Este documento presenta 8 prácticas de laboratorio sobre técnicas bacteriológicas para identificar microorganismos. Las prácticas incluyen tinción simple, tinción de Gram, tinción de esporas, tinción indirecta, tinción ácido resistente, morfología colonial, aislamiento e identificación de Staphylococcus y identificación de Streptococcus. Cada práctica describe los objetivos, fundamentos, materiales, procedimientos, observaciones y preguntas para evaluar los conocimientos adquiridos.

1. COMPENDIO DE
PRÁCTICAS
IDENTIFICA MICROORGANISMOS EN BASE A TECNICAS BACTERIOLOGIAS
SEMESTRE AGSTO-DICIEMBRE 2015-08-25
EDNA LETICIA JIMÉNEZ MONZÓN

2. PRACTICA 1
TINCION SIMPLE
Objetivo.- Al término de la práctica el alumno observara al microscopio un frotis
elaborado y bien teñido por él.
Fundamento.- Para poder observar a las bacterias se necesita el microscopio
óptico, por su diminuto tamaño la observación puede ser en fresco o mediante
coloraciones.
Esta última técnica es la más común para lo cual se elaboran preparaciones y
posteriormente teñir a las bacterias que durante el proceso mueren. Una ventaja
es que los colorantes ayudan a distinguir bien una bacteria.
Fundamento alumno
Material y Reactivos
Técnica.- 1.- Lavar muy bien con jabón un portaobjetos y enjuagar con alcohol,
después con agua y secar.
2.- Colocar una pequeñísima gota de agua en el centro del portaobjetos ya
rotulado.
3.- Con un asa esterilizada y fría, tome un poco de la colonia a estudiar.
4.- Mezcle la muestra de la colonia con la gota de agua y forme una película
uniforme y deje secarla cerca del mechero.
5.- Ya seco el frotis fíjelo pasándolo repetidas veces por la llama del mechero.
6.- No olvides esterilizar el asa antes de colocarla en la mesa.
7.- Coloque el colorante y déjelo actuar por 2 min.
8.- Enjuague con agua corriente evitando que el chorro toque el lugar donde está
la muestra y déjelo secar.
9.- Observe con el objetivo 100x y aceite de inmersión y anote sus resultados.
Dibujos
Observaciones
Resultados
Conclusiones
Cuestionario.-
1.- Nombre y dibujo de las distintas formas bacterianas.
2 .- Nombre y dibujo de las distintas agrupaciones de bacterias.
3 .-Escribe el nombre de una bacteria indicando su forma y su agrupación.
4 .-¿Cuál es la utilidad de la fijación?
5.- Cuáles son los tipos químicamente hablando de colorantes.
6.- Cuál es la diferencia entre teñir y pintar.

3. PRACTICA 2
TINCION DE GRAM
Objetivo.- Al término de la práctica el alumno observará e interpretará un frotis
teñido por la técnica de GRAM.
Fundamento.- Las tinciones diferenciales ponen en manifiesto diferencias entre
células bacterianas. Son más elaboradas que la tinción simple. La tinción de
GRAM es de tipo diferencial y el frotis bacteriano se somete a las siguientes
soluciones: cristal violeta, yodo lugol: safranina: alcohol cetona. En esta tinción las
bacterias se dividen en GRAM.+ y GRAM-. Las GRAM + al final de la tinción se
tiñen de color violeta y las GRAM – se tiñen de color rojo.
Fundamento alumno
Material y Reactivos
Técnica.-
1.- Prepare y fije un frotis de la colonia a estudiar.
2.- Cubra el frotis con cristal violeta y déjelo actuar 1min.
3.- Enjuague con agua corriente.
4.- Inmediatamente adicione yodo lugol dejándolo 1 min.
5.- Enjuague con agua corriente.
6.- Decolore con alcohol cetona dejándolo actuar 6 seg.
7.- Enjuague con agua corriente.
8.- Agregar safranina y dejarlo actuar 30 seg.
9.- Enjuagar.
10.-Dejar secar el frotis y observar con el objetivo 100x y aceite de inmersión.
11.- Anotar los resultados en GRAM + ó - .
Dibujos
Observaciones
Resultados
Conclusiones
Cuestionario.-
1.- ¿En qué parte de la célula bacteriana esta la diferencia de una GRAM + ó -?
2.- ¿Qué ocurre a una bacteria GRAM + en cada paso de la tinción?
3.- ¿Qué ocurre a una bacteria GRAM – en cada paso de la tinción?
4.- ¿Cuál es el papel de cada uno de los reactivos de la tinción de GRAM?
5.- Menciona la preparación de los reactivos para la tinción gram.

