El documento describe las técnicas histológicas utilizadas para preparar muestras de tejido para su examen microscópico. Incluye los pasos de obtención de la muestra, fijación, deshidratación, inclusión en parafina, corte, tinción y montaje. Explica los métodos para obtener muestras de animales de laboratorio y humanas a través de autopsias, biopsias y cirugías, así como los diferentes tipos de fijadores químicos y físicos utilizados para conservar las

2. TECNICAS HISTOLOGICAS
Se define Técnica Histológica
como el conjunto de
operaciones a que se somete
una materia organizada, a fin de
posibilitar su estudio al
microscopio.
Las Técnicas Histológicas
incluyen los siguientes pasos:
Obtención de la Muestra.
Fijación de la Muestra.
Deshidratación.
Inclusión en Parafina.
Obtención de cortes.
Coloración.
Montaje

3. OBTENCION DE LA MUESTRA
El material a utilizar puede ser extraído
de los diversos animales de laboratorio,
o bien puede tratarse de material
humano.
Fases en la obtención de material
animal:
-Muerte del animal.
-Extracción de los órganos.
-Reducción a piezas.

4. Obtención de material humano:
De tres fuentes puede provenir el
material humano:
Necropsias o Autopsias: Son las piezas
que se obtienen de un cadáver.
Biopsias: Son trozos de tejido que se
obtienen de un sujeto con vida con
el objeto de estudiarlos al
microscopio y efectuar un
diagnóstico histopatológico.
- Piezas operadas: Los tejidos que han
sido extraídos de las intervenciones
quirúrgicas, generalmente tumores u
órganos inflamados, pero, sólo
servirán para anatomía patológica.

5. • Autopsia Forense o Necropsia:
• Necropsia Médico Forense:
• Es el procedimiento médico encaminado a que en base a
la revisión interna y externa del cadáver sea posible
establecer la causa de muerte del occiso relacionado con
una averiguación previa y en auxilio de una investigación
judicial.
• Es recomendable que en los siguientes casos se efectué
la necropsia médico legal:
• 1.- En todas las muertes violentas incluyendo aquellas en
que este la duda de violencia.
• 2.- Personas que fallecieron en áreas de reclusión y/o
seguridad y que estuvieron bajo responsabilidad de
servidores públicos de seguridad pública y procuración
de justicia.
• 3.- Muertes en la vía pública.
• 5.- Muertes sospechosas de haberse producido por
violación a los derechos humanos.

6. • Requisitos para la práctica de la necropsia:
• Orden escrita para la práctica del estudio de
necropsia firmada por la Autoridad Ministerial.
• Copia de la Averiguación Previa.
• Acta médica.
• En caso de haber recibido atención médica horas
o días previos a su muerte, resumen clínico de las
intervenciones y tratamientos a las que fue
sometido.
• Orden de entrega a los familiares y de aviso a la
Autoridad del Registro Civil.
• Objetivos a determinar:
• 1.- La causa de muerte (Cuando es posible).
• 2.- La hora aproximada de la muerte.
• 3.- La identidad del cadáver.
• 3.- Descripción detallada de las lesiones externas
e internas, así como de los hallazgos de necropsia,
siguiendo los protocolos internacionalmente
aceptados

7. • Autopsia Clínica:
• Es generalmente realizada para
determinar no sólo la causa de la
muerte, que en muchos casos es
conocida, sino todos los procesos
patológicos que afectaban al
individuo.
• Tiene propósitos de estudio e
investigación.
• Es solicitada por los facultativos
que atendieron al paciente y
debe ser autorizada por los
familiares.

8. FIJACION DE LA MUESTRA
Este proceso se refiere al tratamiento del tejido
con sustancias químicas que tienen varias
finalidades:
Conservar los tejidos de forma que muestren el
mayor parecido posible a su estado in vivo.
Aumentar la dureza del tejido para facilitar la
preparación de finas películas de éste.
Destruir bacterias y gérmenes que pudieran
encontrarse en ellos.
Interrumpir los procesos celulares dinámicos que
ocurren a la muerte de la célula.
Este proceso se refiere al tratamiento del tejido
con sustancias químicas que tienen varias
finalidades:
Conservar los tejidos de forma que muestren el
mayor parecido posible a su estado in vivo.
Aumentar la dureza del tejido para facilitar la
preparación de finas películas de éste.
Destruir bacterias y gérmenes que pudieran
encontrarse en ellos.
Interrumpir los procesos celulares dinámicos que
ocurren a la muerte de la célula.

