Informe

1. Informe taller de Electroforesis
Objetivos generales:
● Abordar los contenidos correspondientes al movimiento electroforético y las técnicas
derivadas vinculadas con la tarea profesional.
● Desarrollar las habilidades técnicas relativas al uso de los equipos de electroforesis
en mesada, comunicación y análisis de resultados.
● Separar e identificar los aminoácidos constituyentes de una mezcla mediante la
técnica de electroforesis en papel.
Materiales y métodos
Según guía de actividades de electroforesis, bloque de electromagnetismo, de la cátedra de
Física, Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires,
correspondiente al 2° cuatrimestre de 2018.
● Condiciones de trabajo: Buffer fosfato (pH 7,6) concentración 7 mM, 300 V y tiempo
de corrida de 20 min. En la figura 1 se puede observar el equipo para electroforesis
en papel usado: el volumen total de buffer utilizado fue de 400 mL y se distribuyó
equitativamente en las 2 cubas correspondientes.
Figura 1. Equipo para electroforesis en papel
Resultados:

2. Figura 2. Resultados de la corrida electroforética realizada bajo condiciones de Buffer
fosfato 7 mM (pH 7,6), 300 V y tiempo de corrida de 20 min. (M representa la muestra a
separar e identificar, Asp corresponde al testigo de ácido aspártico, His al testigo de
histidina y Lys al testigo de lisina)
Discusión
El objetivo principal del presente taller consistió en la separación de una mezcla de
aminoácidos y la identificación de los mismos, esto se logró empleando como método
separativo la electroforesis en papel. Cabe destacar que el fundamento de dicho método se
basa en que una partícula que tiene una carga eléctrica (cuya magnitud depende del pH del
medio en el que se encuentran) puede interaccionar con un campo eléctrico
experimentando una fuerza eléctrica y una fuerza resistiva que al igualarse ocasionan que
esta migre a una velocidad constante. Esta movilidad electroforética, correspondiente a la
velocidad por unidad de campo, al depender de distintos factores como temperatura, pH y

3. fuerza iónica permite separar distintas partículas en función a la migración diferencial de las
mismas.
Continuando con lo anteriormente planteado se tiene que los aminoácidos presentes en la
mezcla a separar son anfolitos, es decir, su carga varía dependiendo del pH del medio, las
especies anfóteras presentan un pH en el cual la carga neta de la molécula es neutra (cero)
y se denomina punto isoeléctrico (PI). Se tiene entonces que a valores de pH menores del
PI, la molécula protonada se encontrará en mayor proporción, por lo que el compuesto
migra hacia el cátodo; mientras que a valores de pH mayores que el PI se encontrará en
mayor concentración la molécula con carga negativa, por lo que migrará hacia el ánodo.
Debido a que inicialmente se suponía que la mezcla de aminoácidos podría contener ácido
aspártico, histidina y/o lisina, se seleccionaron las condiciones óptimas para realizar su
separación. Teniendo en cuenta el punto isoeléctrico de las moléculas (ver anexo de
cálculos) se eligió como buffer de corrida el de fosfato cuyo pH es de 7,6, esto implica que
en la corrida electroforética la histidina al tener un PI de 7,59 no migrará ya que a dicho pH
la molécula tiene carga neta nula (0) y por lo tanto no puede interaccionar con el campo
eléctrico.
Por otra parte, se tiene que en el caso de la lisina cuyo PI es 9,74 migrará hacia el cátodo
puesto que dicha molécula se encontrará cargada positivamente (forma catiónica
predominante) al pH del buffer de corrida, por lo que se observará que su movilidad es
negativa con respecto a la línea de siembra. En cuanto al ácido aspártico, al tener un PI de
2,77 este migrara hacia el ánodo debido a que dicho aminoácido se encontrará cargado
negativamente (forma aniónica predominante) en el pH del buffer de fosfato, lo cual implica
que su movilidad es positiva con respecto a la línea de siembra.
Teniendo en cuenta las migraciones planteadas para cada uno de los aminoácidos que se
sospechaba que se encontraban en la mezcla se determinó que el buffer de fosfato era
ideal para la separación de los mismos, puesto que uno de los aminoácidos no se mueve
mientras que los dos restantes se desplazan en sentidos contrarios, obteniéndose así una
separación adecuada. Además se optó por fijar la línea de siembra de las muestras en la
mitad del papel de electroforesis teniendo en consideración los sentidos de migración de los
aminoácidos para aprovechar correctamente la superficie de la corrida.
Lo planteado con anterioridad se pudo evidenciar en los resultados obtenidos (ver figura 2),
en donde se puede observar que la migración electroforética corresponde a lo que se
esperaba teóricamente para el buffer seleccionado, también se debe mencionar que se
observó un leve efecto electroendosmótico, generado por las cargas negativas del soporte
que producen un movimiento de las partículas del solvente el cual se manifiesta como un
error sistemático que se hace evidente como un desplazamiento neto de todas las
partículas hacia el cátodo, independientemente de cual sea su carga. Este efecto se pudo
notar puesto que se evaluó la migración de que el testigo de histidina, que al ser neutro se
esperaba que no tuviera desplazamiento (puesto que no interacciona con el campo
eléctrico), y sin embargo presentó un desplazamiento hacia el cátodo. Se debe destacar
que para los fines del taller este efecto experimental no afecta los resultados obtenidos
puesto que el objetivo sólo suponía la separación e identificación de los aminoácidos

4. Por otra parte, se empleó el buffer de fosfato con una concentración de 7 mM, lo cual
implica que se trabajó en condiciones donde la fuerza iónica (cantidad de iones presentes
en la solución de corrida) era relativamente baja, esto favorece la movilidad electroforética,
puesto que se evita el apantallamiento de la carga efectiva de los aminoácidos, por lo tanto
y tal como se observó experimentalmente, las muestras sembradas migraron
adecuadamente y se puede afirmar que se logró separar satisfactoriamente la mezcla de
aminoácidos.
Además se puede mencionar que dada las condiciones de trabajo en las que se realizó la
corrida electroforética se obtuvieron resultados favorables en la separación de los
aminoácidos, puesto que al usar un voltaje de 300 V se logra una intensidad considerable
del campo eléctrico que actúa sobre las partículas cargadas y por lo tanto la distancia
recorrida por estas es mayor que si se emplea una diferencia de potencial inferior. En
cuanto al tiempo de corrida se puede mencionar que al dejarla transcurrir durante 20
minutos, se logra tener una mayor distancia recorrida que si se hubiese hecho la corrida en
un tiempo menor.
Dado que se quería lograr la identificación de los aminoácidos presentes en la mezcla, se
hizo necesario el uso de testigos de identidad conocida con el fin de comparar su movilidad
electroforética con los aminoácidos de la mezcla y de esta forma corroborar la identidad de
los mismos. Por ello se sembraron además testigos de Histidina, Lisina y Ácido aspártico
junto con la muestra, y comparando su posición (distancia recorrida) en el papel revelado
(ver figura 2) se puede decir que la mezcla contenía los 3 aminoácidos mencionados con
anterioridad, debido a que las migraciones electroforéticas de estos coinciden con las de
los aminoácidos testigos.
Conclusión
Se logró separar efectivamente los aminoácidos de una mezcla empleando la técnica
separativa de electroforesis en papel y los aminoácidos separados fueron identificados
como Histidina, Lisina y Ácido aspártico gracias a la comparación de su migración
electroforética con muestras testigos de identidad conocida.
Anexo de cálculos
1. Estructura de los aminoácidos de la mezcla: