Este documento trata sobre los biomarcadores del envejecimiento reproductivo y ovárico. Explica las teorías del envejecimiento como el declive de la telomerasa, el reloj biológico y los radicales libres, y cómo afectan a la fertilidad con la edad. También describe biomarcadores como la FSH, la AMH, y la Inhibina B para evaluar la reserva ovárica, y cómo sus niveles cambian con la edad prediciendo la calidad ovárica y la respuesta a la estimulación.

1. Envejecimiento reproductivo Dra. Marta Cortelezzi Evaluación de la reserva ovárica Sociedad Argentina de Endocrinología Ginecológica y Reproductiva

2. AGING Es un proceso natural y progresivo de cambios estructurales y funcionales que ocurren con el paso del tiempo,en ausencia de enfermedad conocida. Para algunos autores comienza con la pérdida de la función reproductiva. El comienzo de la función reproductiva(Pubertad) y el fin de la misma ( menopausia) no ocurren a una edad determinada. Ambos son periodos dinámicos

3. Envejecimiento ovárico Calidad ovocitaria Número de ovocitos Disminución de la fertilidad Maturitas. 1998 Oct 12;30(2):205-14

4. Early ovarian ageing . Nikolaou D, Templeton A. Disminución acelerada de la reserva ovárica MENOPAUSIA 13 años Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2004 Apr 15;113(2):126-33. 45 32 10 % de las mujeres experimentan Envejecimiento Precoz del ovario Factores genéticos Estilo de vida Eventos intrauterinos

6. Aunque la reserva ovárica declina con la edad es una función biológica y no solo cronológica EDAD CALIDAD OVOCITARIA

7. Screening en pacientes de riesgo: genético, quimioterapia, radioterapia, cirugía pelviana, infección o enfermedad tubaria, endometriosis severa, tabaquismo Biomarcadores de reserva ovárica Realizar en la 3° década de la vida

9. Reserva ovárica según FSH Tasa de Embarazo % 25 15 10 5 < 15 15 – 24,9 >25 Scott et al. 1989 Nacidos vivos 758 pacientes que realizaron FIV

10. FSH Fertil Steril. 2003 Nov;80(5):1156-61. FSH Valor predictivo de reserva ovárica Cantidad de ovocitos

11. Grupo 1 Ciclos 20-29 años

12. Grupo 2 Ciclos 30-39 años

13. Grupo 3 > 44 años

14. Inhibina A, Inhibina B y FSH Marcadores directos e indirectos

16. AMH es producido por la cél. de la granulosa de folículos preantrales y antrales. Los niveles séricos de AMH correlacionan significativamente con el Número de folículos antrales (r = 0.77; P < 0.01) y el número de ovocitos captados (r = 0.57, P < 0.01). Juega un importante rol en la regulación del crecimiento del folículo ovárico. AMH podría ser usado como un marcador de envejecimiento ovárico. Hum Reprod. 2002 Dec;17(12):3065-71 Gruijters MJ, Visser JA, et al AMH sérico es un buen candidato como marcador de reserva ovárica. Presenta una expresión estable durante el ciclo menstrual. Mol Cell Endocrinol. 2003 Dec 15;211(1-2):85-90. Serum anti-Mullerian hormone levels: a novel measure of ovarian reserve. Van Rooij IA, Broekmans FJ, et al

17. Test de Clomifeno Administración de 100 mg/día de Citrato de Clomifeno desde el 5º al 9 º día del ciclo. Medición de FSH en día 3 y 10

18. P < 0.02 P < 0.02 P < 0.0001 50 40 30 20 10 0 mUI / ml Reserva adecuada Reserva disminuida LH basal Respuesta LH FSH basal Respuesta FSH Navot et al Lancet, 1987

19. Marcadores bioquímicos en el proceso de envejecimiento Dra. Marta Cortelezzi Sociedad Argentina de Endocrinología Ginecológica y Reproductiva

20. El envejecimiento es un proceso UNIVERSAL- NATURAL – PERMANENTE DINAMICO - IRREVERSIBLE INEVITABLE - MULTIFACTORIAL PROGRAMADO Incluye cambios : Progresivos, graduales, acumulativos y deletéreos a nivel biológico,corporal, psíquico y social.