4. PRACTICA 3
TINCION DE ESPORAS
Objetivo.- Determinar si una bacteria posee o no esporas.
Fundamento.- Además de las tinciones diferenciales es posible teñir una
estructura específica, como por ejemplo las esporas, flagelos, cápsula, núcleo y
pared celular. Las esporas son muy resistentes a la tinción por lo cual se puede
teñir forzando la penetración del colorante a la espora.
Una vez que el colorante penetra es difícil extraerlo. Para aumentar el contraste
entre la espora y la célula se agrega un contra colorante de tal manera que la
espora se tiñe con el colorante primario y la célula se tiñe con el contra colorante.
Fundamento alumno
Material y Reactivos
Técnica.-
1.- Elaborar un frotis de bacilos y déjelo secar (no necesita agua el portaobjetos).
2.- Fíjelo.
3.- Adicione verde malaquita y déjelo actuar 1 min.
4.- Con fuego lento caliente el frotis hasta que empiece a evaporar (evite que
hierva)
5.- Deje enfriar el portaobjetos y lave con agua durante 30 seg.
6.- Contra-tiña con safranina al .5% durante 30 seg.
7.- Enjuague con agua y deje secar.
8.- Observar con el objetivo 100x y aceite de inmersión. La espora se tiñe de
verde y la célula de rojo.
Dibujo
Observaciones
Resultados
Conclusiones
Cuestionario.-
1.-¿Qué es una espora?
2.- Escribe ejemplos de bacterias que formen esporas.
3.-Para 2 bacterias anteriores escribe sus enfermedades.
4.- Qué ventajas representan a una bacteria poseer esporas.
5.- Menciona el nombre de otros colorantes para teñir esporas.

5. PRACTICA 4
TINCION INDIRECTA
Objetivo.- Observarán las esporas bacterianas sin teñir
Fundamento.- A pesar de la microscópica forma de una bacteria con el uso
correcto de las técnicas de tinción es posible observar algunas estructuras
internas de las bacterias.
Para hacer visible alguna estructura aprovechamos sus características tintóriales
por ejemplo las endosporas que son muy resistentes a las tinciones, lo que se
aprovecha para hacerlas visibles.
Fundamento alumno
Material y Reactivos
Técnica.-
1.-Prepare un frotis de bacilos déjelo secar y fíjelo.
2.- Bañe el frotis con cristal violeta y déjelo actuar de 3 a 5 min.
3 .-Enjuague con agua corriente y déjelo secar y observe con el objetivo 100x y
aceite de inmersión.
4.- No olvide que la espora se ve porque no se tiñe.
Dibujos
Observaciones
Resultados
Conclusiones
Cuestionario.-
1.-¿En que consiste la técnica de la tinta china para Cryptococcus neoformans?
2.- ¿Para que sirve la cápsula a un microorganismo?
3.- ¿Qué enfermedades provoca Cryptococcus neoformans?
4.- Menciona otros microorganismos encapsulados.

