El documento describe la técnica de electroforesis o cataforesis. Se explica que es el movimiento de moléculas cargadas en un campo eléctrico, que se puede usar con fines analíticos o de separación. La migración depende de la carga neta y masa de las moléculas, moviéndose hacia el electrodo de carga opuesta. La electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) es una técnica ampliamente usada para separar proteínas.

1. Electroforesis o cataforesis
• Es el movimiento de moléculas o partículas
cargadas en un campo eléctrico
• Se puede realizar con propósitos analíticos de
identificación o para caracterización física de
los componentes de una muestra o para su
separación preparativa.
• Se usa para analizar y separa moléculas (ej.
proteínas) o para depositar recubrimientos,
como en los elementos usados en los tubos de
electrones.

2. Electroforesis o cataforesis
• La migración electroforética de una molécula
puede realizarse dentro de cualquier medio
pero generalmente es una matriz.
• Si el fluido es el que se pone en movimiento,
por ejemplo a través de un diafragma fijo, se le
llama electroósmosis.

3. Movimiento de moléculas en la
electroforesis
• Las moléculas siempre se mueven hacia el
electrodo de polaridad opuesta a la carga
neta de la molécula (los cationes se mueven
hacia el cátodo y los aniones hacia el
ánodo).
• El medio necesita estar amortiguado al pH
que produce la dirección y taza apropiada
de migración.

4. Electroforesis
cátodo
–
(–)
–
–
+
++
–
– –
(+)
ánodo

5. Movilidad y pI
• Las movilidades de las proteínas se
incrementan proporcionalmente al
alejamiento de sus puntos isoeléctricos ya
que se incremente su carga neta.
• Los ácidos nucleicos y las proteínas en
presencia de SDS presentan movilidades
más altas en un rango de pH arriba de la
neutralidad.

6. Factores que afectan la movilidad
electroforética
• Composición del solvente
– Presencia de detergentes
•
•
Temperatura
Fuerza iónica
– Ejemplos: la estabilidad de los ácidos nucleicos
depende de los iones Na+
– Las proteínas se agregar a bajas fuerzas iónicas
– Altas fuerzas iónicas pueden sobrepasar la disipación
de calor de Joule del aparato de electroforesis

7. Invención
• El primer aparato sofisticado de
electroforesis fue desarrollado por Tiselius
en 1937
• Desarrolló la “moving boundary”, que se
convertiría en la electroforesis zonal y la
utilizó para separar proteínas del suero.

8. Arne Wilhelm Kaurin Tiselius
(1902-71)
• Tesis (1930): The moving-boundary
method of studying the
electrophoresis of proteins"
(publicado en Nova Acta Regiae
Societatis Scientiarum Upsaliensis,
Ser. IV, 7, No. 4)
• (1937) A new apparatus for
electrophoretic analysis of colloidal
mixtures. Transactions of the
Faraday Society, 33 524.

9. Tubo de Tiselius
Ánodo
Cátodo
–
+
Amortiguador
Límite o
frontera
ascendente
Fronteras
iniciales
Moléculas de
proteína
Límite o
frontera
descendente

10. Desarrollo
• La electroforesis se desarrollo
completamente de los años 40s a los 50s.
• Se utilizó para separar moléculas que van
desde las proteínas más grandes,
aminoácidos y hasta iones inorgánicos.

11. Aplicaciones
•
•
•
•
•
•
•
•
Bioquímica
Química clínica, forense, de alimentos
Toxicología
Farmacia, farmacología
Enzimología, inmunología
Microbiología,
Botánica, citología,
Biología Molecular, etc.

12. Electroforesis zonal
• Empleando geles de sílice o de acetato de
celulosa y aplicando las proteínas en una
zona estrecha en torno a los electrodos se
pueden determinar diferencias de carga neta
entre proteínas (carga total/masa).
• Este método se denomina electroforesis
zonal.

