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Ana Ibarra PE-12-2146
• Es un examen para buscar anticuerpos en la
sangre contra un parásito
llamado Toxoplasma gondii.
• Este parásito causa una infección
llamada toxoplasmosis.
• La infección es un peligro para un feto en
desarrollo si una mujer embarazada la
contrae, También es peligrosa en personas
con VIH/SIDA.
La determinación
inmunoenzimatica cuantitativa de
anticuerpos específicos contra
Toxoplasma gondii se basa en la
técnica del ELISA
Las tiras de micropocillos que se
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recubiertas con antígenos
específicos de Toxoplasma gondii.
Los anticuerpos existentes en la
muestra unen a los antígenos
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El conjugado de anticuerpos IgG
anti humano con peroxidasa de
rábano, se une con los complejos
antígeno-anticuerpo en muestras
positivas. Estos complejos
inmunológicos desarrollan una
coloración azul
después de incubarlos con
sustrato de tetrametilbenzidina
(TMB). Finalmente se añade ácido
sulfúrico para detener la reación,
causando un cambio de
coloración de azul a amarillo.
La densidad óptica se mide con un
lector de ELISA a 450nm.
Microtiras (IgG) recubiertas de
antígeno de Toxoplasma gondii:
•12 tiras de 8 pocillos rompibles, recubiertos
con antígenos de Toxoplasma gondii, en
bolsa de alumino.
Diluyente para IgG de la muestra:
•1 botella de 100ml de solución de tampón
para diluir la muestra; pH 7.2 ± 0.2; color
amarillo; listo para ser utilizado; tapa
blanca.
Solución de parada:
•1 botella de 15ml de ácido sulfúrico,
0.2mol/l, listo para ser utilizado; tapa roja.
Solución de lavado (20x conc.):
• 1 botella de 50ml de una solucíon de
tampón 20x concentrado para lavar los
pocillos; pH 7.2 ± 0.2; tapa blanca.
Conjugado IgG anti-humano
(Toxoplasma gondii):
• 1 botella de 20ml de conjugado de
anticuerpos IgG anti-humano con
peroxidasa; color azul; tapa negra.
Solución de sustrato de TMB:
•1 botella de 15ml 3,3’,5,5’-
tetrametilbenzindina (TMB); listo para ser
utilizado; tapa amarilla.
Soluciónes IgG de estándar
(Toxoplasma gondii):
• 4 botellas de 2 ml, listas para ser utilizadas:
•Estándar A: 0 IU/ml; tapa azul
•Estándar B: 50 IU/ml; tapa verde
•Estándar C: 100 IU/ml; tapa amarilla
•Estándar D: 200 IU/ml; tapa roja
Fotómetro con
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• Usar muestras de suero o plasma (citrato) humano.
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sangre, las muestras pueden ser almacenadas de 2...8°C, en caso
contrario hay que congelarlas (-70…-20°C). Agitar bien las
muestras descongeladas antes de diluirlas. Evitar congelaciones y
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• Antes del ensayo:
– las muestras tienen que estar diluidas en realación 1+100 con
el tampón de dilución para la muestra de IgG, p.e. 10µl de la
muestra con 1ml de tampón, mezclar bien con la mezcladora
Vortex.
– Muestras donde se espera una concentración de antitoxinas
más alta de la concentración del estándar D (200 IU/ml) se
tendra que diluir como se describe
– arriba 1+10, en general 20 µl de la muestra diluida + 200µl de
diluente IgG para la muestra (factor de dilución: 11).
1. Pipetear 100 µl de estandardes y
muestras en los pocillos
respectivos.
•Dejar el pocillo A1 para el blanco.
2. Recubrir las tiras con los
autoadhesivos suministrados.
3. Incubar 1 h ± 5 min a 37°C.
4. Después de la incubación, retirar
el autoadhesivo, aspirar el líquido
de la tira y lavarla tres veces con
300µl de la solución de lavado.
