Manual traducido

MANUAL de BACETRIOLOGIA ANALITICA para AGUA y ALIMENTOS
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DEDICATORIA
A mis Padres, quienes formaron al hombre que soy ahora; a mi Familia, fuente de
apoyo incondicional; al Ejército Argentino, fragua constante de templanza y a Dios
nuestro Señor, por permitirme escribir para transmitir enseñanzas.
Teniente Coronel Veterinario D SANTIAGO PABLO BAGGINI
Servicio de Bromatología - HOSPITAL MILITAR REGIONAL CORDOBA

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ACLARACION
El presente Manual, es una traducción íntegra y literal de la Obra en inglés,
editada por el U. S. Department of Health, Education and Welfare – Washington
D. C. – 20204, Third Edition – 1972, y realizada por el Teniente Coronel
Veterinario SANTIAGO PABLO BAGGINI, Jefe del Servicio de Bromatología del
HOSPITAL MILITAR REGIONAL CORDOBA. Obviamente, en la actualidad han
cambiado algunas técnicas y existen nuevos y mejores medios de cultivo.
CORDOBA, 28 de julio de 2007

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TABLA DE CONTENIDOS
CAPITULO I: INTRODUCCION
1. Manejo de muestras y muestreo
CAPITULO II: PREPARACION DE COMIDAS
1. Preparación de comidas homogenadas
a. Aparatología y Materiales
b. Procedimientos
CAPITULO III: EXAMEN MICROSCOPICO DE ALIMENTOS
1. Aparatología y Materiales
2. Procedimientos
CAPITULO IV: RECUENTO DE AEROBIOS MESOFILOS EN PLACA
1. Aparatología, Materiales y Medios de cultivo
2. Procedimientos
CAPITULO V: ORGANISMO COLIFORMES Y ESCHERICHIA COLI
1. Aparatología, Materiales y Medios de cultivo
2. Test presuntivo para organismos coniformes
3. Test confirmativo para organismos coniformes
4. Test confirmativo para Escherichia coli
5. Método rápido para recuperación de Escherichia coli

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CAPITULO VI: STREPTOCOCUS FECALIS
1. Método de recuento en placa
2. Método del NMP
CAPITULO VII: STAFILOCOCUS AUREUS
1. Método de conteo directo en placa
2. Método del NMP
3. Test de la reacción a la coagulasa
CAPITULO VIII: SALMONELLA
alimentos, para el aislamiento de
1. Equipamiento y Materiales
2. Medios y Reactivos
3. Métodos de preparación en distintos
Salmonella
4. Aislamiento de Salmonella
5. Identificación de Salmonella
6. Tests serológicos para Salmonella
CAPITULO IX: SHIGELLA
3. Procedimientos de enriquecimiento para Shigella
4. Aislamiento de Shigella
5. Identificación de Shigella

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CAPITULO X: VIBRIO PARAHEMOLYTICUS
de Vibrio
3.Procedimientos para el enriquecimiento y el aislamiento
parahemolyticus
4. Procedimientos para su identificación bioquímica
5. Características de identidad de Vibrio parahemolyticus
6. Suplemento del método de detección de Vibrio parahemolyticus
CAPITULO XI: CLOSTRIDIUM BOTULINUM
3. Detección de toxinas preformadas en alimentos
4. Detección de Clostridium botulinum Tipos: A, B y E
5. Detección de Clostridium botulinum Tipo E en pescados ahumados
6. Aislamiento de Clostridium botulinum
7. Detección de toxina botulínica en el suero sanguíneo
CAPITULO XII: CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
3. Procedimientos para aislamiento
4. Confirmación de Clostridium perfringens
5. Método de enumeración de alfa-toxina de Clostridium perfringens

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CAPITULO XIII: BACILLUS CEREUS
3. Procedimientos para enumeración y aislamiento
4. Identificación de Bacillus cereus
CAPITULO XIV: ENUMERACION DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS
1. Generalidades
CAPITULO XV: EXAMEN DE ALIMENTOS CONSERVADOS (Conservas enlatadas)
1. Exámen de las latas de conserva
2 Incubación de las latas de conserva
3. Apertura de las latas de conserva
4. Exámen de cultivos
5. Examen microscópico
6. Examen del contenido enlatado
7. Evaluación del cierre de la lata
8. Interpretación de resultados
CAPITULO XVI: EXAMEN DE ESTERILIDAD EN PRODUCTOS LACTEOS
2. Procedimientos
3. Interpretación de resultados