13. • Además de la electroforesis zonal, se desarrollaron
dos otros tipos:
– Isoelectoenfoque e isotacoforesis.
• Estos tres métodos se basan en propiedades físicas
diferentes.
• Es posible hacer tres análisis separados sobre una
misma muestra o los métodos se pueden combinar.

14. Diversificación de soportes
• Los soportes o matrices sobre los que se ha
realizado la electroforesis se ha diversificado
durante el tiempo de desarrollo de la
electroforesis.
• Se ha observado que diferentes matrices dan
diferentes ventajas para diferentes tipos de
muestras.
• Algunas matrices utilizadas han sido geles de
polímeros, papeles o capilares.

15. Papel
• Fue el primer soporte usado en las técnicas
de electroforesis desarrolladas para separar
compuestos (Tiselius, 1937).
• Es fácil de usar porque no se requiere
preparación de la matriz.
• Es limitada su capacidad resolutiva.
• En 1957, Kohn usó acetato de celulosa
como medio de soporte.
Kohn, J., A cellulose acetate supporting medium for zone
electrophoresis, Clin. Chim. Acta, 2, 297, 1957.

16. Almidón
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• Smithies usó un gel de almidón como
medio para electroforesis en 1955.
Smithies, O., Zone electrophoresis in starch
gels: group variations in the serum proteins of
normal human adults, Biochem. J., 61, 629,
1955.

17. Capilares
• Jorgenson y Lukacs utilizaron capilares
como matrices para la electroforesis a
principios de los 1980's.
Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D. Anal. Chem., 53, 1928, 1981.
Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D., Science, 222, 266, 1983.

18. Poliacrilamida
• En 1959 Ornstein/Davis y Raymond y
Weintraub utilizaron geles de
poliacrilamida.
Ornstein, L. and Davis, B. J., Disc Electrophoresis,
Distillation Products Industries (Division of Eastman Kodak
Co.), 1959.
Raymond, S. and Weintraub, L., Acrylamide gel as a
supporting medium for zone electrophoresis, Science, 130,
711, 1959.

19. Velocidad de migración
• Es proporcional a la relación entre las
cargas de la proteína y su masa.
• Cuanto mayor carga por unidad de
masa más rápida será la migración.

20. Velocidad y movilidad de las
moléculas en una electroforesis
EQ
V=
Movilidad =
F
µ = V
E
=
Q
F
V, velocidad
E, campo eléctrico
Q, carga neta
F, coeficiente de fricción

21. Poliacrilamida
• Los geles de poliacrilamida se forman
por la polimerización de la acrilamida
por acción de un agente formador de
enlaces cruzados (“cross-linking”), la
bis-acrilamida.

22. Reacción de polimerización
• La reacción se desencadena por la presencia de un
iniciador y se continua con ayuda de un
catalizador.
– El iniciador es el ion persulfato (S2O8-) que se añade en
forma de persulfato amónico (APS).
– Como catalizador se suele utilizar TEMED (N,N,N,N'tetrametilendiamina).
– En algunas situaciones, como por ejemplo en el
isoelectroenfoque en el que la presencia de persulfato
puede interferir con la electroforesis se emplean otros
sistemas catalizador-iniciador.

23. Oxígeno y polimerización
• El oxígeno es un inhibidor de la polimerización de
la acrilamida, por lo que
• Las soluciones de acrilamida se desgasifican para
que la polimerización sea completa y a con buena
velocidad.
• Además, durante la polimerización se libera calor
(reacción exotérmica), lo que podría provocar la
formación de burbujas en el seno del gel.

24. • La velocidad de polimerización es
proporcional a la concentración de
persulfato
(iniciador)
y
TEMED
(catalizador) adicionados.

25. • La porosidad del gel la determina las proporciones
relativas de poliacrilamida y bis-acrilamida
• Es menor el poro cuanta más bisacrilamida vs. acrilamida
se use.
• El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina
el rango de separación del gel.
• Los geles se denominan en función del % de
acrilamida/bisacrilamida que contienen.
• La mayoría de las proteínas se separan bien en el rango 5 a
15%. Un menor porcentaje (mayor tamaño de poro) es
mejor para separar proteínas de gran tamaño.