Evita el rebosamento de los
pocillos. El tiempo entre cada
lavado y cada aspiración tiene que
ser por lo menos de 5 segundos.
Para sacar el resto del líquido de las
tiras, es conveniente sacudirlas
sobre papel absorbente.
Ojo: El lavado es muy importante!
Un mal lavado provoca una mala
precisión y resultados errónamente
augmentados!
5. Pipetar 100µl de conjugado anti-
IgG (Toxoplasma gondii) en cada
pocillo con excepción del blanco.
Cubrir con una lámina adhesiva.
6. Incubar 30 min a 37°C.
7. Repitir el lavado como en el paso
numero 4.
8. Pipetar 100µl de sustrato
de TMB en todos los pocillos.
9. Incubar exactamente 30
min en oscuridad a
temperatura ambiente
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10. Pipetear en todos los
pocillos 100µl de la solución
de parada en el mismo orden
y mismo intervalo de tiempo
como con el sustrato de TMB.
Toda coloración azul formada
durante la incubación se
convierte en amarilla.
Nota: Muestras que son
altamente positivas pueden
causar precipitados negros
del cromógeno.
Estos precipitados influyen
en los valores de las
mediciones. Se recomienda
diluir las muestras del
paciente con solución salina
1+1.
Después, preparar la muestra
diluida con el tampón de
dilución para la prueba de IgG
1+100. En este caso, el
resultado se multiplica por 2.
11. Medir la extinción de la
solución en cada pocillo con
450/620nm en un periodo de
30 min después de añadir la
solución de parada.
• Efectuar con ayuda del blanco en el pocillo A1 la
calibración al cero del fotómetro (lector de ELISA).
• Para obtener resultados correctos, si la calibración no
es posible por causas técnicas, hay que sustraer el
valor de la extinción de la posición A1 del resto
• Medir la extinción de todos los pocillos con 450nm y
anotar los resultados de los controles y de las
muestras en la hoja de resultados.
• Es aconsejable la medición bicromática a una longitud
de onda de referencia de 620nm.
• Si se efectuaron análisis en duplicado o múltiples, hay
que calcular el promedio de los valores de extinción
de los pocillos correspondientes.
• Para obtener resultados
cuantitativos en IU/ml se
tiene que establecer una
curva estándar con los
valores de extinción (eje y)
de los 4 estándars A, B, C y
D contra sus respectivas
concentraciones (0, 50, 100,
200 IU/ml) (eje x).
• Con esta curva estándar se
pueden ver los resultados
por el promedio de las
extinciones de las pruebas
de los pacientes.
• Las normas para los resultados del ELISA
tienen que estar establecidas con el colectivo
respectivo de los pacientes en el área del
laboratorio.
• Estos son los datos normativos
– Reactivo: >35 IU/ml
– Zona intermedia: 30 – 35 IU/ml
– No-reactivo: <30 IU/ml
Valores normales
Los resultados normales significan que usted
probablemente nunca ha tenido una infección por
toxoplasma.
Los rangos de los valores normales pueden variar
ligeramente entre diferentes laboratorios.
Algunos laboratorios utilizan diferentes
mediciones o analizan muestras diferentes. Hable
con el médico acerca del significado del resultado
específico de su examen.
Valores
anormales
Los resultados anormales significan que usted
probablemente se ha infectado con el parásito. Se
miden dos tipos de anticuerpos, IgM e IgG:
•Si el nivel de los anticuerpos IgM está elevado, usted
probablemente resultó infectado en el pasado reciente.
•Si el nivel de los anticuerpos IgG está elevado, usted se infectó
en algún momento en el pasado.
Los rangos de los valores normales pueden variar
ligeramente entre diferentes laboratorios.
Algunos laboratorios utilizan diferentes
mediciones o analizan muestras diferentes. Hable
con el médico acerca del significado de los
resultados específicos de su examen.
La belleza perece en la vida pero es
inmortal en el arte.