9. La fijación mantiene las estructuras al
estimular la formación de enlaces
cruzados entre las proteínas.
Regla de Oro para la Fijación
La mejor fijación es cuando a pasado el
menor tiempo entre la muerte del
tejido y la fijación.
Tamaño de la Muestra.
El tamaño de la muestra debe de ser de
2-3 cm. variando el estudio para lo
cual de va a utilizar.

10. FIJACION (CONTINUACION)
La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes, favoreciendo así la coloración
ulterior de los tejidos.
La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes, favoreciendo así la coloración
ulterior de los tejidos.
FIJADORES QUÍMICOS
FIJADORES QUÍMICOS
Son los más utilizados; pueden ser:
Son los más utilizados; pueden ser:
- fijadores simples, constituidos por una sola sustancia química, y
- fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias sustancias intervienen en su
constitución.
- fijadores simples, constituidos por una sola sustancia química, y
- fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias sustancias intervienen en su
constitución.
FIJADORES SIMPLES:
FIJADORES SIMPLES:
a) Formol al 10%, es el más usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en
que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar
órganos o tejidos para estudios histológicos topográficos.
b) Alcohol etílico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microquímica.
c) Alcohol metílico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre,
médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.).
a) Formol al 10%, es el más usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en
que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar
órganos o tejidos para estudios histológicos topográficos.
b) Alcohol etílico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microquímica.
c) Alcohol metílico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre,
médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.).

11. FIJADORES COMPUESTOS:
FIJADORES COMPUESTOS:
En su composición intervienen un número variable de fijadores simples
racionalmente elegidos con el fin de completar la acción de cada uno de
ellos o atenuar sus defectos.
a) Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética.
b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-acética.
c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol.
d) Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética.
e) Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohólico.
En su composición intervienen un número variable de fijadores simples
racionalmente elegidos con el fin de completar la acción de cada uno de
ellos o atenuar sus defectos.
a) Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética.
b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-acética.
c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol.
d) Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética.
e) Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohólico.
FIJADORES FÍSICOS:
FIJADORES FÍSICOS:
1. Desecación.
2. Calor seco.
3. Calor húmedo.
4. Frío.
5. Congelación y desecación.
1. Desecación.
2. Calor seco.
3. Calor húmedo.
4. Frío.
5. Congelación y desecación.

12. Para Microscopia Electrónica se usan:
Para Microscopia Electrónica se usan:
Glutaraldehído al 2.5%, Paraformaldehído,
Tetróxido de Osmio y Permanganato de
Potasio
Permiten conservar detalles estructurales
finos, ya que otros fijadores como el
formaldehido, son muy enérgicos en su acción
con las proteínas.
Glutaraldehído al 2.5%, Paraformaldehído,
Tetróxido de Osmio y Permanganato de
Potasio
Permiten conservar detalles estructurales
finos, ya que otros fijadores como el
formaldehido, son muy enérgicos en su acción
con las proteínas.
Actúan como colorantes electrodensos,
permitiendo observar al tejido con el haz de
electrones.
Una solución de Glutaraldehído al 2.5% en un
tampón a pH 7.4, evita la violenta
desnaturalización de las proteínas guardando
detalles finos de la célula. Es el más usado en
Microscopia Electrónica.
Actúan como colorantes electrodensos,
permitiendo observar al tejido con el haz de
electrones.
Una solución de Glutaraldehído al 2.5% en un
tampón a pH 7.4, evita la violenta
desnaturalización de las proteínas guardando
detalles finos de la célula. Es el más usado en
Microscopia Electrónica.