26. Radicales libres en la
polimerización de la acrilamida
S2O8=
SO4 .
Sulfato radical libre
=
O
SO4 . + CH2= CH C NH2
Acrilamida
O
=
Persulfato
CH2 CH C
.
NH2
Acrilamida radical libre

27. Enlace acrilamida - bisacrilamida
O
CH2 C
C
CH2 CH CH
2
O
CH2 CH2
C O
C
C
CH2 CH2 C
CH2
CH2
CH2
O

28. Estructura de la poliacrilamida

29. Ventajas de los geles de
poliacrilamida
•
•
•
Químicamente inertes,
Transparentes
Estables en un amplio rango de pH,
temperatura y fuerza iónica.

30. CH2
N
(CH2)n
CH2
(CH2)n
CH2
CH2
(CH2)n

31. Relaciones %T y %C
%T = a
+
m
%C =
b
+
a
b
b
X 100%
X 100%
a = acrilamida (g)
b = N,N’-metilenbisacrilamida
m = volumen final (ml)

32. • C, es crítica si es menor a 10 los geles son
rígidos y opacos si excede 100 en geles con 5
% de acrilamida son pastosos y se rompen.
• Geles elásticos y completamente transparentes
se obtienen con C de 30 y con acrilamida
superior al 3%

33. • No hay gelificación si la acrilamida es
menor al 2% y la Bis menor a 0.5%.
• Para que los geles sean elásticos la
concentración de bisacrilamida debe
disminuir. Puede usarse la fórmula :
C = 6.5 - 0.3T
en un rango de 5-20% de acrilamida

34. • Las proteínas presentan una carga
eléctrica neta si se encuentran en un
medio que tenga un pH diferente al de
su punto isoeléctrico y por eso tienen la
propiedad de desplazarse cuando
encuentran en un campo eléctrico.

35. Electroforesis nativa
• Las proteínas se someten a una migración sin
desnaturalización.
• Las proteínas migran en función de su carga, de su tamaño
y de su forma.
• Se mantienen, en ciertos casos, las interacciones entre
subunidades y entre proteínas.
• Los sistemas amortiguadores (tampón) usados son :
– tris-glicina (rango de pH 8.3 a 9.5),
– tris-borato (rango de pH 7.0 a 8.5) y
– tris-acetato (rango de pH 7.2 a 8.5).

36. Electroforesis desnaturalizante
• Somete a las proteínas a migración
asegurando su desnaturalización completa
(pérdida de la estructura tridimensional).
• La migración es proporcional a la carga y al
tamaño de la molécula pero no a su forma.
• El agente desnaturalizante más empleado es
el detergente dodecilsulfato de sodio o SDS.

37. Sistemas de amortiguadores
• Se puede realizar empleando sistemas de uno o más
amortiguadores de pH, se habla entonces de sistemas
amortiguadores continuos o discontinuos.
• En los sistemas discontinuos el amortiguador del primer
gel asegura la migración de todas las proteínas en el frente
de migración, provocando la acumulación de todas las que
se han cargado en el pozo.
• La separación realmente comienza a partir del momento en
el que el frente de migración alcanza la frontera del
segundo tampón.

38. PAGE
• La electroforesis de proteínas en geles en una
matriz de poliacrilamida es denominada
electroforesis en poliacrilamida o PAGE,
(“PolyAcrilamide Gel Electrophoresis”).
• Es una de las técnicas más ampliamente usada
para caracterizar mezclas complejas de proteínas.
• Es un método conveniente, rápido y económico a
nivel de muestra, pues se requieren sólo
cantidades del orden de microgramos de proteína.