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CAPITULO XVII: EXAMEN MICROSCOPICO DIRECTO DE HUEVOS
1. Aparatología y Materiales
2. Huevos líquidos y congelados
3. Productos de huevos secos (en polvo, etc.)
DETERMINACION SEROLOGICA DE ENTEROTOXINACAPITULO XVIII:
ESTAFILOCOCCICA
3. Preparación de Materiales y Medios
4. Procedimientos
a. Enumeración y selección de colonias
b. Producción de enterotoxinas
c. Test de difusión en gel
APENDICES
A. Medios de Cultivo
B. Reactivos, Diluyentes, Colorantes e Indicadores

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AGRADECIMIENTOS
Los Capítulos de ésta obra, han sido preparados por los siguientes miembros de la División de
Microbiología, Administración de Medicamentos y Alimentos de Washington D.C.
 Arthur P. Durringan: Capítulos I, II, III, IV, VI, XIII, XIV, XV, XVI, y XVII.
 Morris Filshein: Capítulos V, IX y X.
 Edgard F. Baer: Capítulo VII.
 Paul L. Pochna: Capítulo VIII.
 Hain M. Solomon: Capítulo XI.
 Stanley M. Harmon: Capítulo XII.
 Reginald W. Benett: Capítulo XVIII.

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PREFACIO
La realización de los Análisis Microbiológicos de los Alimentos de la FDA – USA, han hecho
mucho en el campo de acción de los Laboratorios Distritales.
Para poder juzgar apropiadamente la calidad microbiológica de un alimento, se dispondrá de una
utilización efectiva de los métodos específicos de análisis.
Además, resulta esencial lograr un método efectivo para informar los diferentes análisis en un
mismo laboratorio o en distintas dependencias, y esto es especialmente importante en vista de lo
extensivo que resulta la distribución de alimentos, tanto a nivel nacional como internacional, así
como las normativas referidas a la seguridad y calidad de un producto, de un alimento en
particular o de sus procesos de elaboración
El propósito de la elaboración del presente Manual, es el de proporcionar a los laboratorios, los
métodos necesarios para la identificación cuali y cuantitativa de microorganismos y/o de sus
productos metabólicos.
Estos métodos, no obstante, no son el final de un camino, pues siempre habrá por salir otros
superiores y quizá también, igualmente válidos. Por ahora, los aquí presentados, son los más
utilizados por la FDA y considerados como los más convenientes para la investigación en:
alimentos, monodrogas, medicamentos y productos de cosmética.
De acuerdo a lo establecido por la FDA, éste Manual provee los mecanismos de información para
otras Agencias Gubernamentales, industrias, etc., sobre los métodos de bacteriología analítica
más comúnmente utilizados por los laboratorios de la FDA para el exámen de alimentos.
La primera y segunda edición del presente Manual, incluían métodos aplicables a alimentos,
drogas medicinales y cosméticos. Esta tercera edición, se restringe a la metodología aplicable
primariamente a los alimentos, con base en la Metodología Oficial de la AOAC.
La preparación de ésta obra, ha sido posible gracias al esfuerzo combinado de varios individuos.
Miembros más informados del staff de ésta División, sometieron a exámen materiales y métodos
y fueron los responsables de la preparación y de la revisión inicial del borrador.
También han sido muy valiosos los comentarios y sugerencias recibidos por parte de nuestros
colegas universitarios y de la industria.