Leonardo Da Vinci
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  • 2. • Es un examen para buscar anticuerpos en la sangre contra un parásito llamado Toxoplasma gondii. • Este parásito causa una infección llamada toxoplasmosis. • La infección es un peligro para un feto en desarrollo si una mujer embarazada la contrae, También es peligrosa en personas con VIH/SIDA.
  • 3. La determinación inmunoenzimatica cuantitativa de anticuerpos específicos contra Toxoplasma gondii se basa en la técnica del ELISA Las tiras de micropocillos que se usan como fase sólida están recubiertas con antígenos específicos de Toxoplasma gondii. Los anticuerpos existentes en la muestra unen a los antígenos inmoblizados de la placa de microtítulación. El conjugado de anticuerpos IgG anti humano con peroxidasa de rábano, se une con los complejos antígeno-anticuerpo en muestras positivas. Estos complejos inmunológicos desarrollan una coloración azul después de incubarlos con sustrato de tetrametilbenzidina (TMB). Finalmente se añade ácido sulfúrico para detener la reación, causando un cambio de coloración de azul a amarillo. La densidad óptica se mide con un lector de ELISA a 450nm.
  • 4. Microtiras (IgG) recubiertas de antígeno de Toxoplasma gondii: •12 tiras de 8 pocillos rompibles, recubiertos con antígenos de Toxoplasma gondii, en bolsa de alumino. Diluyente para IgG de la muestra: •1 botella de 100ml de solución de tampón para diluir la muestra; pH 7.2 ± 0.2; color amarillo; listo para ser utilizado; tapa blanca. Solución de parada: •1 botella de 15ml de ácido sulfúrico, 0.2mol/l, listo para ser utilizado; tapa roja. Solución de lavado (20x conc.): • 1 botella de 50ml de una solucíon de tampón 20x concentrado para lavar los pocillos; pH 7.2 ± 0.2; tapa blanca. Conjugado IgG anti-humano (Toxoplasma gondii): • 1 botella de 20ml de conjugado de anticuerpos IgG anti-humano con peroxidasa; color azul; tapa negra. Solución de sustrato de TMB: •1 botella de 15ml 3,3’,5,5’- tetrametilbenzindina (TMB); listo para ser utilizado; tapa amarilla. Soluciónes IgG de estándar (Toxoplasma gondii): • 4 botellas de 2 ml, listas para ser utilizadas: •Estándar A: 0 IU/ml; tapa azul •Estándar B: 50 IU/ml; tapa verde •Estándar C: 100 IU/ml; tapa amarilla •Estándar D: 200 IU/ml; tapa roja
  • 5. Fotómetro con filtros de 450/620 nm Incubadora/cámara húmeda con termostato Dispositivo de lavado manual o automatico Micropipetas con jeringuillas desechables (10, 100, 200, 1000 µl) Mezcladora Vortex Tubos de plastico desechables Gradilla para los tubos Agua destilada Cronómetro
  • 6. • Usar muestras de suero o plasma (citrato) humano. • Si el ensayo se realiza dentro de 5 días después de la toma de sangre, las muestras pueden ser almacenadas de 2...8°C, en caso contrario hay que congelarlas (-70…-20°C). Agitar bien las muestras descongeladas antes de diluirlas. Evitar congelaciones y • descongelaciones repetidas. • No se recomienda la inactivación por calor de las muestras. • Antes del ensayo: – las muestras tienen que estar diluidas en realación 1+100 con el tampón de dilución para la muestra de IgG, p.e. 10µl de la muestra con 1ml de tampón, mezclar bien con la mezcladora Vortex. – Muestras donde se espera una concentración de antitoxinas más alta de la concentración del estándar D (200 IU/ml) se tendra que diluir como se describe – arriba 1+10, en general 20 µl de la muestra diluida + 200µl de diluente IgG para la muestra (factor de dilución: 11).
