Este documento describe el proceso de purificación de la proteína fluorescente verde (GFP) utilizando cromatografía de interacción hidrofóbica. Las bacterias E. coli que expresaban GFP fueron lisadas para extraer la proteína. La muestra se cargó en una columna cromatográfica equilibrada con sulfato de amonio para unir la GFP hidrofóbica. La GFP se eluyó de la columna con un buffer sin sulfato de amonio y se recolectó en un tubo de ensayo, donde emitía fluorescencia ver

1. Universidad de Antofagasta
Facultad de Medicina y Odontología
Unidad de Biología Molecular
PURIFICACION DE PROTEINAS
RECOMBINANTES (GFP)
Integrantes:
- Nicolás Mora

2. Purificación de Proteínas
Recombinantes
Procedimiento Cromatográfico de la GFP
La purificación de proteínas recombinantes consiste en la obtención
de las proteínas sintetizadas por la bacteria, que son codificadas por un
gen que se insertó en ella mediante la metodología de transformación
génica.
Como muchas de estas proteínas no son liberadas al medio externo
por las bacterias, es necesario romper la pared celular de estas para
extraerlas y separarlas de otras proteínas, para esto se utilizan enzimas
como lisozimas, métodos de centrifugación, sonicación, cromatografía,
etc.
La Cromatografía es un conjunto de técnicas basadas en la
separación de los componentes de una mezcla, los que interaccionan en
distinta forma con una matriz, de este modo, los componentes se van
separando.
En esta ocasión utilizaremos la Cromatografía de interacción
hidrofóbica (HIC) la cual implica una interacción entre los grupos
hidrofóbicos expuestos de las proteínas y los grupos hidrofóbicos de la
matriz cromatográfica Esta interacción se produce por la asociación de
regiones apolares en medio acuoso.
A continuación se desarrollará y analizará el proceso de purificación
de proteínas recombinantes realizado en Laboratorio.
De acuerdo a protocolo entregado en laboratorio, se recibió un
tubo de bacterias centrifugadas.
Estas bacterias corresponden a E.coli cepa HB 101 a las cual se les ha
introducido mediante la metodología de Transformación Génica, el
plásmido pGLO, que contiene el gen que codifica para la síntesis de la
Proteína Fluorescente Verde (GFP)
 El pellet de bacterias contenidas en un tubo de microcentrifuga,
fueron observadas bajo la luz ultravioleta, y debido a la presencia de
la proteína GFP, éstas emiten fluorescencia.
 Luego se resuspendió el pellet de bacterias de la ultima
centrifugación en 250 L de buffer TE o de elusión [0M] el que se
utiliza para que la proteína se reestructure.

3. MUESTRA A:
Esta muestra contiene 20L del resuspendido de bacterias, la cual al
ponerla en el trans-iluminador fluórese debido a la presencia de las
bacterias junto con la proteína GFP.
Luego se añadieron 20 L de lisozima a la muestra original, la cual es
una enzima utilizada para romper la pared celular y facilitar la extracción
de la proteína.
Después de esperar 5 minutos para que la enzima actué, se
homogenizo la muestra en un sonicador por 5 segundos a poder #7, lo cual
permite romper las células para luego separar las proteínas de los restos de
membranas, pared celular y otros residuos.
Equilibrio de la columna.
A la columna entregada, se le aspiro la solución contenida sobre la
resina y se añadió 2ml de buffer de equilibrio, el cual se dreno hasta que el
menisco de la solución de buffer tocara la superficie de la resina.
El propósito de agregar buffer de equilibrio (NH4)2SO4 (sulfato de amonio)
[2M], es que la proteína GFP se vuelva hidrofóbica y se una al columna.
Una vez sonicada la
muestra, se lleva a centrifugar
las bacterias lisadas a 10.000g.
por 10 minutos, lo cual permite
que la muestra quede dividida
en un sobrenadante y un
precipitado el cual corresponde
a los contenidos bacterianos y
restos de pared celular.

4. MUESTRA B
Se toman 20 L de sobrenadante de la muestra centrifugada y se
guardan en un tubo de microcentrífuga, el cual al observarlo bajo la luz
UV, fluórese pues se obtuvo del sobrenadante de la muestra anterior.
Esta muestra contiene proteínas variadas, entre ellas la que se desea
separar que es la GFP.
MUESTRA EQUILIBRADA.
En un nuevo tubo de microcentrifuga se agregaron 250 L de
sobrenadante y 250 L de buffer de enlace.
El buffer de enlace [4M], sirve para separar las proteínas y así hacer
mas fácil la obtención de la proteína deseada.
MUESTRA C
Para obtener la muestra c se cargo en la columna 250 L de la
muestra equilibrada.
Una vez cargada la muestra se retiro el tapón y se transfirió la
columna al tubo de colección C, en el cual no se observo fluorescencia
debido a que la proteína GFP queda en la columna y solo pasan al tubo
otras proteínas que no se desean obtener.
Esto se pudo constatar observando la columna bajo la luz UV, en la
cual se observa una pequeña porción de proteína GFP en la parte superior
de la resina.

5. MUESTRA D
Para obtener la muestra D se carago la columna con 250 L de
buffer de lavado [1,3M], el cual se utilaza para excluir las proteínas que no
se requieren, una vez cargada la muestra se dreno la columna sobre el
tubo de colección D, hasta pasar toda la solución de lavado.
Al observar el tubo colección D bajo la luz UV no se observa
fluorescencia, pues en el tubo están las proteínas restantes de la columna,
sin incluir la GFP.
MUETRA E
Para obtener la muestra E se cargo la columna con 700 L de buffer
elusión [0M], el cual se utiliza para que la proteína se reestructure; por lo
que ahora ésta fue drenada completamente y traspasada al tubo E, en
donde de observa fluorescencia por contener la proteína GFP que fue
separada de las demás.

6. Al observar los tubos C, D, E en el trans-iluminador se observa lo siguiente:
C = no se ve fluorescencia
D = no se ve fluorescencia
E = se ve fluorescencia
El contenido de los tubos de microcentrifuga que fluorecen en el
transiluminador corresponden a muestras donde la proteína GFP se
encuentra presente, ya sea en la bacteria, junto a otras proteínas o pura.
Esta proteína fue purificada (separada del resto de contenido de la
bacteria) mediante la técnica de Cromatografía de interacción
hidrofóbica.