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El Dr. Arthur P. Dunningan, miembro Senior de ésta División y por su profunda preparación en
métodos analíticos, ha sido el coordinador del esfuerzo total para la redacción y la edición de éste
Manual.
Por último destaco, que resulta evidente la futura incorporación a ésta obra de suplementos,
revisiones y modificaciones de los métodos aquí presentados.
Por ello, se valorarán y serán bienvenidas las sugerencias respectivas que por otra parte
necesitamos, así como de comentarios constructivos para el mejoramiento de él presente libro.
JOSEPH O. OLSON, Jr
Director de la División de Microbiología
Oficina de Ciencias
AGENCIA PARA LA ADMINISTACION DE ALIMENTOS Y MEDICAMENTOS (FDA)
U S A

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CAPITULO I: INTRODUCCION
1. MUESTREO Y MANEJO DE MUESTRAS
La eficacia de un Laboratorio, es el punto de partida para la exactitud de los resultados sobre
la muestra recibida, siendo por lo tanto de primera importancia.
Las muestras que no fueran recolectadas apropiadamente, o que no fueran manipuladas
correctamente, o que no fueran representativas, darán resultados de laboratorio que no serán
válidos o datos sin sentido.
Este principio se aplicará a todas las categorías y a todas las características de las muestras a
analizar.
Una aplicación uniforme de procedimientos estandarizados en las mismas es esencial y es el
deseo del analista o investigador para su interpretación. Así, por ejemplo, a partir de un
pequeño lote de muestra, se puede inferir el resultado de todo un lote de conservas.
Una muestra representativa del total es importante, cuando la investigación tiene como misión
la de detectar presencia de patógenos o de sus toxinas, los cuales quizás,estén dispersos en
todo el alimento o cuando el decomiso y posterior destrucción de un embarque de alimentos,
en relación con los estándares legales, dependa de las demostraciones de la presencia de
microorganismos patógenos.
Asimismo, las unidades uniformes de una muestra representativa, deberán ser
significativamente estadísticas con respecto al universo original.
El mayor interés, radica en seleccionar e identificar suficientes muestras y submuestras en el
laboratorio. La composición y naturaleza de cada lote de alimento sometido a la aprobación
estadística de procedimientos de muestreo, puede afectar a la uniformidad y a la
homogeneidad del total de la muestra.
La aplicación de procedimientos definidos para muestras sólidas, semisólidas, viscosas y
líquidas, serán determinadas por el Inspector actuante.
Una muestra simple, puede no ser representativa de la masa de alimentos, pero puede ser la
mejor alternativa avalable bajo condiciones definidas.
Es necesaria la consideración de la condición de un alimento sólido, semisólido oviscoso,
antes de su procesamiento y posterior embalaje.

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Existe una recomendación estadística para la recolección de la muestra, que deberá ser igual a
la raíz cuadrada del total del lote. Puede que éste sea un número excesivo, sin embargo y para
una rutina microbiológica el tamaño de la muestra será mayor a la diez (10) unidades
Hay experimentos que avalan ésta cifra de diez unidades, para la representación de un lote
grande o de un número importante de contenedores a ser muestreados, al igual que
continentes o envases.
Cuando sea posible, el producto deberá ser llevado al laboratorio en su envase original y sin
abrir, a efectos de prevenir su potencial contaminación y de poder obtener fidedignamente su
presentación real para ser ofrecido al público.
De no ser ello posible, por no ser práctica su remisión de ésta manera, se transferirán
porciones representativas en envases estériles y bajo condiciones asépticas.
Se utilizarán para ello, instrumentos estériles o desinfectados convenientemente al alcohol o a
la llama, como ser: bisturís, cubiertos, espátulas, platos de metal, etc.
Esto se hará así, a fin de no comprometer el material y contribuir a su mantenimiento
preferentemente estéril (Técnicas de Asepsia).
Serán aceptables los envases estériles de plástico de uso comercial, o frascos de vidrio de boca
ancha y tapa de metal roscada y esterilizados por calor seco (30´ a 160º C). Cada frasco
estéril deberá contener al menos 100 grs de la muestra a ser analizada etiquetándose
convenientemente con una tela plástica, e identificando: producto, Nº de lote y fecha del
proceso.
De ser posible, entregar rápidamente la muestra al laboratorio, manteniendo las condiciones
originales de la misma. En el caso de muestras líquidas, puede tomarse una adicional para
control de temperatura y todos estos datos deberán ser chequeados y grabados en el envase
que se remite al laboratorio.
Aquí, también se asentará el tiempo que tardó en llegar la muestra, desde su obtención hasta
su procesamiento. Las muestras se congelarán o se frisarán de acuerdo a su naturaleza y
envase, así como de acuerdo al tiempo de demora en su entrega y/o transporte al laboratorio.
Algunos microorganismos como Clostridium perfringens, no resisten el frizer, por lo que no
deberá aplicarse ésta cadena de frío para su investigación.