21. Teoría de la telomerasa : Geron Corporation La telomerasa no se expresa en las células somáticas , ( se reprime en en la vida embrionaria luego de la l2 a 20 sem) Se expresa en las células germinales y transitoriamente en las células madre de los órganos hemopoyéticos , del epitelio intestinal, del folículo piloso y en los linfocitos T del sistema inmune. Se expresa en las células cancerigenas. Repara y reemplaza los telomeros regulando el reloj que controla la división celular. 1. Fossel,M.:J.A.M.A. 1998;279:1732-35

22. Teoría del Reloj Biológico : Dr. Hayflick and Dr. Moorehead , 1962 Cada célula tiene un RELOJ BIOLOGICO. Los cambios ocurren en la membrana, organelas y material genético.

23. Teoría de los Radicales Libres: Son moléculas reactivas inestables que tienen un electrón libre altamente reactivo, capaz de adherirse a las membranas celulares y de combinarse con algunos metabolitos químicos, interfiriendo con los procesos de intercambio celular , lo que hace que los tejidos se vuelvan menos resistentes , y que se acorten los ciclos vitales de los mismos. Es la más difundida y aceptada. L a Medicina Natural puede ejercer una influencia benéfica contundente . R. Gerschman ,1954 ; Denham Harman , 1956 Los radicales libres atacan las membranas celulares. Presencia de cuerpos de inclusión pigmentados, que representan productos de desecho intracelular : L ipofuscinas. . Depósitos en cerebro, pulmón, corazón y piel Interfiere con la habilidad de las células para comuni carse, reparar y reproducirse. Provocan disturbios en la síntesis de DNA, RNA y de proteínas, disminuye los niveles energéticos y destruye complejos enzimáticos necesarios en procesos químicos vitales.

24. Teoría del uso-abuso : Las células de nuestro cuerpo se dañan por estar expuestos por años a incontables toxinas producto de la mala alimentación y del medio ambiente. Algunos factores: Químicos (tóxicos ambientales, tabaco, alcohol,cafeína, tratamientos agresivos,) Físicos ( radiaciones, rayos UV del sol, calor, frío) Biológicos ( bacterias, virus, parásitos,) Emocionales (stress, traumas psíquicos) Nutricionales ( grasa, hidratos de carbono) Modificaciones inmunológicas y hormonales Dr. August Weismann, 1882 A medida que envejecemos perdemos la abilidad de reparar el daño. TEORIA DEL DESGASTE Las células producen mas residuos de los que puede eliminar apropiadamente. Las toxinas se acumulan e interfieren con el normal funcionamiento celular llevandola a la muerte. TEORIA DE LA ACUMULACION DE RESIDUOS

26. Sugiere que las células se dividen un número limitado de veces aproximadamente 50 veces, luego paran y simplemente mueren. Eventualmente después de la última división no habría suficiente información en el DNA disponible para completar otra división. Relac a Teoría genetica, radicales libres, Cross linking o neuroendocrina The Hayflick Limit Theory of Aging Leonard Hayflick Es importante enlentecer la tasa de división celular para poder vivir mas. La dieta y estilo de vida pueden lograrlo

27. Teoría del Entrecruzamiento de las Micro-fibrillas (Cross Linking) o Teoría de la Glicosilación: Al producirse cambios moleculares en la producción de proteínas, se afecta la fabricación del tejido de sostén, (las micro-fibrillas de elastina y colágeno se orientan de una manera diferente a la de los tejidos normales. Con la edad el Nº de entrecruzamientos aumenta y además dificultan el paso de los nutrientes entre células. Johan Bjorksten,1942.