13. DESHIDRATACION Y ACLARAMIENTO
DESHIDRATACIÓN
Después que la muestra ha sido fijada se
elimina el fijador y se deshidrata.
Debido a que una gran parte del tejido está
constituida por agua, se aplica una serie
gradual de soluciones acuosas de menor a
mayor de agente deshidratante, por ejemplo,
Alcohol Etílico o Acetona.
Iniciando con alcohol al 50 %, luego con una
solución de 60%, 70%, 80%, 90%, 96% y
alcanzando de manera paulatina el alcohol al
100 % para eliminar el agua.
Esto se hace por que si se colocara el tejido
en una solución al 100% de alcohol
inmediatamente, el agua saldría muy rápido
del tejido y se deformaría.
DESHIDRATACIÓN
Después que la muestra ha sido fijada se
elimina el fijador y se deshidrata.
Debido a que una gran parte del tejido está
constituida por agua, se aplica una serie
gradual de soluciones acuosas de menor a
mayor de agente deshidratante, por ejemplo,
Alcohol Etílico o Acetona.
Iniciando con alcohol al 50 %, luego con una
solución de 60%, 70%, 80%, 90%, 96% y
alcanzando de manera paulatina el alcohol al
100 % para eliminar el agua.
Esto se hace por que si se colocara el tejido
en una solución al 100% de alcohol
inmediatamente, el agua saldría muy rápido
del tejido y se deformaría.

14. ACLARAMIENTO O DIAFANIZACIÓN
Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una
solución de una sustancia que es miscible
tanto con el alcohol como con el medio de
inclusión a utilizar (en la mayoría de los casos
se utiliza como medio de inclusión Parafina
líquida).
La sustancia comúnmente utilizada es el Xileno
o Xilol.
Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna
transparente o claro en el xileno, esto se debe
a que cambia su índice de refracción.
También se pueden utilizar Tolueno, Benzol o
Cloroformo como medios de aclaramiento.
NOTA: El alcohol y el xileno disuelven los
lípidos de la célula y por lo cual al extraerse
también se extraen las grasas y los lípidos de la
célula.
ACLARAMIENTO O DIAFANIZACIÓN
Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una
solución de una sustancia que es miscible
tanto con el alcohol como con el medio de
inclusión a utilizar (en la mayoría de los casos
se utiliza como medio de inclusión Parafina
líquida).
La sustancia comúnmente utilizada es el Xileno
o Xilol.
Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna
transparente o claro en el xileno, esto se debe
a que cambia su índice de refracción.
También se pueden utilizar Tolueno, Benzol o
Cloroformo como medios de aclaramiento.
NOTA: El alcohol y el xileno disuelven los
lípidos de la célula y por lo cual al extraerse
también se extraen las grasas y los lípidos de la
célula.

15. DESHIDRATACION E INCLUSION EN PARAFINA
A fin de que se puedan obtener cortes
suficientemente finos para ser observados al
microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos y
envueltos por una sustancia de consistencia firme.
Las sustancias usadas para este fin son: gelatina y
parafina.
El objeto de la inclusión es:
Tener un objeto lo suficientemente duro para su
manejo y corte.
La inclusión se logra al infiltrar la parafina liquida o
cualquier medio de inclusión en estado líquido al
tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y
penetra en el tejido.
Por lo general se coloca la muestra de tejido en un
recipiente y se le agrega la parafina fundida a 60º C,
colocando la muestra en una estufa de 30 minutos a
6 horas manteniendo la temperatura a 60º C.
A fin de que se puedan obtener cortes
suficientemente finos para ser observados al
microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos y
envueltos por una sustancia de consistencia firme.
Las sustancias usadas para este fin son: gelatina y
parafina.
El objeto de la inclusión es:
Tener un objeto lo suficientemente duro para su
manejo y corte.
La inclusión se logra al infiltrar la parafina liquida o
cualquier medio de inclusión en estado líquido al
tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y
penetra en el tejido.
Por lo general se coloca la muestra de tejido en un
recipiente y se le agrega la parafina fundida a 60º C,
colocando la muestra en una estufa de 30 minutos a
6 horas manteniendo la temperatura a 60º C.

16. Debido al calor, el xilol o el benzol
se evaporan y los espacios
anteriormente ocupados por ellos
son ahora ocupados por la
parafina.
Después se coloca la pieza y un
poco de parafina fundida en un
molde de papel o metal de forma
rectangular y se deja solidificar a
temperatura ambiente,
formándose un bloque sólido de
parafina con el trozo de tejido
incluido, a este bloque se le
denomina Taco.
Debido al calor, el xilol o el benzol
se evaporan y los espacios
anteriormente ocupados por ellos
son ahora ocupados por la
parafina.
Después se coloca la pieza y un
poco de parafina fundida en un
molde de papel o metal de forma
rectangular y se deja solidificar a
temperatura ambiente,
formándose un bloque sólido de
parafina con el trozo de tejido
incluido, a este bloque se le
denomina Taco.