6. PRACTICA 5
TINCION ACIDO RESISTENTE
Objetivo.- Determinar si un organismo es o no ácido resistente.
Fundamento.- La tinción ácido resistente se llama así debido a al uso del agente
del colorante. Las bacterias ácido resistentes retienen el colorante primario a
pesar del proceso de coloración.
Esta tinción se usa en un agente intensificador que es el calor. Este procedimiento
sirve para identificar las bacterias del genero Mycobacterium. Otro intensificador
es puede ser el fenol o ácido carbólico.
Fundamento alumno
Material y Reactivos
Técnica.-
1.- Realice un frotis de la forma habitual.
2.- Cubra el frotis con carbol fucsina y flamee hasta la emisión de humo blanco.
3.- Mantenga por 5 min. Evitando que se seque o hierva. Si se seca coloque más.
4.- Enjuague con agua corriente
5.- Decolore con alcohol ácido gota a gota hasta que ya no arrastre el color.
6.-Contra tiña con azul de metileno por 1 min.
7.- Enjuague con agua corriente y deje secar.
8.- Observe al microscopio con el objetivo 100x y aceite de inmersión ( si la
bacteria se tiñe roja es ácido resistente y si no es color azul).
Dibujos
Observaciones
Resultados
Conclusiones
Cuestionario.-
1.-¿ A que se le llama BAAR?
2.- Generalidades de la tuberculosis.
3.- Nombre a 4 especies de Mycobacterium y el nombre de la enfermedad que
provoca.
4.-Además de la tuberculosis pulmonar menciona 3 extra pulmonares.
5.- ¿Por qué se llama carbol fucsina el primer reactivo?
6.-¿Qué papel representa cada reactivo en el proceso de la tinción?
7.- Cómo se prepara el alcohol-ácido
8.- Qué otras células se reportan en un estudio BAAR.
9.- Realiza un dibujo de un frotis BAAR positivo indicando sus componentes.

7. PRÁCTICA 6
MORFOLOGÍA COLONIAL
Objetivo.- Determinar distintos tipos morfológicos de colonias microbianas.
Fundamento.- En el laboratorio clínico es necesario identificar a las bacterias
presentes en una muestra clínica. Para identificar una bacteria es necesario reunir
sus datos como por ejemplo; forma, gram, ácido resistencia, temperatura de
crecimiento, y ambiente óptimo. También sus características coloniales como;
forma, tamaño, color, etc.
Fundamento alumno
Material y Reactivos
Técnica.- Para mínimo 10 diferentes tipos de colonias determine; tamaño, color,
forma, elevación, borde y dibujo en color.
Dibujos
Observaciones
Resultados
Conclusiones
Cuestionario.-
1 ¿Qué es una colonia bacteriana?
2.- Describe la morfología colonial de los Estaphylococcus y Streptococcus en
ágar sangre
3.- Describe la morfología colonial de los distintos microorganismos que crecen en
ágar Mc Conkey.
4.- Describe la morfología colonial de los Estaphylococcus en diferentes medios de
cultivo

8. PRÁCTICA 7
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS
Objetivo.- Realizar el aislamiento e identificación de especies de Staphylococcus.
Fundamento.- Los Staphylococcus son comensales superficiales del hombre y de
animales, pueden causar muchas formas de infección. Las bacterias del género
Staphylococcus son patógenas para el hombre y otros mamíferos. Fueron
divididos tradicionalmente en 2 grupos en base de su capacidad de coagular
plasma. Los Staphylococcus coagulasa positiva, la especie más patógena es
aureus. Los Staphylococcus coagulasa negativa abarca 30 especies.
Fundamento alumno
Material y Reactivos
Técnica.-
1.- Siembre por aislamiento con la cepa asignada. Siembra por estría cruzada por
aislamiento de colonias una caja de Brolacin; incubar de 24-48 hrs. A 37 C.
2.- Analizar el crecimiento en Brolacin considerando que Staphylococcus produce
colonia amarillas pequeñas. Realice un frotis de la colonia y teñirlo de acuerdo a la
tinción de gram. Además hacerle una prueba de la catalasa a otra colonia.
3.- Realiza la prueba de la urea; incubando en un tubo con caldo de urea y si
cambia de color a rosa mexicano es positiva.
4.- Realiza una prueba de la coagulasa; se deposita un poco de Staphylococcus
en 0.5ml de plasma de conejo incubando 24hrs a 37 C. La prueba es positiva si el
plasma se coagula
Dibujos
Observaciones
Resultados
Conclusiones
Cuestionario
1.-Escribe las características del Staphylococcus.
2.- Escribe el fundamento de la determinación de la coagulasa.
3.- Escribe el fundamento de la determinación de la catalasa.
4.- Qué otras pruebas se pueden realizar para identificación de Staphylococcus.
5,- Menciona algunas enfermedades que produce el Stap. Y su sintomatología.