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CAPITULO II: PREPARACION DE COMIDAS HOMOGENADAS
1. APARATOLOGÍA y MATERIALES
a) Licuadora metálica cónica de una o dos velocidades con control de reóstato y con una
velocidad máxima de 8000 rpm.
b) Jarra de vidrio o metálica de 1000 ml de capacidad, con tapa y resistente al
autoclavado (15`a 121º C). Utilizar una jarra estéril por cada espécimen a muestrear.
c) Balanza de 2000 grs de capacidad y sensibilidad de 0,1 g.
d) Vasos de precipitado de 250 ml, esterilizados y envueltos en papel de aluminio; uno
por cada muestra a procesar.
e) Instrumental esterilizado.
f) Pipetas graduadas y estériles de: 1, 5 y 10 ml.
g) Solución de buffer fosfato diluido o Solución de peptona esterilizados en autoclave
(Ver Apéndice B), para cada muestra y en botellas de 500 ml o frascos de 100 ml con
un pH final de 7,00.
2. PROCEDIMIENTOS
a) Se parte de una muestra congelada o de su envase original con no más de 18 hs de
conservada entre 2º y 5º C.
b) Tarar la balanza con la jarra o con el vaso de precipitado estériles y colocar en su
interior en forma aséptica, 50 grs de la muestra de alimento.
c) Dependiendo del propósito del análisis y de la naturaleza de la muestra, se analizará
ésta de manera completa (por ejemplo: helados de crema), o por separado cada
ingrediente (muestras congeladas y deshidratadas de distintos alimentos en una sola
muestra).
Se agrega a la licuadora, una solución de buffer fosfato o de peptona en cantidad de 450
ml y se licúa junto con la muestra por espacio de 2 minutos a 8000 rpm, quedando
preparada así una solución de 10 -1

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d) Deberá licuarse el alimento sembrándolo en diferentes diluciones de manera rápida y
sin pérdidas de tiempo.
e) Preparar las diluciones necesarias y sucesivas, partiendo de 10 ml de la solución
madre 10 -1
con 90 ml de diluyente estéril y así sucesivamente.
f) Usar pipetas con capacidad no mayor al 10 % del volumen total a analizar, por
ejemplo: para 0,1 ml, usar de 1 ml; para 1 ml, utilizar la de 10 ml, etc.

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CAPITULO III: EXÁMEN MICROSCÓPICO DE LOS ALIMENTOS
Si se sospecha de que un alimento es la causa de una intoxicación alimentaría (ETA), se debe
sembrar el mismo en forma directa y a través de un hisopado, o realizar diluciones pero sin
pérdida de tiempo.
Esto puede suministrar información sobre otros tipos de exámenes que eventualmente deban
hacerse.
El examen microscópico debe de ser transportado uniformemente aunque el alimento tenga o
pueda tener o experimentar tratamiento por calor.
a) Un portaobjetos de vidrio para frotis de cada dilución (1 por c/u).
b) Ansa de platino de 3 – 4 mm de diámetro.
c) Coloración de Gram.
d) Microscopio con objetivo de inmersión.
e) Aceite de cedro para inmersión.
2. PROCEDIMIENTOS
a) Preparar la extensión en el portaobjetos, de acuerdo con la marca de la dilución
correspondiente.
b) Secar al aire y fijar a la llama de mechero Bunsen.
c) Realizar inmersión en xilol por 1’ a 2’.
d) Drenar y secar.
e) Realizar coloración de Gram.
f) Observar con objetivo de 100 X en aceite de inmersión.
g)Examinar al menos 10 campos / porta, verificando en especial la presencia de:
Clostridios, Cocos Gram (+) y Bacilos Gram (-).

