El documento describe el procedimiento de Southern blot, el cual implica la digestión del ADN con enzimas de restricción, la separación de los fragmentos a través de electroforesis en gel de agarosa, la transferencia de los fragmentos a una membrana, y la detección de secuencias específicas usando sondas de ADN marcadas.

1. Lic. Eugenia Grisolia

2. Southern Blot
En este procedimiento, el
DNA es aislado de cada
fuente y luego digerido
con una enzima de
restricción específica

3. Los fragmentos de restricción del
son depositados en un gel de agar
para se separados de acuerdo a s
tamaño.
Los fragmentos se hacen visibles con
Bromuro de etidio.

4. El DNA es luego transferido del
gel que es bastante frágil a una
membrana o filtro de nylon

5. * Fragmentos de ácidos nucleicos ADN
ARN
*Marcados con algún elemento que les permite revelar mediante
una señal su presencia
* Puede cumplir su tarea como sonda debido a que tiene la
capacidad de unirse a fragmentos complementarios
eventualmente presentes en la muestra que se desea analizar
.
Definición Básica
Sondas de Acidos Nucleicos

6. El uso de las sondas se basa en el descubrimiento (década del 60)
es posible hibridar ácidos nucleicos en función de la complementariedad de sus secuencias
de nucleótidos
Sondas de Acidos Nucleicos
La doble cadena del ADN
ha sido abierta
(desnaturalizada)
la sonda se va uniendo por reconocimiento de las bases complementarias.

8. Luego la sonda marcada
es agregada.
La sonda se unirá a los
segmentos complementarios
del DNA.
Observe que el DNA blanco no
se encuentra en el organismo B

9. Para detectar la posición de la sonda marcada, la membrana de nylon es cubi
Por una película de rayos X, donde las posiciones se hacen visibles.

10. Inicialmente *mediante el aislamiento de fracciones de ácidos nucleicos naturales
que luego se marcaban.
*Mediante inserción de un fragmento de ácido nucleico en el ADN de
un vector, por ejemplo un virus, el cual, al reproducirse, reproduce
también el fragmento de interés.
Surgió así el método de producción de sondas por:
a) inserción de fragmentos de ADN en vectores que por sus características
permiten obtener gran cantidad de ADN con las características deseadas,
b) la separación posterior (optativa) del inserto,
c) el marcado del mismo
En la actualidad *resulta posible sintetizar oligonucleótidos (grupos de entre quince y
cuarenta nucleótidos colocados de acuerdo a un orden conocido) que se
pueden marcar mientras son producidos.
Preparación de las sondas

11. Se pueden clasificar las sondas en : - "calientes" cuando se utiliza productos radiactivos
- "frías” cuando no se utilizan productos radioactivos
Las marcas difieren en el tipo de señal que proveen:-radiactiva,
-coloreada,
-Luminosa
tipo de unión entre el elemento que da lugar a la señal
y el fragmento de ácido nucleico.
Formas de marcaje de la sonda

12. Autorradiografía
ADN
Sondas “Calientes”
* Isotopos Radioactivos tanto de emisión alfa como beta:
tritio, fósforo-32, azufre-35 o iodo-125
Isotopo radioactivo

13. Sondas “Frías”
Actualmente existen diversas alternativas no radiactivas para marcar las sondas,
1) enzimas (peroxidasa o fosfatasa que llevan a cabo una reacción detectable )
2) marcadores de afinidad (biotina o digoxigenina, que se van a unir
posteriormente a otra molécula)
3) moléculas Quimioluminiscentes Y Fluorescentes (que producen luz y puede
excitar una película fotográfica).

14. Procedimiento: Blotting
Inmovilización de los ácidos nucleicos sobre una membrana
Transferencia o Blotting
ADN
Southern blot

15. Muestra Extracción y
desnaturalización
del ADN
Gel de Agarosa
Transferencia del ADN a
filtro de nitrocelulosa
Revelado por
autorradiografía
Solución de Sonda