El documento resume los principales pasos de la técnica histológica, incluyendo la obtención del material, fijación, inclusión, corte, tinción e interpretación. También describe los diferentes tipos de microscopios, haciendo énfasis en el microscopio óptico de campo claro y sus componentes ópticos e iluminación.

1. Escuela de Medicina Luis RazettiDepartamento de Ciencias MorfológicasCátedra de Histología y EmbriologíaDr. Luis Alberto Isea MMédico CirujanoOctubre 2011

2. HISTOLOGÍA- Ciencia que estudia los tejidos de los seres vivosHisto + LogíaTejidosCiencia MacroscópicaAnatomíaMicroscópica- Correlación Estructura - FunciónProceso PatológicoClínica

3. TÉCNICA HISTOLÓGICATejidoProcedimientosCorte HistológicoMicroscopioPasos de la Técnica Histológica1) Obtención del materialIncisionalBiopsiaAutopsiaCitologíaExcisional

4. TÉCNICA HISTOLÓGICA2) FijaciónPreserva morfología y estructura del tejido

5. Detiene procesos celulares dinámicos

6. Elimina posibles patógenos

7. Aumenta la consistencia del tejidoAutolísis - No produce Artefactos - No dificulta etapas ulteriores de la técnica - Buena penetración al tejidoIdealmente:Mec. de Acción: Forman Enlaces cruzados entre las Proteínas (Grupos Amino) Gel insoluble

8. TÉCNICA HISTOLÓGICAPerfusiónDebe colocarse inmediatamenteVolumen de fijador de 10 a 20 veces la muestraDejar por 6 a 24 horasFijaciónInmersióna) FormolFísicosb) Alcoholc) Glutaraldehidod) Tetraóxido de OsmioSimplesFijadores QuímicosLiquido de FlemingLiquido de Zenkere) Líquido de BouinCompuestos

9. TÉCNICA HISTOLÓGICAa) Formol: - Mas utilizado - Mal fijador de membranas - Bajo precio - Buena efectividad - Poca retracción tisular - Disuelve el glucógenob) Alcohol - Fija por deshidratación- Útil para citologías. «Lacas o spray»- Excelentes fijadores- Suelen usarse para la Microscopía Electronica- No para coloraciones convencionalesc) Glutaraldehidod) Tetraoxido de Osmio

10. TÉCNICA HISTOLÓGICAe) Líquido de BouinÁcido Pícrico + Formaldehído + Ácido Acético

11. Tejidos blandos, núcleo, glucógeno

12. No dejar mas de 48 hr en inmersión

13. Eliminar ácido pícrico antes de la inmersión3) Inclusión Combinación del tejido con ceras (insolubles en agua) para formar un bloque de corte Debe eliminarse el agua de la preparaciónBatería de alcohol etílicoConcentraciones crecientes (50-100%)DESHIDRATACIÓN

14. TÉCNICA HISTOLÓGICA- Se mezcla con un líquido miscible en parafina y aguaXilolTejido TransparenteDisuelve las grasasACLARAMIENTO- Se realiza la mezcla con las ceras (Parafina)a) Impregnación: Se pasa por parafina caliente, removiendo el xilolb) INCLUSIÓN: Se baña completamente con parafinaOtorga la dureza al tejido para realizar el CORTE

15. TÉCNICA HISTOLÓGICA4) Corte- Una vez en el bloque de parafina, se cortan rebanadas de 5 – 10 mcm (M. óptica)MICROTOMO- Se coloca el corte en un baño de flotación- Se monta en una lámina portaobjeto

16. TÉCNICA HISTOLÓGICA5) TinciónNecesitamos diferenciar las estructuras del corte.

17. Los colorantes presentan diferente afinidad por ciertos elementos, dando CONTRASTE al preparado histológico- La mayoría de los colorantes son HIDROSOLUBLESRehidratar el tejidoSe elimina la parafina con xileno

18. Se añade alcohol a concentraciones decrecientes Ácido - BásicoEspecializados (MEC)ColorantesSales Metálicas (M. Electronica)

19. TÉCNICA HISTOLÓGICAHematoxilina – Eosina (Coloración mas utilizada)- Se basan en las propiedades de BASOFÍLIA y ÁCIDOFILIAHematoxilina: - Colorante Básico (al unirse con una Laca) - Carga Positiva - Es Hidrosoluble, colocar antes de deshidratar Tiene afinidad por estructuras con carga NEGATIVA (BASOFILICAS)ÁCIDOS NUCLEICOS (NÚCLEO CELULAR)COLOR PÚRPURA

