Exposición relacionada a la criopreservación de embriones en el curso de Biotecnología Animal de la Universidad Ricardo Palma.

1. Universidad Ricardo Palma Facultad de Ciencias Biológicas Escuela Académico Profesional de Biología Curso: Taller de Biotecnología Animal Ciclo 2010-I ¿Embriones al freezer? Hidalgo Nicho, Eduardo Alejandro

2. ¿Para qué nos sirve crio-preservar a los embriones? Las ventajas se dan tanto desde el punto biológico como económico

5. Un poco de historia… Smith A. V. (1953) ACP 15% de Glicerol Embriones de conejo Whittinghamet al. (1973) Tº bajas de congelación y almacenamiento.

6. Protocolos de embrio-congelación Congelación ultrarápida o Vitrificación Descenso térmico lento Disminuye concentración de CPA (Etilenglicol) Congeladores Programables Congelación lenta Descenso térmico lento Disminuye concentración de CPA (PROH, DMSO y glicerol) Congeladores Programables Supervivencia del 78% Rev. Colombiana de Obstetricia y Ginecología Vol. 57 No. 4 • 2006 • (291-300)

7. Congelación lenta 1.5 M PrOH + 0.2 M sucrosa 0.5 M PrOH 1. Colocar al embrión por 5 min. Preparar 0.5 mL de PBS + 20 % de suero + 0.2 M de sucrosa 1.0 M PrOH 2. Colocar al embrión por 5 min. 1.5 M PrOH 3. Colocar al embrión por 5 min. Bajar la Tº 1Cº/min hasta los -7ºC (mantener por 10 min) Bajar la Tº -0.3Cº/min hasta los -35ºC (Luego bajar rápidamente hasta los -50ºC – 150ºC) Inmersión en N líquido Para la descongelación se prepara PBSs + 0.2 M sucrosa, PBSs + 0.1 M sucrosa, y medio de cultivo + suplemento de suero. Prepararbañomaría a 30ºC. Retirarembrión de N líquido, esperar 30s y someterlo al bañomaría. Finalmente, cultivarlos a 37ºC.

8. Método Original de Whittingham Roa N. et al. Revista científica FCV-LUZ. 1998. 40-52

9. Vitrificación 1. Mórula compacta Seleccionar embriones 2. Blastocito temprano 3. Blastocisto extendido Equilibración del embrión en la pajuela, en una solución crioprotectora del 50% (v/v) ó 4-6M aprox., durante 2-5 min., dependiendo del tipo de célula, concentración de crioprotector y temperatura durante el tratamiento. Inmersión en Nitrógenolíquido y almacenamiento

10. Fertilidad y Reproducción asistida 2009; cap. 49 c

11. La vitrificación en algunos grupos Mukaida T, et al. Hum Reprod 2006; 21:3 246-52.: La vitrificación de balstocistosmejoransi se hacecolapsarartificialmente la cavidadblastocélica antes de la vitrificación

12. c Método de Vitrificación Roa N. et al. Revista científica FCV-LUZ. 1998. 40-52

13. Tasa de embarazo in vivo producidas por diferentes protocolos de crio-preservación c c c c c c c F. Guignotet al. Theriogenology 66 (2006) 1004–1011

14. Protocolos de embrio-congelación La congelación de embriones puede ser realizada en diferentes estadios de desarrollo, teniendo cada uno diferentes tasas de sobrevida, así como también ventajas y desventajas. La eficiencia de un programa de congelación es evaluada por la observación de laintegridad morfológica del embrión en descongelación, la habilidad de clivarin vitro y su capacidad de implantación. Rev. Colombiana de Obstetricia y Ginecología Vol. 57 No. 4 • 2006 • (291-300)

15. Los principales factores que afectan la congelación y almacenamiento de los embriones

16. 1. Tipo de concentración y los componentes crio-protectores 2. Formación de hielo

17. Fotografíacriomicroscópica del oocito de ratónsuspendido en 1 M MeSO4 y enfriado a -32ºC/min.

18. 3. Tasa de enfriamiento 4. Temperatura de almacenamiento 5. Tasa de descongelación 6. Tasa de dilución y temperatura

19. Exposición del embrión a los CPA Se trata de evitar la formación de los cristales de hielo Existe una deshidratación parcial

20. 6% de solución de glicerol. (A) 0.1 8C/min, (B) 1 8C/min, (C) 10 8C/min, y (D) 100 8C/min y puesto en N líquido. Leibo, SP: Theriogenology69 (2008) 37–47

21. Scherzer, J et al.: ReprodDomAnim43 (2008) 371–376

22. Cálculo de la pérdida de agua en un oocito de ratónsuspendido en 1M de MeSO4 y enfriado a Tº bajo cero. Leibo, SP: Theriogenology69 (2008) 37–47

23. Efecto de los crio-protectores permeables en el embrión de equino MedVet 2001; vol. 18 (9): 527-546.

24. Efecto de los crio-protectores permeables + no permeables en el embrión de equino MedVet 2001; vol. 18 (9): 527-546.

25. Luego de la crio-preservación viene la descongelación… El tiempo de descongelación, varía según el método de congelación

26. Protocolo de Descongelación de la C.L.

28. La crio-preservación de diferentes especies Bovinos: La tasa de preñez son del 80-90% ccon respecto a las obtenidas con embriones frescos control Ovinos y caprinos: Los resultados son similares al anterior Equinos: Experimentan una mejor respuesta a la vitrificación. Faltan más experimentos. Seidel GE, Theriogenology, 65 (2006): 228-235.

29. Porcinos Presentan una elevada sensibilidad a la Crio-preservación Existe una remoción de lípido Esakiet al, BiolReprod, 71: 432-437, 2004

31. Información adicional de la Exposición