30. Teoría Inmunológica: Con el avance de la edad, el sistema inmunológico (defensivo) se vuelve menos eficiente, y como resultado de esa menor capacidad de reconocimiento y respuesta ante un agente patógeno se producen reacciones auto-inmunes (auto-agresión) Mayor incidencia de patología autoinmune

32. BIOMARCADORES DEL ENVEJECIMIENTO

33. SEROTONINA DOPAMINA NORADRENALINA Disminución del pico de melatonina y aumento del nadir del Cortisol Reiter et al, 1976 Pineal y eje adrenal sufren cambios significativos con la edad y juegan un rol importante en los sistemas adaptativos del organismo Ferrari et al

34. Melatonina Deterioro selectivo del pico nocturno de melatonina, con ritmo circadiano aplanado.Alteración del sueño La amplitud de los pulsos de melatonina están claramente afectados. Se adelanta el pico nocturno Experimental Gerontology Volume 35 Issue 9 –10 , December 2000, Pages 1239-1250 Podría contribuir al aumento de la secreción de cortisol

35. A medida que avanza la edad el Eje adrenal es menos resilente en respuesta al stress y menos sensible al feed back negativo que ejercen los glucocorticoides Cambios en la esteroidogénesis adrenocortical: Aumento de cortisol y Disminución de androgenos Adrenal Reducción de receptores a glucocorticoides y alteración en los mecanismos que regulan el eje Hipotalamo - Hipofisis-adrenal (HPA) Mann et al

37. ADRENOPAUSIA Caída de los niveles de DHEA y S- DHEA Disminución de la capacidad de síntesis de la corteza adrenal Zona Reticularis 5 17- 20 demolasa Sulfotransferasa

38. Experimental Gerontology Volume 35 Issue 9 –10 , December 2000, Pages 1239-1250 Los niveles de DHEA y DHEA-S son generalmente mas altos en hombres que en las mujeres en la juventud. Pico máximo en la década de los ’20. En el envejecimiento se equiparan, disminuyen 2% por año. Tanto los valores en el pico nocturno como en el nadir son significativamente mas bajos. Se pierde el ritmo con pulsos de menor amplitud.

39. Cortisol/ DHEA aumenta con la edad Alteración del SISTEMA INMUNE TH1/ TH2 Autoinmunidad Deterioro neurocognitivo Depresión Aumenta el catabolismo Ateroesclerosis e Insulino resistencia

40. Somatopausia Disminución de los valores de la HGH Disminución lo pulsos de HGH con menor amplitud (frecuencia conservada) Disminución de la respuesta a GHRH Disminución de la respuesta a la hipoglucemia Sugiere que el envejecimiento se asocia con: Disminución en la cantidad de GHRH liberada. Disminución del nº de Receptores hipofisarios al GHRH Aumento del tono de la somatostatina Los niveles plasmáticos de HGH disminuyen progresivamente a partir de la 4ta década,.

41. FIGURE 1. Circadian profile of serum cortisol (before and after DXM), GH, and plasma melatonin in healthy young ( open triangles ) and elderly ( closed circles ) subjects, and in patients with DAT ( open circles ). Annals of the New York Academy of Sciences 917:582-596 (2000) La GH se produce en mayor cantidad durante el período de sueño y se secreta en forma de pulsos de amplitud y frecuencia regulares. El ritmo circadiano de HGH muestra la ausencia del pico nocturno fisiológico (inducida por sueño), con picos diurnos alterados en el envejecimiento. Las alteraciones del sueño, caracterizadas por la desaparición de las fases 2 y 3 no REM del sueño. Se ha observado en ancianos que los picos máximos de HGH se expresan en las hs previas al sueño y aún con luz natural.