20. TÉCNICA HISTOLÓGICAEosina:Colorante Ácido

21. Carga Negativa

22. Tiene afinidad con estructuras de Carga Positiva (ÁCIDOFILAS)

23. Unión con componentes CITOPLASMATICOSCOLOR ROJO - ROSADO

24. TÉCNICA HISTOLÓGICA6) Montaje- Antes de ver el preparado al microscopio, debe colocarse una lámina cubreobjetos- Debe colocarse una sustancia conservadora a la muestra, para fijar ambas láminasHIDROFÓBICA- Volver a deshidratar el tejido y colocar xileno

25. TÉCNICA HISTOLÓGICADesventajas de la H - ENo permite evaluar: a) Elastina b) Fibras reticulares c) Membranas basales d) LípidosColoraciones Especiales (Histoquímica)

26. TÉCNICA HISTOLÓGICATinción Lípidos (Corte Congelado)Sudan IIIRojo Sudan (TAG) Negro Sudan (Neuronas)Tricrómico de MalloryFibras Colágenas (Azul)Wright y GiemsaCélulas HemáticasMetacromasiaAzul de Toluidina- La coloración depende de la agregación de las moléculas - Se ve en tejidos con gran cantidad de polianiones- Azul --------------------- Púrpura-Glucosaminoglicanos MEC, Gránulos MastocitosPAS: Carbohidratos, Glucogeno (Rojo)Reactivo de Schiff(Reacciona con grupos aldehídos)Feulgen: DNA

27. TÉCNICA HISTOLÓGICAInmunohistoquímicaSe basa en la interacción ANTÍGENO – ANTICUERPO para la identificación de moléculasAntígeno: Toda sustancia capaz de desencadenar una respuesta inmuneAnticuerpo: Sustancia capaz de unirse a un antígeno de manera específicaSe colocan anticuerpos, de laboratorio, específicos para la molécula que queremos Identificar - Una vez producida la interacción debe colorearse o demostrarse su presenciaFluorescenciaEnzimasRadiación

28. TÉCNICA HISTOLÓGICAPuede ser Directa: El anticuerpo colocado esta marcado dando directamente la coloraciónIndirecta: Se coloca un Auto-anticuerpo, el cual interactúa con el anticuerpo colocado inicialmente, de darse la reacción

29. TÉCNICA HISTOLÓGICAHibridaciónCapacidad de hebras monocatenarias de DNA o RNA de unirse a hebras complementariasSe aísla DNA o RNA de la célula a examinar, y se mezcla con una sonda Con nucleotidos conocidos, con un marcaje (fluorescencia, radiación)El fragmento de la sonda interactuara con su hebra complementaria identificandoSu presencia en la célula a estudiar

30. TÉCNICA HISTOLÓGICAArtefactosFalla en la preparación histológica

31. Errores en metodología (falla en el calculo de tiempos o selección de colorantes)

32. Equipo inadecuado (cuchillas desafiladas)

33. Reactivos con poca purezaTÉCNICA HISTOLÓGICAInterpretación del Corte histológico

34. MICROSCOPÍAMicroscopio. Concepto- Permite ver imágenes ampliadas y detalladas de estructuras no visibles a simplevistaÓptico (Luz)ElectrónicoEfecto TúnelFuerza AtómicaClasificación(fuente de luz)Simple (1 lente)Campo ClaroCampo OscuroContraste de FaseLuz PolarizadaFluorescenciaConfocalM. ÓpticoCompuesto(2 o más lentes)

35. MICROSCOPÍAMicroscopios Ópticosa) Campo ClaroLa luz atraviesa la muestra (Transiluminación)

36. El corte debe ser delgado (5 – 10 mcm)

37. La coloración permite el contraste entre las estructurasPartesÓpticaMecánicaDa soporte y estructuraIluminación y aumento

38. MICROSCOPÍAParte MecánicaTuboColumnaRevolverTMacrometricoPlatinaTMicrometricoPie

39. MICROSCOPÍAParte ÓpticaObservación1) Objetivo: Tubo metálico constituido por varias lentes

40. Forman una imagen aumentada, dan resoluciónPoder de resoluciónCapacidad de una lente de distinguir dos objetos cercanos como independientesLímite de resoluciónDistancia mínima entre 2 objetos para que sean identificados como objetos separadosA MAYOR PODER DE RESOLUCIÓN MAS NÍTIDEZ EN LA IMAGEN0,2 – 0,5 mcm (M. óptica)0,2 mm (Ojo humano)MENOR LÍMITE DE RESOLUCIÓN

41. MICROSCOPÍAObjetivoNúmero de Aumento: Depende de las lentes, es el grado de magnificación de la imagen10X, 40X, 100XAbertura Numérica:Capacidad de captar rayos luminosos0,300,651,3010X40X100XLR = K x λ / ANMAYOR ABERTURAMAYOR RESOLUCIÓN

