes:
1. Ingestión de carbohidratos disminuida en los días anteriores a la prueba
2. Insuficiencia hepática severa
3. Enfermedades crónicas con desnutrición (alcoholismo, uremia)
4. Inactividad física prolongada (más de 72 horas en cama)
5. Stress agudo (fiebre, trauma, cirugía mayor)
6. Enfermedades endocrinas (acromegalia, síndrome de Cushing,
insulinoma, glucagonoma entre otras)
7. Uso de drogas
8. Sobrepeso (más de 20% sobre el peso ideal)
9. Trastornos gastrointestinales

7. Blanco Estandar
M 1 M 2 M 3 M 4 M 5
Tiempo luego
de ingesta
de glucosa
Basal 30 min 60 min 90 min 120min
Muestra 0.01mL 0.01mL 0.01mL 0.01mL 0.01mL
Estándar Glucosa 0.01mL
Solución (G) 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
TOLERANCIA A LA GLUCOSA

8. 1. Incubar a 37°C por 5 minutos o 10 minutos a Temperatura ambiente.
2. Leer absorbancia de las muestras a 505nm dentro de los primeros 30 minutos
3. Calcular la concentración de la glucosa en las muestras proporcionadas, según
la siguiente fórmula:
Concentración de Glucosa: Amuestra
x Cestándar
/ Aestándar
4. Graficar la curva de tolerancia de glucosa con los datos obtenidos
5. Determinar el diagnóstico del paciente de la muestra según el grafico de la
curva de tolerancia a la glucosa
6. Discutir los resultados
DATO: El intervalo de referencia normal en suero es 70 mg/dL – 100 mg/dL

9. Tipos de lipoproteínasTipos de lipoproteínas
 QuilomicronesQuilomicrones (Q)(Q)
 VLDL (Lipoproteínas de muy baja densidad)VLDL (Lipoproteínas de muy baja densidad)
 IDL (Lipoproteínas de densidad intermedia)IDL (Lipoproteínas de densidad intermedia)
 LDL (Lipoproteínas de baja densidad)LDL (Lipoproteínas de baja densidad)
 HDL (Lipoproteínas de alta densidad)HDL (Lipoproteínas de alta densidad)

10. Figura No.1 Estructura de una lipoproteína

12. Colesterol ester Colesterol + Acidos grasos
Colesterol ester
Hidrolasa
Colesterol + O2
colesterol-4-en-3-ona + H2
O2
Colesterol
oxidasa
2 H2
O2 +
4-AAP + p-HBA compuesto coloreado + 4H2
O
peroxidasa

13. Determinación de Colesterol Total
El método para determinar el Colesterol Total consta de 3 reacciones
acopladas:
La enzima Colesterol Ester Hidrolasa, libera el colesterol de los esteres de
colesterol
EL colesterol liberado es oxidado por la Colesterol Oxidasa produciéndose
péroxido de hidrógeno
El peroxido de hidrogeno, en presencia de la enzima Peroxidasa reacciona
con el sistema cromogénico dando origen a un compuesto coloreado, que es
leido en el espectofotómetro a 505nm.
Concentración de colesterol: Amuestra x Cestándar / Aestándar

14. Determinación de LDL-Colesterol
EL LDL-Colesterol (colesterol asociado a las lipoproteínas de baja
densidad, LDL) es obtenido por precipitación selectiva del LDL mediante
el uso de una solución de Heparina y Citrato de Sodio, quedando el
colesterol asociado al HDL y VLDL en el sobrenadante.
Por lo tanto la concentración de LDL-Colesterol precipitado se calcula
obteniendo el diferencial entre el valor de Colesterol Total y el valor
obtenido en el sobrenadante, el cual corresponde al Colesterol asociado a
HDL y VLDL.
Calcular la concentración del colesterol en el sobrenadante:
Abs muestra x factor Factor = 240 .
Absorb. Standard
Calcular la concentración del LDL colesterol, según la siguiente
fórmula:
LDL colesterol (mg/dL) = Colesterol total - Colesterol en
Sobrenadante

15. Determinación de Triglicéridos
Triglicéridos Glicerol + Acidos grasos
Lipasa
Glicerol + ATP Glicerol-1-fosfato + ADP
Glicerol kinasa
Glicerol 1-fosfato + O2 Dihidroxiacetonafosfato + H2O2
Glicerol-fosfato
Oxidasa
2 H2O2 + 4-AAP + DCBS compuesto coloreado + 4H2O
peroxidasa

16. Determinación de Urea
•
• CONH2CO + 2 H2O 2 NH3 + CO2 + H2O
Ureasa

17. DETECCIÓN DE AMONIO EN LA REACCIÓN
DE HIDRÓLISIS DE LA PIRAZINAMIDA (PZA),
POR MEDIO DE LA PRUEBA DE NESSLER.
• La hidrólisis de la Pirazinamida (PZA) por acción de la
Pirazinamidasa puede ser observada/monitorizada de modo
indirecto mediante la detección de amoniaco (NH3), un
metabolito secundario de esta reacción.
• El amoniaco producido reacciona con el reactivo de
Nessler, una solución alcalina de mercuri-yoduro de
Potasio, K2HgI4, formando un precipitado de color pardo
o amarillo. La fórmula de dicho precipitado no está bien
definida, ha sido descrita como O:Hg2N.NH2.I por
(Arthur I. Vogel, 1974), o también como NH2.Hg2.I3
(Nichols y Willits, 1934).

18. DETECCIÓN DE AMONIO EN LA REACCIÓN DE
HIDRÓLISIS DE LA PIRAZINAMIDA (PZA), POR
MEDIO DE LA PRUEBA DE NESSLER.
Pirazinamida (PZA) 1 Acido Pirazinoico (POA) + 1 Amoniaco(NH3)
1 NH3 + [K2HgI4] + 8 KOH O:Hg2.NH2.I + 7 KI + 2 H20