17. OBTENCION DE CORTES
El taco ahora se puede cortar en secciones
lo suficientemente delgadas como para
permitir el paso de la luz.
El taco ahora se puede cortar en secciones
lo suficientemente delgadas como para
permitir el paso de la luz.
La mayor parte de los preparados para
microscopia óptica tienen un grosor entre 3
a 10 micrómetros.
La mayor parte de los preparados para
microscopia óptica tienen un grosor entre 3
a 10 micrómetros.
Para estos cortes se utiliza un aparato
llamado MICROTOMO.
Para estos cortes se utiliza un aparato
llamado MICROTOMO.
Cuando deseamos estudiar grasas o lípidos
que se extraen en el proceso de
aclaramiento o enzimas que quedan
inactivadas por el calentamiento de la
inclusión, nos auxiliamos con la Técnica de
Congelación de Tejidos.
Cuando deseamos estudiar grasas o lípidos
que se extraen en el proceso de
aclaramiento o enzimas que quedan
inactivadas por el calentamiento de la
inclusión, nos auxiliamos con la Técnica de
Congelación de Tejidos.
Un tejido congelado, es los suficientemente
duro para ser cortado. Se sumerge la
muestra de tejido en Nitrógeno líquido para
tener una congelación rápida.
Un tejido congelado, es los suficientemente
duro para ser cortado. Se sumerge la
muestra de tejido en Nitrógeno líquido para
tener una congelación rápida.

18. Luego se corta con un aparato especial denominado
MICROTOMO DE CONGELACIÓN, existe un
aparato más elaborado y eficiente para los cortes de
congelación llamado CRIOSTATO.
La ventaja de esta técnica es que los cortes que se
obtienen son muy rápidos, se puede utilizar en el
diagnostico de material patológico, tomado en
intervenciones quirúrgicas y el resultado se obtiene
en el transcurso de una operación.
Para Microscopia Electrónica se requieren cortes
más delgados (denominados ultra finos) de
aproximadamente 25 a 100 nm. de espesor y de 0.5
mm. de lado medio. Para esto se utiliza un
MICROTOMO CON HOJA DE VIDRIO O
DIAMANTE. Una vez preparados, se montan sobre
rejillas de cobre con un diámetro de 3mm.
Luego se corta con un aparato especial denominado
MICROTOMO DE CONGELACIÓN, existe un
aparato más elaborado y eficiente para los cortes de
congelación llamado CRIOSTATO.
La ventaja de esta técnica es que los cortes que se
obtienen son muy rápidos, se puede utilizar en el
diagnostico de material patológico, tomado en
intervenciones quirúrgicas y el resultado se obtiene
en el transcurso de una operación.
Para Microscopia Electrónica se requieren cortes
más delgados (denominados ultra finos) de
aproximadamente 25 a 100 nm. de espesor y de 0.5
mm. de lado medio. Para esto se utiliza un
MICROTOMO CON HOJA DE VIDRIO O
DIAMANTE. Una vez preparados, se montan sobre
rejillas de cobre con un diámetro de 3mm.

19. COLORACION O TINCION DE LA MUESTRA
Las tinciones son combinaciones de colorantes ácidos y
básicos que permiten obtener suficiente contraste de
color en los cortes histológicos comunes.
A continuación presentaremos una lista de las tinciones
más comunes:
Hematoxilina y Eosina: La hematoxilina al ser básica tiñe
ácidos de color morado (núcleos con DNA y RNA),
mientras que la eosina es un ácido y tiñe bases de color
rosado (citoplasma).
PAS (Ácido Peryódico de Schiff): Tiñe carbohidratos
(mucopolisacáridos) de color rojo, por ejemplo las células
caliciformes en el intestino.
Tricrómico de Masson: Tiñe de color azul la colágena, de
rojo la queratina, y de morado los núcleos (muy utilizada
para los cortes de piel).
Nissl: Tiñe de color morado el retículo endoplásmico
rugoso y los corpúsculos de Nissl en las neuronas.
Las tinciones son combinaciones de colorantes ácidos y
básicos que permiten obtener suficiente contraste de
color en los cortes histológicos comunes.
A continuación presentaremos una lista de las tinciones
más comunes:
Hematoxilina y Eosina: La hematoxilina al ser básica tiñe
ácidos de color morado (núcleos con DNA y RNA),
mientras que la eosina es un ácido y tiñe bases de color
rosado (citoplasma).
PAS (Ácido Peryódico de Schiff): Tiñe carbohidratos
(mucopolisacáridos) de color rojo, por ejemplo las células
caliciformes en el intestino.
Tricrómico de Masson: Tiñe de color azul la colágena, de
rojo la queratina, y de morado los núcleos (muy utilizada
para los cortes de piel).
Nissl: Tiñe de color morado el retículo endoplásmico
rugoso y los corpúsculos de Nissl en las neuronas.

