Microbiología presentación

2. 81. VALORACIONES MICROBIOLÓGICAS
Q.F. Yolanda Nieto Torres
Analista de Microbiología

3. NOCIONES BÁSICAS DE MICROBIOLOGÍA
Esterilidad y
Endotoxinas
Límite
Microbiano o
Biocarga
Ensayos de
Aptitud
Promoción de
Crecimiento
Valoraciones
Microbiológicas
Trazas de
Antibióticos
Preparación de Medios

4. 81. Valoración microbiológica de antibióticos
La inhibición de la multiplicación de microorganismos sensibles
producida por concentraciones conocidas de una Sustancia de
referencia frente a la inhibición producida por diluciones del
antibiótico que se está valorando.
El microorganismo de ensayo debe ser susceptible al antibiótico a
valorar y el medio de cultivo permitir un crecimiento rápido y
abundante en ausencia del antibiótico.

5. Cilindro placa: Se basa en la difusión del
antibiótico desde un cilindro a través de una
capa de agar solidificado.
Valoración turbidimétrica: Se basa en la
inhibición del crecimiento de un
microorganismo en una solución uniforme
del antibiótico en un medio que favorezca el
crecimiento del mismo.

6. Esquema simplificado de la técnica.

7. Formas farmacéuticas que se realizan
valoración de antibióticos
 Inyectables: Amikacina,
gentamicina,
Colistimetato sódico.
 Cremas: Neomicina,
Nistatina, gentamicina.
 Óvulos: Nistatina
 Materias Primas:
Nistatina, Amikacina,
Gentamicina

9. Valoración de Nistatina en Nystasolona crema
1,prep mues
2,preps st
3, oprep placas
Materiales

10. MÉTODO CILINDRO-PLACA
Inóculos: suspender el
microorganismo en 3mL de
solución salina estéril. Incubar
a 580 nm.
25%T.

11. 1, prep muiest Pesar 1 g de muestra por triplicado.
Disolver con dimetilformamida a Temperatura entre 50-
75 grados C.
Llevar a volumen de 100mL
Tomar una alícuota de 8mL enrasar a volumen de
20mL para mi S3. (S1:5,120mL; S2:6,400mL;
S4:10,000mL; S5: 12,500mL)
Tomar una alícuota de 1mL y enrasar a volumen 20mL
con Buffer pH6.0 para las cinco concentraciones de la
curva. Solución Madre

12. 2,Preparación de la curva estándar:
Pesar 17,06 mg de estándar secundario de Nistatina.
Disolver con dimetilformamida a Temperatura entre 50-
75 grados C.
Llevar a volumen de 50mL
Tomar una alícuota de 4mL enrasar a volumen de
20mL.
Tomar una alícuota de 1mL y enrasar a volumen 20mL
con Buffer pH6.0

13. 3,Preparación de las placas:
Estandarizar una cepa S. kuriavzevii ATCC 2601 ( no pasar 5
pasaje) a 25%T 580nm.
Fundido Medio 19 entre una temperatura de 45-50 °C, añadir 2mL
del inóculo estandarizado por cada 100 de agar.
Con una pipeta calibrada tomar 10 mL de agar y vertirlo en una
placa.
Dejar reposar 2 horas las placas esperando que se gelifique el
agar.
Dispensar 6 cilindros en el agar.
Inocular la curva estándar y las muestras.
Incubar a 30 °C por 24H
Leer los halos de inhibición con un vernier y subir los datos a la
tabla establecida.

15. MÉTODO CILINDRO-PLACA
Las proporciones de suspensión madre que se agregarán al
medio de inóculo deben resultar en formas satisfactorias de
inhibición de aproximadamente 14mm a 16mm para la
concentración del estándar S3. Para el resto de la curva
estarán entre 11mm a 19mm.

16. Tabla de Resultados

17. VERIFICACIÓN DE APTITUD DE VARIABILIDAD
Dispersión del diámetro de halos de las tres placas de una
determinada dilución respecto de su promedio, en términos de
desviación estándar relativa también llamado coeficiente de
variación (cv).
Valor limite no mas del 10%

18. LINEALIDAD DE LA CURVA ESTÁNDAR
FARMACOPEA SUGIERE QUE LA REGRESION ES ACEPTABLE SI EL
COEFECIENTE DE DETERMINACION (%𝑟2) es no menor de 95%.
𝑟2 mide la proporción de la variación de los diámetros de los halos
de inhibición (y) que es explicada por la variación del logartimo de la
concentración (X).

19. CORRECCIÓN DE VARIACIÓN ENTRE PLACAS
Requiere la corrección de los diámetros promedio de cada dilución ( S1, S2,S4,S5)
con un promedio del diámetro de la dilución s3.

20. LIMITE DE CONFIANZA Y COMBINACIÓN DE LOS
CÁLCULOS DE LAS VALORACIONES
Comparar la mitad de la amplitud del intervalo de confianza con un
valor máximo predeterminado aceptable.
Si la mitad de la amplitud es mayor que el limite de aceptación,
continuar con valores adicionales.

21. LIMITE DE CONFIANZA Y COMBINACIÓN DE LOS
CÁLCULOS DE LAS VALORACIONES

22. DETERMINACIÓN DE LA POTENCIA DE LA MUESTRA
Para estimar la potencia de la muestra desconocida, promediar
las mediciones de la zona del estándar y las mediciones de la
zona de la muestra en las tres placas usadas.
a = 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑠𝑒𝑐𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑙𝑖𝑛𝑒𝑎 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑔𝑟𝑒𝑠𝑖𝑜𝑛
b = 𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑙𝑖𝑛𝑒𝑎 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑔𝑟𝑒𝑠𝑖𝑜𝑛
𝑳𝑼 =
(𝑼 − 𝒂)
𝒃

23. DETERMINACIÓN DE LA POTENCIA DE LA MUESTRA
Se requieren tres o mas valoraciones independientes para
determinaciones de potencia de antibiótico.
EXACTITUD DE LOS RESULTADOS
 De concentraciones menores a mayores.
 Utilizar pipetas automáticas y halómetros ( calibrados y verificados)
 Homogenizar bien la muestra
 Extracción suficiente del antibiótico de la muestra
 Mediciones volumétricas

24. Cuando nos levantamos después de las caídas,
las experiencias nos sirven de aprendizaje.
Es la superación de dificultades lo que hace a
las personas grandes.