42. MICROSCOPÍADistancia mecánica:- Longitud máxima en mm del tuboMedio de inmersión: (Secos vs. Húmedos)- Presenta un índice de refracción similar al del vidrio- Disminuye la desviación de los rayos de luzEspesor del cubreobjetos:- Grosor máximo de la lámina cubreobjetos2) Ocular- Cilindro hueco con un lente convergente en cada extremo- Amplifica 10 X la imagen, no da resoluciónwww.olympusmicro.com

43. MICROSCOPÍAAumento total = Aumento del Ocular x Aumento del objetivoAumento vacío = Aumento sin resolución

44. MICROSCOPÍAParte Óptica Iluminación3) Condensador y DiafragmaReciben la luz y la enfocan a la platina por medio de lentes

45. Diafragma: Regula la cantidad de luz que pasa a la preparación4) Fuente de luz- Bombillo de halógeno. Ilumina la muestra

46. MICROSCOPÍARecomendaciones al utilizar el microscopio:Coloque el preparado con el cubre objetos hacia ARRIBAUse siempre el objetivo de MENOR aumento primero Use ambos ojos para ver la preparaciónRealice un primer enfoque con el tornillo MACROMETRICOSi desea enfocar aun mas, oriente la región hacia el centro de la lámina

47. MICROSCOPÍAOtros microscopios…b) Campo OscuroUtiliza un filtro en el condensador que evita que los rayos centrales lleguen a lamuestraSolo llegan rayos difractados, indirectos

48. Partículas brillantes sobre un campo oscuro

49. Igual resolución, pero mayor contrasteIMPORTANCIA MÉDICA?

50. MICROSCOPÍAc) Contraste de Fase- Diferente índice de refracción de las estructuras retrasan (desfasan) los rayosDiferencia de amplitudDiferencia de intensidadSe una en células vivas

51. Puede compararse con un rayo de referenciaM. De Interferencia Cuantitativo

52. MICROSCOPÍAd) Luz Polarizada- Orientación molecular de los componentes del material - La luz incidente viaja en un solo plano (polarizador)Birefringente (anisotropa)Divide a la luz en 2 componentesMuestraIsotropa- Diferencia estructuras en base a su refringencia. - Musculo estriado y Cel. De Leydig (testiculo) muestran birrefringenciawww.olympusmicro.com

53. MICROSCOPÍAe) FluorescenciaNaturalFluorescenciaAbsorbe Luz AzulIrradia Luz VerdeColorantes (fluoresceína)Se usan filtros para la λ incidente e irradiada

54. Usos: - Marcaje molecular

55. Estudios celulares

56. InmunologíaPara evitar distorsión de rayos de luz M. Confocal

57. MICROSCOPÍAf) Confocal- Evita la distorsión provocada por los rayos reflejados desde otros planos de corte- Se excluye la luz no emitida por el plano focal- Se coloca un detector con una hendidura en conjunción con el plano focal de la lente- Puede dar imágenes 3D

58. MICROSCOPÍAMicroscopio ElectrónicoSe calienta un filamento de tungsteno (cátodo)

59. Se genera una ΔV entre cátodo y ánodoHaz de electrones(Baja λ)- Se usan bobinas electromagnéticas como guíaMayor ResoluciónLR = 0,2 nmLente condensadoraLente objetivo- Requiere una preparación especialFijadores: Glutaraldehído + Tetraóxido de OsmioDan Densidad ElectrónicaInfusión: Se usan Resinas epoxi plásticasCorte: Cuchillas de diamante. Cortes muy delgados (25-100 nm) Tinción: Metales Pesados. Resaltan la estructura

60. MICROSCOPÍATransmisión (El haz atraviesa la muestra)M. ElectrónicoBarrido (No atraviesa la muestra)Transmisión:Los elementos celulares y la tinción le restan energía a los e-, los cuales chocancon una pantalla fluorescente o placa fotográfica- Su energía cinética se interpreta en relación a las características del tejidoBarrido- Se tiñe la superficie de la muestra con materiales pesados- Los e- chocan contra la superficie y se reflejan, siendo captados y procesados

61. MICROSCOPÍAM. de Efecto TúnelSe coloca una punta afilada a corta distancia de la muestra

62. Se le da voltaje a la punta, creando una ΔV en relación a la muestra (conductor)

63. Se crea un flujo de electrones (túnel)

64. Puede operar en 2 modos: Altura o Corriente constanteM. de Fuerza AtómicaSe coloca una punta pequeña, adherida a una barra flexible (cantilever)

65. La punta experimenta fuerzas de atracción o repulsión con la muestra generando flexiones del cantilever, que son medidas con un laser

66. Se puede estudiar cualquier tipo de muestra

67. LR: 50 pm@LuisalbertoiseaGRACIAS!

78. Tareas