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CAPITULO IV: RECUENTO DE AEROBIOS EN PLACA
a) Placa de Petri de vidrio de 10 cm de diámetro o de plástico descartable de 9 cm de
diámetro.
b) Pipetas graduadas de 1, 5, 10 y 11 ml.
c) Frasco de dilución de vidrio borosilicato de 160 ml, con tapa plástica o de goma.
d) Baño María de 45° C
e) Contador de colonias con luz.
f) Estufa de cultivo a 37° C.
g) Registro escrito.
h) 100 ml de buffer fosfato en agua destilada.
i) Agar PCA.
2. PROCEDIMIENTOS
a) De una muestra madre homogénea, usar pipetas estériles para realizar diluciones
decimales de: 10-1
, 10-2
, 10-3
y 10-4
.
b) Prepara las diluciones decimales transfiriendo 10 ml de la dilución previa en 90 ml de
diluyente.
c) Agitar cada botella con la dilución para resuspender el material. De allí pipetear 1 ml de
cada dilución y llevarlo a la placa de Petri que corresponda a ésa dilución.
d) Agregar Agar PCA a 45° C a cada placa convenientemente rotulada; 1 placa por cada
dilución de cada alimento analizado.
e) Inmediatamente realizar movimientos rotatorios para mezclar el agar con el inóculo
(siembra en profundidad), tapar la placa y dejarla solidificar.
f) Inmediatamente de solidificadas las placas, se invertirán y se incubarán 48 hs a 37° C.
g) Seguidamente de la incubación, se contarán todas las colonias registrándose sobre cada
placa según la dilución.
h) Se registrará e informará como: Nº de colonias de aerobios mesófilos / gramo.

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CAPITULO V: ORGANISMOS COLIFORMES Y ESCHERICHIA COLI
a) Ídem a IV 1. de a) a g).
b) Baño María a 45° C.
c) Ansa de inoculación de 3 mm de diámetro.
d) Caldo BRILA (Verde Brillante Bilis Lactosa).
e) Caldo LST (Laurel Sulfato Triptosa).
f) Caldo ET.
g) Agar EMB de Levine.
h) Caldo TRIPTONA o TRIPTICASE SOYA.
i) Caldo GLUCOSA Bufferado (Caldo RM – VP)
j) Agar CITRATO de KOSER.
2. TEST DE PRESUNCION DE ORGANISMOS COLIFORMES
a) Utilizar pipetas estériles y a partir de diluciones de 10-1
a 10-3
o mayores, de ser
necesario (Ver Capítulo II, 2. a) a g)).
b) Inocular tres tubos con Caldo LST con 1 ml de cada dilución y con campanita de
Durham.
c) Tomar cada pipeta y escurrir lentamente el resto de cada una por las paredes del tubo.
d) Permitir que cada pipeta drene por gravedad evitando soplar la misma para apurar el
proceso, evitando contaminar con el aliento ése material residual.
e) Incubar los tubos 48 hs a 37° C.
f) Examinar a las 24 hs a fin de detectar posible formación de gas.
g) El gas se observará dentro de la campanita de Durham o por efervescencia del medio a
la agitación vigorosa del tubo.
h) Luego de ésta primera vista, reincubar los tubos (-) por otras 24 hs.
i) Si hay gas presente luego de 48 hs de incubación, será considerado como un test (+)
de presencia de coliformes.

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j) Confirmar los tests presuntivos.
3. CONFIRMACION DEL TEST (+) A ORGANISMOS COLIFORMES
a) Sacudir suavemente cada tubo por rotación.
b) Transferir con ansa estéril de 3 mm de diámetro, una película de cada tubo (+) a un
tubo con Caldo BRILA 2%.
c) Incubar 48 hs a 37° C.
d) Ver pasos anteriores (2., g) a j)).
e) Usar la tabla del Nº más probable (NMP – Apéndice C) en base a los tubos (+) de
Caldo BRILA.
f) Reportar como NMP de organismos coliformes/gramo (Apéndice C).
4. CONFIRMACION DEL TEST PARA ESCHERICHIA COLI
a) Ver 3., a).
b) Transferir con ansa estéril de 3 mm de diámetro, una película de cada tubo (+) de
Caldo LST a un tubo con Caldo EC.
c) Incubar cada tubo en Baño María a 45° C por 48 hs.
d) Cada tubo (+) por formación de gas, es tomado para resiembra en estrías con ansa
sobre Agar EMB de Levine.
e) Incubar 24 hs a 37° C.
f) Tipificar con pruebas bioquímicas IMViC.
5. TEST IMViC
a. Producción de Indol:
1)De la colonia sospechosa, se inocula con un ansa puntiforme el fondo de cada tubo en
profundidad, con Agar SIM (Sulfito – Indol – Movilidad).
2) Se incuba 24 hs a 37° C.
3) Se adicionan 0,3 ml de Reactivo de Kovacs.
4) El test dará (+) cuando se forme un anillo rojo en la superficie del medio.

