La producción máxima de la proteasa activa en frío de Stenotrophomonas malthophilia MTCC 7528 ocurre a las 120 horas de incubación a 20°C y pH 9, produciendo 62.2 unidades/ml de enzima. Esta proteasa purificada muestra un pH y temperatura óptimos de actividad que permiten su aplicación potencial en la industria de detergentes para lavar a bajas temperaturas.

1. Optimización de la producción de
una proteasa alcalina
extracelular activa en frio de la
Stenotrophonoma malthophilia
MTCC 7528 y su aplicación en la
industria del detergente.
Vázquez Sánchez Jorge

2. INDICE
• Resumen
• Introducción.
• Enzima proteasa.
• Microorganismo y sus Enzimas.
• Aplicación
• Materiales y métodos
• Producción de la proteasa y ensayo enzimático.
• Optimización de las condiciones de fermentación.
• Efecto del tiempo de incubación.
• Extracción y purificación de la proteasa.
• Caracterización bioquímica de la proteasa purificada
• Efecto del pH y la temperatura
• SDS-PAGE y Zimograma .
• Compatibilidad Enzimática
• Resultados y discusión.
• Conclusiones

3. Resumen
• Los Biodetergentes son mas utilizados, que los
detergentes sintéticos convencionales en vista de
que sus propiedades de limpieza son mejores ,
además que favorecen un menor gasto energético
y tienen menos residuos contaminantes.
• los biodetergentes derivados de organismos
mesófilos/termofilos y también los detergentes
sintéticos a base de peróxido requieren una alta
temperatura para una optima actividad. Por lo
tanto, las enzimas activas en frio son muy útiles, ya
que funcionan a menores temperaturas y no
requieren un alto aporte energético.

4. Introducción
• Biodetergentes

5. Enzima Proteasa
• Proteasas :son enzimas que catalizan la hidrólisis
de enlaces peptídicos de las proteínas.
Grupo 3: Hidrolasas
Catalizan reacciones de hidrólisis y también su reverso. Son las más comunes en
el dominio de la tecnología enzimática:
A-B + H2O A-OH + H-B

6. Microorganismo y sus Enzimas
• Microorganismos adaptados al frio
• Enzimas activas en frio

7. La aplicación
Reducción de temperatura y reducción de los
tiempos de procesamiento

8. Materiales y métodos
• Las especies microbianas y el cultivo
• La bacteria Stenotrophomonas maltophilia

9. Producción de la proteasa y ensayo
enzimático
El sobrenadante se utilizo para el ensayo

10. Optimización en las condiciones de
fermentación

11. Efecto del tiempo de incubación e
incubación con agitación en el crecimiento
y producción de la proteasa (15±2°C).

12. Extracción y purificación de la
proteasa

13. Columna DEAE
pH de un buffer

14. Purificación y caracterización de la
proteasa

15. Cromatografía de intercambio iónico de
DEAE-celulosa de sulfato de amonio
Precipitada y dializada se aplicó a una columna (3x12 cm) equilibrada en acetato de
sodio tampón (0,02 M, pH 5). La elución se realizó con gradiente de NaCl 0,1 a 1 M. El
material removido de la columna (fracción de 0,6 M) se concentró para su posterior
aplicación

16. Caracterización bioquímica de la
proteasa purificada
• Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad de proteasa y la
estabilidad
• Buffers
• Fosfato de citrato(pH5-6)
• Fosfato de sodio(pH 7)
• Tris-HCl (pH 8)
• Glicina-NaOH (pH 9-11)

17. Efecto del pH y la temperatura
sobre la actividad de la proteasa y
estabilidad
84% DE LA ACTIVIDAD TOTAL DE LA ENZIMA
Actividad máxima
Relativamente estable
Proteasa pedobacter cryoconitis
Stenotrophonoma malthophilia
Temperatura optima y 100% de la actividad de la enzima

18. SDS-PAGE y ZIMOGRAMA
Materiales y reactivos para Protocolo Zimograma

19. Resultados y discusión
• Optimización de la producción de enzimas y
efectos del tiempo de incubación.
•
• Se observo el patrón de crecimiento y producción
de enzimas de 168 Hrs en los medios de
producción de la proteasa 15 +(-) 2 0C(pH 7)
• Producción de proteasa
Máxima (49 U/ml) a 120 Hrs de incubación

20. Efecto de la temperatura de
incubación y el pH de los medios de
cultivo
Los Resultados indicaron
• Producción con alta cantidad de enzima
 15 a 250 C
Fines industriales.
• Máxima producción de enzima
 62.2 u/ml pH 9 a 120 hrs incubación 200 C

21. Efecto de la temperatura y pH en la
producción de la proteasa
Alta cantidad de enzima
Producción máxima de enzima

22. Efecto de la agitación y diferentes
sustratos
• Producción de enzimas por agitación
18.2 a 45.7 u/ml
• Uso de sustrato
• Producción máxima con caseína (52.4 u/ml)
Leche descremada (46.6 u/ml)
BSA (37.6 u/ml)
Albumina de huevo (26.3 u/ml)

23. Efectos de iones metálicos
• Cu 2+ (126.8%).
Producción de enzimas reforzada
• Cr 2+ (134.6%).
• Co 2+ (43.5%)….(- producción)
• Hg2+, Cd 2+ , Zn 2+ no tiene efecto significativo

24. Estabilidad de la proteasa con
detergente y lavado análisis de
rendimiento a baja temperatura

25. Conclusiones
• Producción máxima de la proteasa a las 120 hrs
de incubación
49(U/ml)
• Producción máxima de la proteasa a 200C
 56.2 U/ml
• Máxima producción de enzima
 62.2 u/ml pH 9 a 120 hrs incubación 200 C

26. Cont.
• Mejor Sustrato para la enzima adaptada al frio
Leche descremada (46.6 u/ml)
• Iones metálicos
Cu 2+ (126.8%).
Cr 2+ (134.6%).

27. Bibliografía
• Production optimization of an extracellular cold-active alkaline protease
from Stenotrophomonas maltophiliaMTCC 7528 and its application in
detergent industry (Mohammed Kuddus1* and Pramod W. Ramteke).
• P. Secades and J. A. Guijarro