  • 7. 1. Pipetear 100 µl de estandardes y muestras en los pocillos respectivos. •Dejar el pocillo A1 para el blanco. 2. Recubrir las tiras con los autoadhesivos suministrados. 3. Incubar 1 h ± 5 min a 37°C. 4. Después de la incubación, retirar el autoadhesivo, aspirar el líquido de la tira y lavarla tres veces con 300µl de la solución de lavado. Evita el rebosamento de los pocillos. El tiempo entre cada lavado y cada aspiración tiene que ser por lo menos de 5 segundos. Para sacar el resto del líquido de las tiras, es conveniente sacudirlas sobre papel absorbente. Ojo: El lavado es muy importante! Un mal lavado provoca una mala precisión y resultados errónamente augmentados! 5. Pipetar 100µl de conjugado anti- IgG (Toxoplasma gondii) en cada pocillo con excepción del blanco. Cubrir con una lámina adhesiva. 6. Incubar 30 min a 37°C. 7. Repitir el lavado como en el paso numero 4.
  • 8. 8. Pipetar 100µl de sustrato de TMB en todos los pocillos. 9. Incubar exactamente 30 min en oscuridad a temperatura ambiente (20...25 C) 10. Pipetear en todos los pocillos 100µl de la solución de parada en el mismo orden y mismo intervalo de tiempo como con el sustrato de TMB. Toda coloración azul formada durante la incubación se convierte en amarilla. Nota: Muestras que son altamente positivas pueden causar precipitados negros del cromógeno. Estos precipitados influyen en los valores de las mediciones. Se recomienda diluir las muestras del paciente con solución salina 1+1. Después, preparar la muestra diluida con el tampón de dilución para la prueba de IgG 1+100. En este caso, el resultado se multiplica por 2. 11. Medir la extinción de la solución en cada pocillo con 450/620nm en un periodo de 30 min después de añadir la solución de parada.
  • 9. • Efectuar con ayuda del blanco en el pocillo A1 la calibración al cero del fotómetro (lector de ELISA). • Para obtener resultados correctos, si la calibración no es posible por causas técnicas, hay que sustraer el valor de la extinción de la posición A1 del resto • Medir la extinción de todos los pocillos con 450nm y anotar los resultados de los controles y de las muestras en la hoja de resultados. • Es aconsejable la medición bicromática a una longitud de onda de referencia de 620nm. • Si se efectuaron análisis en duplicado o múltiples, hay que calcular el promedio de los valores de extinción de los pocillos correspondientes.
  • 10. • Para obtener resultados cuantitativos en IU/ml se tiene que establecer una curva estándar con los valores de extinción (eje y) de los 4 estándars A, B, C y D contra sus respectivas concentraciones (0, 50, 100, 200 IU/ml) (eje x). • Con esta curva estándar se pueden ver los resultados por el promedio de las extinciones de las pruebas de los pacientes.
  • 11. • Las normas para los resultados del ELISA tienen que estar establecidas con el colectivo respectivo de los pacientes en el área del laboratorio. • Estos son los datos normativos – Reactivo: >35 IU/ml – Zona intermedia: 30 – 35 IU/ml – No-reactivo: <30 IU/ml
  • 12. Valores normales Los resultados normales significan que usted probablemente nunca ha tenido una infección por toxoplasma. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Algunos laboratorios utilizan diferentes mediciones o analizan muestras diferentes. Hable con el médico acerca del significado del resultado específico de su examen. Valores anormales Los resultados anormales significan que usted probablemente se ha infectado con el parásito. Se miden dos tipos de anticuerpos, IgM e IgG: •Si el nivel de los anticuerpos IgM está elevado, usted probablemente resultó infectado en el pasado reciente. •Si el nivel de los anticuerpos IgG está elevado, usted se infectó en algún momento en el pasado. Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Algunos laboratorios utilizan diferentes mediciones o analizan muestras diferentes. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen.
  • 13. La belleza perece en la vida pero es inmortal en el arte. Leonardo Da Vinci