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b. Reacciones de Rojo de Metilo y Voges Proskauer:
1) Inocular con ansa de 3 mm un tubo con 5 ml de Caldo RM – VP.
2) Incubar 48 hs a 37º C.
3) Agregar 0,1 ml de una solución de alfa naftol al 5 % y 0,1 de K(OH) al 40 %.
4)Un resultado (+) al test de VP es cuando se desarrolla un color rojo eosina dentro de
las siguientes dos horas.
5) Para la prueba del RM, se reincuban los tubos otras 48 hs a 37º C.
6) Se agregan 5 gotas de Reactivo rojo de metilo.
7)Se considera RM (+) cuando el tubo se vuelve de color rojo y RM (-) cuando queda
de color amarillo.
c. Utilización del Citrato:
1)Inocular en profundidad con ansa puntiforme, un tubo en pico de flauta con Agar
CITRATO de KOSER.
3) El test (+) será cuando el medio de color verde haya virado al azul.
d. Producción de gas de Lactosa:
1) Sembrar un tubo con tapa a rosca y Caldo LST (Lactosa – Tripticase – Sulfito).
3) El test (+) será cuando se desarrolle gas en la campanita de Durham (2. g), i)).
6. CLASIFICACION e INFORMES
a) Clasificar a Escherichia coli como: IMViC + + - - o - + - - , a partir de cultivos
obtenidos de bacilos Gram (-) no esporulados, Lactosa (+) y Gas (+) luego de 48 hs de
incubación a 37º C.
b) Determinar por la Tabla del NMP (Apéndice C), basado en los tubos (+) a E. coli por
IMViC, Lactosa y Tinción de Gram.

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Tabla de Tipificación bioquímica según Pruebas IMViC:
INDOL RM VP CITRATO OBS
+ + - - Típica E. coli
- + - - Atípica E. coli
+ + - + Típica Intermedia
- + - + Atípica Intermedia
- - + + Típico A. aerógenes
+ - - + Atípico A. aerógenes
c) Informar Nº E. coli por Tabla de NMP/gramo.
7. METODO RAPIDO PARA LA RECUPERACION DE E. COLI
Este método solamente debiera ser usado en aquellos productos donde la presencia de
Coliformes no es crítica para la evaluación de la flora microbiana, y no debiera usarse en
aquellos productos en donde se aplica el método oficial.
a) Aparatología, materiales y medios
1) Igual a Capítulo IV, 1.
2) Baño María a 45º C
3) Caldo LAURYL SULFATOTRIPTOSA (LST)
4) Agar EMB de Levine
5) Caldo TRIPTONA o TRIPTICASE
6) Caldo RM – VP
7) Agar CITRATO de KOSER
8) Buffer Fosfato para dilución
b) Procedimiento
1) Igual a Capítulo V, 1., a) – d)
2) Incubar por 24 hs a 45º C observando la posible formación de gas
3) Sembrar los tubos (+) en Agar EMB de Levine, según Capítulo V, 4. y 5.
4) Informar como NMP de E. coli/gramo – MR (Método Rápido)