43. PRL Aumento de la actividad del PIF (prolactin inhibidor factor) y por ende caída del nivel plasmático de la prolactina Se observan valores disminuidos por la noche

44. Neuroendocrine rhythms and sleep in aging men A. van Coevorden, J. Mockel, E. Laurent, M. Kerkhofs Bélgica Am J Physiol Endocrinol Metab 260: E651-E661, 1991 Cortisol normal, pero con amplitud reducida de los pulsos. TSH y HGH diminuyen marcadamente. PRL y Melatonina disminuyen durante la noche solamente. El aumento circadiano de cortisol, TSH y melatonina ocurren 1-1.5 h mas temprano. Se observa disminución en la amplitud de los pulsos y no de la frecuencia de lo mismos. 8 H 67-84 años vs 8 H 20-27 años

45. Laboratorio en el diagnóstico de las alteraciones tiroideas y prolactínicas Dra. Marta Cortelezzi Sociedad Argentina de Endocrinología Ginecológica y Reproductiva

47. HIPOTIROIDISMO Frecuencia de pulsos de GnRH Amplitud pulsos de GnRH SHBG Andrógenos libres Folículo retrasado en su crecimiento Alteración de la esteroideogénesis ovárica Alteración del metabolismo de Andrógenos y estrógenos Secresión de P=O

48. HIPOTIROIDISMO SHBG HIPERTIROIDISMO SHBG

49. El dosaje de T3 no aporta demasiado al diagnóstico. La presencia de anticuerpos antitiroideos tiene gran valor predictivo de una disfunción autoinmune tiroidea, aún con TSH basal normal. La ausencia de anticuerpos antitiroideos con TSH basal normal con prueba de TRH/TSH patológica orienta a la posibilidad de una disfunción tiroidea Subclínica. (30% de los pacientes) Sospechar en pacientes con hiperPRL, dislipemias, retraso puberal, trastornos del ciclo, infertilidad, esterilidad, depresión. HIPOTIROIDISMO

50. TSH y Anti TPO ATG

51. Dada la alta prevalencia de hipotiroidismo subclínico encontrada en la población general, es posible que este rango de referencia utilizado (0,4-4,5 uUI/ml) esté incluyendo este grupo de pacientes con enfermedad tiroidea oculta, y dado que el 95% de la población eutiroidea estudiada rigurosamente tiene valores entre 0,4 y 2,5 uIU/ml, sería indicado bajar el límite superior del rango de referencia. Demers LM, Spencer CA. NACB: Laboratory Support for the Diagnosis and Monitoring of Thyroid Disease. Thyroid: 2003; 13(1):33-44

52. Valor Delta entre la respuesta máxima y el basal y así distinguen tipos de respuesta. PLANAS: Menor de 3.0 uUI/ml SUBNORMAL: Mayor de 3.0 y Menor de 4,5 uUI/ml NORMAL: Mayor de 4,5 y Menor de 25 uUI/ml HIPERRESPUESTAS: Mayor de 25 uUI/ml PRUEBA TRH/ TSH

53. La ausencia de anticuerpos antitiroideos con TSH basal normal con prueba de TRH/TSH patológica orienta a la posibilidad de una disfunción tiroidea Subclínica. ( 30% de los pacientes) La presencia de anticuerpos antitiroideos tiene gran valor predictivo de una disfunción autoinmune tiroidea, aún con TSH basal normal.

54. Los anticuerpos antitiroideos estarían asociados al riesgo aumentado de aborto más que a la disfunción tiroidea per se. Glinoer y col Los anticuerpos antitiroideos reflejan una activación no específica del SI y serían marcadores independientes de mayor riesgo de pérdida gestacional aún en ausencia de otros anticuerpos. Pratt y col Estos anticuerpos podrían interferir con la actividad de las hormonas placentarias . Antitiroideos + : 20 - 30% de ARE

56. ALTERACION DEL CICLO ESTUDIO DE LA FUNCION TIROIDEA LEVE SEVERA INFERTILIDAD Dosaje de TSH ATPO T4 NORMAL CONTROL ATPO + TSH > 4,5 Prueba de TRH/ TSH NORMAL < 25 TRATAMIENTO ANORMAL >25 ATPO + TSH >2,5