9. Práctica 8
STREPTOCOCCUS
OBJETIVO: El alumno identificará el género Streptococcus.
FUNDAMENTO
Los estreptococos son un género de Bacterias Gram positivas, esféricas
pertenecientes al filo Firmicutes y al grupo de las bacterias ácido lácticas. Estas
bacterias crecen en cadenas o pares, donde cada división celular ocurre a lo largo
de un eje. De allí que su nombre, del Griego streptos, significa que se dobla o
retuerce con facilidad, como una cadena. En contraste, los Gram positivos
estafilococos, que se dividen usando varios ejes, forman agrupaciones racimosas
de células. Los Streptococci son oxidasa – y catalasa – negativos.
Las especies de estreptococus que producen enfermedades son:
 Estreptococos del grupo A: Streptococcus pyogenes producen amigdalitis e
impétigo.
 Estreptococos del grupo B: Streptococcus agalactiae producen meningitis
en neonatos y trastornos del embarazo en la mujer.
 Estreptococos del grupo C: Neumococo: Streptococcus pneumoniae es la
principal causa de neumonía adquirida en la comunidad.
 Streptococcus viridans es una causa importante de endocarditis y de
abscesos dentales.
 Streptococcus mutans causa importante de caries dental. Pertenece al
grupo de estreptococos viridans.

10. TÉCNICA
Evaluación Macroscópica
Para este procedimiento hay que tener claras las características que se deben
evaluar, tales como: tamaño, color, aspecto, humedad, forma, bordes, textura,
presencia o no de pigmento, brillo, etc.
Procedimiento:
1. Procede a observar detalladamente las características de las colonias que se
encuentran en el medio de cultivo y toma nota de las mismas.
Tinción de Gram:
Recuerda que esta es una técnica esencial para el diagnóstico microbiológico que
nos permite agrupar a las bacterias en dos grandes grupos.
Procedimiento:
1. Realiza un extendido con la cepa bacteriana en una lámina portaobjetos
fijándola por calor
2. Realiza la tinción de Gram y observa al Microscopio
3. Describe morfología y agrupación
Prueba de la Catalasa
Esta prueba nos permite diferenciar las bacterias capaces de degradar el peróxido
de hidrógeno, de aquellas que no. Se fundamenta en que la bacteria productora
de esta enzima puede sobrevivir a los metabolitos y radicales tóxicos generados
en el proceso de degradación del H2O2, ya que esta sustancia se convierte al final
en agua y oxígeno desprendido en forma de burbujas.
Procedimiento:
1. Coloca en una lámina portaobjetos una gota de peróxido de hidrógeno al 3%
2. Toma con un palillo plano de madera estéril o con el asa estéril una colonia de
la bacteria a ensayar y resuspéndela en la gota de H2O2 al 3%
3. Realiza la observación detallada de la prueba: de aparecer burbujas, se
considerará una reacción positiva.
4. Interpreta los resultados obtenidos.
Prueba de la oxidasa
La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa
que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular
que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana
Procedimiento
Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de
Petri.
Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.
Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado.
La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos.
HEMÓLISIS
Detecta la presencia de hemolisina, enzima que permite la clasificación de los
Streptococcus en alfa (hemólisis parcial, incompleta que torna color verdoso), beta
(hemólisis total) y gamma hemolíticos (no existe hemólisis) .
Muchas otras bacterias, aparte de los Streptococcus, pueden tener esta enzima