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CAPITULO VI: ESTREPTOCOCO FECAL
A.METODO DE CONTEO EN PLACA (Conveniente para alimentos en donde se esperan un
gran número de E. fecales).
1. APARATOLOGÍA, MATERIALES y MEDIOS de CULTIVO
a) Ídem a IV, 1.
b) Agar KF
2. PROCEDIMIENTO
a) Pipetear asépticamente 1 ml de la dilución homogénea del alimento a nalizar,
identificando la correspondiente placa.
b) Poner en cada placa 10 – 15 ml de Agar KF.
c) Mezclar directamente el inóculo con al agar (siembra en profundidad) y dejar
solidificar. Por cada serie sembrada, colocar una placa control sin inocular como
testigo.
d) Invertir las placas e incubar 48 hs a 37° C.
e) Observar las colonias con lupa, luego de incubadas, verificando color, textura y
tamaño de las mismas.
f) Seleccionar aquellas placas con 30 a 300 colonias, contando solamente aquellas de
color rojo o rojas con el centro rosa.
g) Calcular el número de microorganismos/gramo de alimento, multiplicando el
promedio del número de colonias por el factor de dilución correspondiente.
A.METODO DEL NMP (Recomendable como de uso rutinario en la vigilancia de la calidad
sanitaria de los alimentos y cuando se espere un número bajo de S. fecales en los mimos).

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a) Ídem a IV, 1.
b) Caldo Streptococus KF, en tubos de 150 x 15 mm; cada uno con 10 ml de caldo y
utilizando 5 tubos por cada dilución del mismo.
2. PROCEDIMIENTO
a) Se pipetean asépticamente 1 ml y se coloca en el 1er tubo realizándose sucesivas
diluciones en los 4 restantes con 1 ml de cada tubo al siguiente.
b) Se incuban por 48 hs a 37° C.
c) A las 24 y 48 hs se observarán cambios de color, y si hay viraje al amarillo, ése tubo
será (+) a S. fecal.
d) Se seleccionan la dilución mayor y las dos siguientes.
e) Se determina el NMP de S. fecalis/gramo (Apéndice C) según los tubos (+) de las
tres diluciones.

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CAPITULO VII: STAPHILOCOCUS AUREUS
A. METODO DIRECTO DE CONTEO EN PLACA (Conveniente cuando se esperan conteos
iguales o mayores a 100 S. aureus/gramo de alimento).
a) Ídem a IV, 1.
b) Ídem a II, 1.
c) Espátula de Drigalsky (Varilla de vidrio curvado en forma de palo de hockey).
d) Pipetas de 1 ml graduadas a 0,1 ml.
e) Baño María a 37° C y a 50° C.
f) Incubadora o Estufa a 50° C.
g) Tubo de vidrio de 100 x 13 mm.
h) Caldo TRIPTICASE SOYA o GIOLITTI – CANTONI.
i) Agar BAIRD – PARKER.
j) Caldo CEREBRO CORAZON.
k) Plasma coagulasa de conejo con EDTA, deshidratado.
2. PROCEDIMIENTO
la llama (siembra por
a) Lo mismo que en Capítulo II, 2.
b) Colocar 0,5 ml sobre la placa de agar BAIRD – PARKER.
c) Distribuir con espátula de Drigalsky esterilizada a
agotamiento).
d) Cuando el inóculo esté completamente absorbido por el medio, invertir las placas e
incubarlas 30 hs a 37° C.
e) Seleccionar aquellas placas representativas que contengan entre 20 a 200 colonias.
f) Contar el número de colonias, siguiendo los siguientes grupos:
1)Colonias convexas, negro brillantes, con o sin halo gris, blanco o claro en el
medio de cultivo opaco.

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2) Iguales al punto anterior pero con un halo claro alrededor y cubriendo el medio.
3) Ídem pero con halo de 1 mm de diámetro.
g) Seleccionar una colonia de cada grupo y se siembre en un tubo con 0,5 ml de Caldo
CEREBRO CORAZON y se emulsifica.
h) Incubar 24 hs a 37°c.
i) Se añaden 0,5 ml de plasma coagulasa reconstituido y se mezclan con la emulsión
anterior.
j) Se incuba a 37° C y se examina la formación de grumos desde 1 hasta 6 horas
posteriores con intervalos de 60’. Cualquier grado de formación de grumos se
considerará como coagulasa (+) (Figura VII – 1).
k) Se consideran que todos los cultivos darán coagulasa (+) a las 6 hs post incubación.
l) Calcular el número total de colonias representadas por la coagulasa (+) y multiplicar
por el factor de dilución correspondiente.
m) Informar como número de S. aureus/gramo.
B. METODO DEL NMP (Recomendado como de uso rutinario en la vigilancia de la calidad
sanitaria de los alimentos y cuando la expectativa sea de hasta 100 S. aureus/gramo).
a) Ídem a Capítulo VII, A., 1.
b) Caldo TRIPTICASE SOYA con 10% de ClNa o Caldo GIOLITTI – CANTONI.
2. PROCEDIMIENTO
a) Ídem a Capítulo II, 2.
b) Se inoculan tres tubos de Caldo TRIPTICASE SOYA o GIOLITTI – CANTONI,
con 1 ml de la solución madre del alimento problema.
c) Incubar 48 hs a 37° C.
d) Transferir con ansa estéril de 3 mm a una placa de Agar BAIRD – PARKER.
e) Distribuir el inóculo.