39. PAGE -SDS
• Su nombre significa Electroforesis en geles
de poliacrilamida que se realiza en
presencia de SDS (“SDS-polyacrilamide gel
electrophoresis”).
• PAGE-SDS es la electroforesis de proteínas
más ampliamente usada.
• Descrita por Laemmli (1970, Nature,
277:680)

40. PAGE -SDS
• Electroforesis desnaturalizante
• Las muestras se desnaturalizan por calor en
presencia de agentes desnaturalizantes:
– beta-mercaptoetanol, destruye los puentes
disulfuro,
– SDS, desnaturaliza y recubre a la proteína y se
separan como cadenas polipeptídicas aisladas.

41. PAGE -SDS
• Se emplea un sistema de dos tampones
(discontinuo).
– Permite la separación de volúmenes
relativamente grandes de muestra sin pérdida de
resolución.
– La concentración se produce por isotacoforesis
de la muestra en el primer gel ('stacking').

42. PAGE -SDS
• El efecto de estrechamiento de las bandas se basa
en que:
– los iones glicinato, cargados negativamente de manera
incompleta (en el amortiguador superior) tienen una
movilidad electroforética inferior que los complejos de
proteínas-SDS,
– Estos complejos, a la vez, tienen menor movilidad que
los iones Cl- del amotiguador de muestra en el gel de
compactación (“stacking”).

43. PAGE -SDS
• Cuando se someten las proteínas a el campo
eléctrico todas las especies deben migrar a la
misma velocidad para mantener el circuito
eléctrico.
• Los iones glicinato sólo se pueden desplazar a la
misma velocidad que los iones Cl- si hay una
región de con un gradiente de alto voltaje.
• El gradiente es inversamente proporcional a la
conductividad que es a su vez proporcional a la
concentración.

44. PAGE -SDS
• El resultado es que las tres especies de interés ajustan sus
concentraciones de forma que [Cl-] > [proteína-SDS] >
[glicinato-].
• Como sólo hay una pequeña concentración de proteínaSDS este complejo se concentra en una banda muy delgada
entre las fronteras de migración del Cl- y del glicinato-.
• Cuando el glicinato- alcanza el borde del gel de separación
adquiere una carga mayor en el nuevo medio, debido al pH
superior, e incrementa su movilidad.
• A partir de ese momento la interfase entre el glicinato- y el
Cl- deja atrás a los complejos de proteína-SDS que se

45. SDS
• Otros nombres, Dodecilsulfato de sodio, laurilsulfato de sodio.
• Detergente aniónico
• Desnaturalizante
• Se une a las cadenas polipeptídicas con una
relación de 1.4 g de SDS por g de proteína,
aproximadamente una molécula de SDS por cada
dos aminoácidos de la cadena.

46. SDS
• La unión masiva de moléculas de SDS bloquea la
carga propia de la molécula de proteína
• Le confiere al complejo una carga neta negativa
proporcional a su masa.
• Todas las proteínas acomplejadas con SDS viajan
hacia el ánodo.

47. SDS
• La separación de los complejos SDS-proteína es
– proporcional sólo a la masa de la proteína pues todas
tienen la misma carga por unidad de masa.
• Se puede determinar el peso molecular aparente de
cualquier proteína por comparación con un patrón
de proteínas de pesos moleculares conocidos.
• Las movilidades de las proteínas en los geles de
SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo
de su peso molecular.

48. Inicio de la PAGE discontinua
Al inicio de la
electroforesis, las
muestras se colocan
en un pozo. El
volumen puede ser
variable en cada
muestra aunque la
cantidad de proteína
debe ser constante.
Reserva de amortiguador
Tris-glicina, pH 8.3
Muestra
Tris-HCl, pH 6.8
Gel de
compactación
Tris-HCl,
pH 6.8
Gel de
resolución
Tris-HCl,
pH 8.8
+
Reserva de amortiguador
Tris-glicina, pH 8.3

49. Compactación (“stacking”)
El primer gel o gel de
compactación
(“stacking”) es de
mayor poro (menor
porcentaje de
acrilamida+bisacrilamid
a) y tiene un pH más
ácido que el segundo
gel.
Las proteínas
se focalizan
(compactan)
formando una
banda delgada