57. PROLACTINA

58. FARMACOS QUE AFECTAN A LA PROLACTINA Reserpina Imipramina AlfaMetil- Dopa Aminotripterilina Estrógenos Anticonceptivos orales Sulpirida Cimetidina Fenotiazida Neurolépticos Haloperidol Opiaceos Metoclopramida Domperidona Alucinógenos Clorpromazina Prostaglandinas Barbitúricos Antagonistas dopaminergicos Anfetaminas IMAO Cocaína

60. HIPERPROLACTINEMIA FISIOPATOLOGIA Extrahipotalámica SNC HIPOFISIS OVARIO HIPOTALAMO GnRH FSH Altera Pulsatilidad GnRH Interfiere con la acción de LH y FSH LH Inhibición del Feed back + Disminuye la producción de P=O

61. HIPERPROLACTINEMIA Alteraciones del eje adrenal Estimula el eje adrenal con posible aumento de DHEA-S por aumento en la sulfoquinasa. Inhibición de la 5 alfa reductasa Disminución de SHBG

62. Diversidad de acciones biológicas Variantes moleculares de PRL Sinha Y, Endocr Rev 16:354-369, 1995

65. FORMAS MOLECULARES DE PRL en suero MONOMERICA : 23 Kd ( VR: 50 - 85% ) BIG : 50-60 Kd , dímero de PRL, PRL glicosilada ( VR: 5-25% ) polimeros de PRL (VR: 10-20%) BIG BIG : 100 - 170 Kd , complejo IgG-PRL ( VR: 9-30% )

66. VARIANTES MOLECULARES DE PRL Son responsables de la falta de correlación clínico-bioquímica en pacientes. Existe casi un 30 % de pacientes sin sintomatología que presentan PRL aumentada : Hiperprolactinemias silentes y cerca de un 15 – 20 % de mujeres con galactorrea que tienen PRL normal

67. MACROPROLACTINA Inmunocomplejo de PRL de alto PM 100- 170 Kd Está presente en ambos sexos y en niños También durante el embarazo Baja afinidad por el Receptor de PRL Baja Actividad Biológica. Mayor vida media Debido a su alto PM no es capaz de atravesar la pared de los capilares sanguíneos. Larrea F y col JCEM,1989

68. 18 – 42 % de las HIPERPROLACTINEMIAS son MACROPROLACTINAS Fahie-Wilson M, Soule S 1997 Ann Clin Biochem 34:252–258 Olukoga A, Kane J 1999 Clin Endocrinol 51:119–126 Leslie H, Courtney C, Bell P, 2001 . J Clin Endocrinol Metab 86:2743–2746

69. PRECIPITACION CON PEG 250 ul de suero del paciente con 250 g/l de PEG 6000 (en Agua guardada a 4ºC), se mezcla durante 1 min con un vortex y centrifugar durante 5 min a temp ambiente a 9500 g. En el sobrenadante se mide la concentración de PRL y se calcula la Recuperación sobre la base de los valores séricos previos a la precipitación. PEG permite separar la forma libre del inmunocomplejo

70. VIEIRA y Col Mayor o igual a 65%: PRL MONOMERICA Mayor de 60% Menor o igual a 35%: MACROPRL Menor de 40% 35- 65% CROMATOGRAFIA 40 – 60 % A > recuperación > PRL nativa < MACROPRL PRECIPITACION CON PEG RECUPERACION NIVEL DE CORTE: 40%

72. PRECIPITACION CON PEG Es una técnica inespecífica para separar inmunocomplejos, de fácil realización, poco costo rápida y eficaz. Correlaciona con la cromatografía en sephadex G100. Es considerada un método de Screening. Existen interferencias del PEG en algunas técnicas de inmunoensayo. Es importante remarcar que la reactividad de la macroPRL varía con las diferentes marcas comerciales disponibles hoy en día.

