Este documento presenta un protocolo para identificar microorganismos contaminantes en cultivos vegetales mediante tinción y microscopía. El protocolo incluye la tinción de Gram para bacterias y tinción con azul de metileno para hongos usando muestras contaminadas, seguido de observación microscópica y diagramación de las estructuras identificadas. El documento también proporciona preguntas sobre los fundamentos de las tinciones, microorganismos contaminantes comunes y actividades que contribuyen o disminuyen la contaminación.

1. IED COLEGIO LAS MERCEDEZ COLSUBSIDIO
TÉCNICO EN PRODUCCIÓN BIOTECNOLÓGICA DE MATERIAL VEGETAL
COMPETENCIA: SEMBRAR EL MATERIAL VEGETAL DE ACUERDO CON LOS PROTOCOLOS
PLANTEADOS
ACTIVIDAD DE ENSEÑANZA-APRENDIZAJE: Conocer las características de los
microorganismos contaminantes y su forma de control
PRACTICA DE MORFOLOGÍA MICROBIANA
MARCO TEÓRICO: Uno de los problemas más importantes en el desarrollo de la biotecnología
vegetal y especialmente del cultivo in vitro de células y tejidos ha sido la contaminación
microbiana. Las contaminaciones siguen teniendo un alto índice de afectación, sobre todo en
la fase de multiplicación donde se reportan pérdidas significativas por bacterias, hongos,
levaduras, fitoplasmas y virus. Muchos de estos agentes no ocasionan daños en campo sino
durante el cultivo in vitro, frecuentemente denominados como vitropatógenos. La mayoría de
los métodos empleados con fines de detección son complejos y costosos, reportándose una
gran lista de microorganismos, fundamentalmente bacterias, en muchos cultivos
micropropagados.
MATERIALES Y MÉTODOS:
• Muestras de cultivos contaminados
• Asa recta, asa curva
• gotero
• Laminas, laminillas
• Azul de metileno
• Cristal violeta
• Lugol
• Fucsina básica
• Alcohol
• Microscopio
• Aceite de inmersión o glicerol
• Marcadores de vidrio o lápiz de vidrio
Coloración de Gram Bacterias:
a. Las laminas se deben encontrar en un frasco con alcohol para desengrasarse
b. Deje secar al ambiente las laminas o con una toalla de papel
c. Con el gotero coloque una gota de agua corriente y realice una emulsión de la muestra.
d. Deje secar al ambiente
e. Ya seca marque la lamina con el nombre de la muestra de tal manera que no se borre
cuando realice la tinción
f. Flamee la muestra tres veces
g. Ubíquese en un lavaplatos para realizar la tinción observe que tenga los colorantes a
la mano
h. Cubra con cristal violeta 1 min, lave con agua
i. Cubra el frotis con lugol 1 min, lave con agua
j. Cubra el frotis con alcohol o acetona 30 segundos lave con agua
k. Y por ultimo cubra el frotis con fucsina básica o safranina 1 min y lave con agua, deje
secar al ambiente
l. Ubique la lamina en el microscopio y observe 4x, 10 x y 40 x cuando ya tenga enfocado
en este aumento baje completamente el portaobjetos, abra el portaobjetos, condicione
toda la luz del microscopio agregó una gota de aceite de inmersión sobre el frotis y
enfoque.
m. Recuerde diagrame tanto macro como microscópicamente la muestra en los diferentes
aumentos.
n. Realice lo mismo con una muestra proveniente de su saliva. y correlacione los
resultados, identifique morfologías y tipos bacterianos
Tinción con azul de metileno Hongos:

2. a. Diagrame la muestra que considera que se encuentra contaminada por un agente
fúngico
b. Tome una lamina deje secarla, tome una gota de agua y realice una emulsión con el
material recuperado del medio.
c. Distribuya la muestra homogéneamente sobre la lamina, adicione una gota de azul
de metileno sobre la muestra y luego una laminilla.
d. Limpie los excesos y observe al microscopio, en 4x, 10x y 40 x diagrame la
visualización de cada uno de los aumentos e identifique las estructuras fúngicas y
dibújelas lo más detalladamente.
Cuestionario:
1. Realice una investigación sobre el fundamento de las tinciones empleadas en el
laboratorio
2. ¿Que microorganismos son los mas habituales contaminantes en cultivos in vitro?
¿cuál es su origen?
3. ¿Que actividades contribuyen y disminuyen la contaminación del material
micropropagado?