20.  Pentacrómico de Movat: Tiñe de amarillo la
colágena, los músculos de color rojo, de azul
mucopolisacáridos, la elastina de color negro, y
los núcleos de morado.
 Wright: utilizado en frotis sanguíneos, permite
observar todas las células sanguíneas,
coloreando los eritrocitos de color rosado, con
un centro claro. Permite observar todas las
células sanguíneas, coloreando los eritrocitos
de color rosado, con un centro claro.
 Reyes Mota: Tiñe la elastina de color morado.
 Además de las tinciones comunes tenemos a la
inmunohistoquímica, la cual se basa en la
utilización de anticuerpos específicos, los cuales
marcan o resaltan las estructuras que se desean
ver.

21. EJEMPLOS DE COLORACIONES
Coloración Hematoxilina-
Eosina
Resultados:
Núcleos y material basófilo
en tonos de morado.
Citoplasma en tonos de
rosado
Coloración Hematoxilina-
Eosina
Resultados:
Núcleos y material basófilo
en tonos de morado.
Citoplasma en tonos de
rosado
Glándula salival Sublingual,
objetivo 40X
Glándula salival Sublingual,
objetivo 40X
Tricrómico de Van
Gieson.
Resultados:
Células:
- Núcleos: negro - azul
- Citoplasma: amarillo
Tricrómico de Van
Gieson.
Resultados:
Células:
- Núcleos: negro - azul
- Citoplasma: amarillo
Colágeno: rojo intenso
Colágeno: rojo intenso
Piel humana, objetivo
40X
Piel humana, objetivo
40X
Impregnación Argéntica
Resultados:
Célula (neurona):
-Soma y prolongaciones
(dendritas, axón) de
color pardo oscuro
Impregnación Argéntica
Resultados:
Célula (neurona):
-Soma y prolongaciones
(dendritas, axón) de
color pardo oscuro
Corteza cerebral de rata,
objetivo 40X
Corteza cerebral de rata,
objetivo 40X

22. Ácido Periódico de Schiff (PAS)
Hematoxilina
Resultados:
- Núcleos: azul
-Células caliciformes y Chapa estriada en
fucsia
Ácido Periódico de Schiff (PAS)
Hematoxilina
Resultados:
- Núcleos: azul
-Células caliciformes y Chapa estriada en
fucsia
Intestino delgado, objetivo 40X
Intestino delgado, objetivo 40X
Corte de piel Corte de piel c coonn t trricicrróómmicicoo d dee M Maassssoonn

23. MONTAJE Y OBSERVACION EN EL MICROSCOPIO
Para observar adecuadamente los cortes teñidos con
el microscopio óptico, se ha de proceder a cubrir las
preparaciones mediante un cubreobjetos.
Para observar adecuadamente los cortes teñidos con
el microscopio óptico, se ha de proceder a cubrir las
preparaciones mediante un cubreobjetos.
Para ello se requiere la utilización de una sustancia
cementante o medio de montaje.
Para ello se requiere la utilización de una sustancia
cementante o medio de montaje.
Si durante la técnica de tinción se han empleado
colorantes hidrosolubles, deben utilizarse medios de
montaje no-acuosos, es decir hidrofóbicos.
Si durante la técnica de tinción se han empleado
colorantes hidrosolubles, deben utilizarse medios de
montaje no-acuosos, es decir hidrofóbicos.
Si por el contrario, los colorantes utilizados son no-iónicos,
Si por el contrario, los colorantes utilizados son no-iónicos,
es preceptivo utilizar un medio de montaje
es preceptivo utilizar un medio de montaje
hidrosoluble. Antes de su aplicación, los cortes deben
hidratarse convenientemente.
hidrosoluble. Antes de su aplicación, los cortes deben
hidratarse convenientemente.