50. Separación en el gel resolutivo.
El segundo gel, o
gel de resolución,
es el que realmente
separa a las
proteínas. Presenta
un poro menor y
un pH de 8.8.
Proteínas
fraccionadas en el
gel de separación
Frontera
Glicina/cloruro

51. Relación entre la movilidad electroforética y la masa
molecular (PAGE-SDS)
Logaritmo de la
Masa molecular
kDa
200
100
50
40
30
20
0
0
2
4
0
0.16 0.33
6
8
10
12
0.5
0.66
0.8
1
Movilidad electroforética (cm)
Movilidad relativa

52. Geles en gradiente
• El uso de geles de poliacrilamida que tienen un
gradiente creciente de concentración de
acrilamida+bisacrilamida, y en consecuencia un
gradiente decreciente en el tamaño de poro,
pueden tener ventajas sobre los geles de
concentraciones uniformes de acrilamida.

53. Características de los geles en
gradiente.
• Generalmente los gradientes se establecen entre el 3 y el
30% de acrilamida en gradientes lineales o cóncavos.
• El rango a emplear dependerá del tamaño de las proteínas
a separar.
• En un gel en gradiente la proteína migra hasta que alcanza
una zona donde el tamaño de poro impide cualquier
avance.
• Una vez se alcanza el “límite de poro” no se produce una
migración apreciable aunque no se detiene completamente.

54. Ventajas
• Resuelve mejor las bandas pues las
concentra en regiones muy estrechas.
• Incrementa el rango de pesos moleculares
que se pueden resolver en un mismo gel
comparado con los de una concentración
fija.

55. Preparación de gradientes
• Los geles en gradiente se preparan mezclando las
soluciones de acrilamida de las concentraciones
extremas en un formador de gradientes.
• Se suele adoptar la inclusión en la solución de
polimerización de glicerol o sacarosa para
aumentar la densidad de las soluciones y evitar las
mezclas en el proceso de preparación del
gradiente.

56. Formadores de gradientes
Cóncavos
Lineales

57. Estructura de la Agarosa

58. Tipos de EF
• Electroforesis el geles en gradiente
• Electroforesis Anódica (proteínas acidicas o
neutras)
• Electroforesis catódica (proteínas básica)
• PAGE-SDS
–
–
–
Websert y Osborn (fosfato)
(O’Farrel)
Anderson y Anderson

59. Isolectroenfoque
• Denominada electroenfoque o isofocalización
• Se basa en el desplazamiento de las moléculas en un
gradiente de pH.
• Las moléculas anfotéricas, como los aminoácidos, se
separan en un medio en el que existe una diferencia de
potencial y un gradiente de pH hasta que encuentran su pH
isoeléctrico.
• La región del ánodo (+) es ácida y la del cátodo (-) es
alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal
que las moléculas que se han de separar tengan su punto
isoléctrico dentro del rango.

60. Movilidad en un gradiente de pH
• Las sustancias que se encuentran inicialmente en regiones
de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas
positivamente y migrarán hacia el cátodo,
• Las que se encuentren en medios con pH más bajos que su
pI tendrán carga negativa y migrarán hacia el ánodo.
• Al alcanzar la región donde el pH coincidirá con su pI,
tendrán una carga neta nula (forma un zwiterion) y se
detendrán.
• De esta forma las moléculas anfotéricas se sitúan en
estrechas bandas donde coincide su pI con el pH (se
focalizan).

61. • En esta técnica el punto de aplicación suele no ser crítico
pues las moléculas siempre se desplazarán hacia la región
de su pI (aunque existen excepciones).
• La capacidad de resolución es de 0.01 unidades de pH.
• El gradiente de pH estable entre los electrodos se consigue
usando una mezcla de anfolitos (anfolinas) de bajo peso
molecular cuyos pI cubren un rango preestablecido de pH.
• Los anfolitos suelen ser ácidos poliamino policarboxílicos
alifáticos sintéticos y son comercializados en mezclas que
cubren determinados rangos de pH.

62. Detecciones específicas
•
•
•
Carbohidratos
Transferencia electroforética
Tinción de Plata