11. como B. megaterium; se usa el cultivo para demostrar el grado de hemólisis
(hemólisis beta) en la cual se puede observar claramente por detrás de la
siembra.
Procedimiento:
Observar presencia o ausencia de hemólisis. En caso de que la haya reportar que
tipo de hemólisis es.
Sensibilidad a la Bacitracina
Permite diferenciar estreptococos beta-hemolíticos del grupo A (S. pyogenes), que
son sensibles a bacitracina, del resto de estreptococos beta-hemolíticos que son
resistentes. Solo un porcentaje muy pequeño de Streptococcus de los grupos B, C
y G son sensibles a la bacitracina (Taxo A).
Procedimiento: Se realiza sembrando un gran inóculo, tomado con asa
bacteriológica de un cultivo puro, que se estría sobre una placa de agar sangre en
varias direcciones intentando obtener un cultivo confluente. Luego se coloca el
disco de Bacitracina y se incuba 18- 24 horas a 37º.
Interpretación de resultados: La aparición de cualquier diámetro de halo de
inhibición de crecimiento alrededor del disco se considera prueba positiva.
PRUEBA DE CAMP
Objetivo: Separar Str.agalactiae de los demás estreptococos ß-hemolíticos.
Fundamento: Se basa en que los estreptococos del grupo B producen un factor
llamado CAMP (factor de monofosfato de adenina cíclica) que aumenta la zona de
hemólisis producida por un estafilococo productor de ßlisina.
Procedimiento: Se realiza estriando un cultivo de estreptococo ß-hemolítico en
forma perpendicular a una estría de un estafilococo productor de ß-lisina en agar
sangre. Se incuba 18-24 horas a 37ºC.
Interpretación de los resultados: La prueba positiva se evidencia por la presencia
de una zona de potenciación de la hemólisis en forma de puntas de flecha en el
lugar donde se contactan las dos estrías.
CUESTIONARIO
1.- Mencione las características principales de la Familia Streptococcaceae y del
género Streptococcus.
2.- De acuerdo a qué característica se dividen los Streptococcus. Mencionar las
especies más importantes de cada grupo.

12. PRACTICA 9
IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM POSITIVOS
Objetivo. El alumno será capaz de aislar e identificar a un Corynebacterium de un
Lactobacilo.
Fundamento. Existen diversos géneros de bacilos gram positivos aerobios,
muchos de ellos de importancia médica. De los más importantes géneros son. El
Corynebacterium que es catalasa positiva, oxidasa negativa y se presenta en
empalizada, es móvil, no produce ácido sulfhídrico, no degrada la esculina pero si
fermenta la glucosa en cambio los Lactobacilos son cátalasa negativa.
Fundamento alumno
Material y reactivos
Técnica.-
1.- Sembrar la bacteria asignada en un medio Brolacin (agar sangre).
2.- Buscar colonias opacas tras 24 a 48hrs de incubación de un medio de cultivo
azul.
3.- Realizar; gram, catalasa, oxidasa, y reportar si la bacteria es o no Lactobacilo.
Dibujos
Observaciones
Resultados
Conclusiones
Cuestionario.-
1.- Menciona las especies de Corynebacterium.
2.- Además de difteria que otras infecciones puede causar las Corynebacterium.
3.- Menciona algunas manifestaciones clínicas de la difteria.
4.- Escribe el tratamiento para Corynebacterium.
5.- Escribe como deben de ser los resultados de las pruebas para
Corynebacterium.
6.- Por qué los Lactobacilos son benéficos para el hombre.
7.- Escribe el nombre de otros bacilos gran positivos de importancia médica.