74. Metodología diagnóstica del Sindrome de PCO Sociedad Argentina de Endocrinología Ginecológica y Reproductiva Dra. Marta Cortelezzi

76. La aceleración del generador de pulsos de GnRH representa un defecto intrínseco y evidencia su instalación pre-puberal. Bebes de bajo Peso al nacer ADRENARCA EXAGERADA PCO

78. Marcadores bioquímicos de PCO

79. Aumento en la frecuencia y amplitud de los pulsos de LH. Bioactividad de LH 3 veces superior en PCO. LH Bioactiva/inmunoreactiva aumentada. LH a expensas de Isoformas mas básicas

80. DHEA-S A4 Androstenodiona E1 PROANDROGENOS T=O E2 Aromatasa Camino metabólico

81. Andrógenos T=O aumentada es el mejor marcador hormonal(70%) A4 Androstenodiona aumentada. (53%) T=O y A4 Androstenodiona 80 % de VALOR DIAGNOSTICO

82. MARCADOR DE ORIGEN ADRENAL DHEA-S

83. T=O libre + T=O unida a la Albúmina: T=O BIODISPONIBLE

84. Metabolismo de los Andrógenos T=O DHT=O TESTOSTERONA 5  REDUCTASA 3  Diol glucurónido Hígado Piel

86. HOMA Mayor de 2 - 2,5 Glucosa/18 x Insulina 22,5 RI Correlaciona con el Clamp euglucémico

87. Se realiza la prueba en ayunas a las 8 hs. Se realizan extracciones de sangre en el BASAL, 30’, 60’ 120’ y 180’ post ingesta de 75 g de Glucosa diluida en 250 cc de líquido a tomar en 10´- 20’, sin dieta previa. Con dosajes de Glucemia e Insulina en todos los tiempos Según OMS: Glucemia: < 140 mg/dl a las 2 hs Insulina : < 100 uU/ml a las 2 hs Test de tolerancia oral a la glucosa

88. SHBG como marcador de Insulino resistencia Se sugiere su utilidad en pacientes no obesas con PCO. Valor de corte: 35 nmol/L Ventaja: Baja variación biológica intraindividual Un valor bajo de SHBG está asociado con mayor riesgo de ECV y sería un marcador de riesgo independiente para desarrollar Diabetes tipo 2 Se lo propone como Marcador integral de IR

89. Cintura > 88 cm - 80 cm Tg > 150 mg/dl HDL < 50 mg/ml Glucosa : >110 mg/dl-100mg/dl PA 130/85 SINDROME METABOLICO Se deben reunir 3 o mas NCEP - ATP III 2001

90. Inclusión de marcadores de alteración del metabolismo lipídico y tromboembolítico IMPORTANTE ¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡

91. Laboratorio 1- Aspecto del suero Colesterol Total TG LDL HDL 2- APO B Predicción de Hiperapobetalipoproteinemia Colesterol LDL/ APO B Estimativo de LDL pequeña y densa Indicador de la cantidad de partículas aterogénicas +

92. Should C-Reactive Protein Be Added to Metabolic Syndrome and to Assessment of Global Cardiovascular Risk? Paul M Ridker, Circulation. 2004;109:2818-2825. PCR de alta sensibilidad tiene alto valor predictivo de riesgo cardio – vascular. Insulin resistance in patients with polycystic ovary syndrome is associated with elevated plasma homocysteine Morey Schachter . Human Reproduction, Vol. 18, No. 4, 721-727, April 2003 Aumento de riesgo independiente para enfermedad oclusiva arterial y trombosis venosa. PAI 1 Es un factor de riesgo independiente para la enfermedad cardiovascular. Sobel et al, 1996

93. Diagnóstico temprano Aunque muchas preguntas quedan por resolver, queda claro que cambios dietarios y de estilo de vida pueden reducir el riesgo de complicaciones en un número considerable de mujeres Kiddy et al ., 1992; Clark et al ., 1995; Huber-Buchholtz et al ., 1999; Moran et al ., 1999, 2003. Inclusión de marcadores de alteración del metabolismo lipídico y tromboembolítico