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f) Incubar las placas por 30 hs a 37° C.
g) Ídem a Capítulo VII, A., 2.
h) Informar como NMP de S. aureus/gramo.
2. TEST PARALA REACCION DE LA COAGULASA
a) A continuación ver Figura VII – 1: Tipos de Reacciones de Coagulasa.
( - ) 1(+) 2 (+) 3 (+) 4 (+)
( - ) No se evidencia formación de fibrina
1 (+) Pequeños grumos no organizados
2 (+) Pequeño grumo organizado
3 (+) Gran grumo organizado
1 (+) Completo contenido coagulado en el tubo, que no se desplaza al invertir el mismo

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CAPITULO VIII: DETECCION E IDENTIFICACION DE SALMONELLA
El aislamiento de Samonella en alimentos, requiere a menudo de diferentes métodos a los
utilizados en los Laboratorios Clínicos de la salud pública humana. Por lo tanto no será posible,
recomendar un método simple para aislamiento de Salmonella y que el mismo sea recomendable
para todo tipo de alimentos y para todos los serotipos de la enterobacteria en estudio.
Todos los métodos sin embargo, son esencialmente similares en sus principios y en los
procedimientos de preenriquecimiento, enriquecimiento, cultivo en placas con agar selectivo y la
identificación taxonómica de aquellas colonias sospechosas de ser Salmonella.
La complejidad de estos procedimientos, es atribuible al hecho de que ésta Enterobacteria en
particular se distribuye en forma directa o indirecta desde una contaminación fecal.
Los métodos presentes tratan de favorecer el desarrollo de Salmonella, en detrimento de otros
microorganismos competitivos por restricción de nutrientes.
Por regla general, el preenriquecimiento, favorece una rápida recuperación de Salmonellas que
pudieran haber sido fisiológicamente inactivadas por diversos traumas y que a raíz de la sospecha
de su existencia en alimentos, se les dio a los mismos diferentes tratamientos como: desecación,
uso de conservantes, frisado, aumento de la presión osmótica y cambios de pH, entre otros.
Como los medios de cultivo normales no llevan por lo general el agregado de inhibidores
químicos, se utilizan medios selectivos que sí los llevan, intentando inhibir de ésta forma, al
grupo de coliformes y de otros microorganismos que pudieran competir con Salmonella.
Hoy en día, muchos alimentos reciben alguno de los siguientes tratamientos térmicos en su
procesado: desecación, deshidratación, pulverización, etc; es así que el paso inicial será
reconstituir dicho alimento en un caldo no selectivo como preenriqueciemiento y el de elección
será el Caldo LACTOSADO.
Tales alimentos presentan usualmente una población microbiana reducida, pero de haber
Salmonellas presentes, las mismas probablemente, estarán inhibidas o disminuidas en su
crecimiento por otros gérmenes más competitivos.
Es de extrema importancia, ajustar el pH para obtener los mejores resultados en nuestra búsqueda.
Los antisueros “O” somático y flagelar polivalente “H”, no poseen los anticuerpos
necesarios para reaccionar ante los más de 1.000 serotipos diferentes de Salmonella presentes en
la actualidad y aceptados por el esquema de Kauffmann – White.

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Algunos resultados serológicos negativos pueden ocurrir con algunos serotipos de Salmonella
cuando se testean con éstos antisueros.
La identificación de tales cultivos puede ser resuelta por tests bioquímicos y por otros análisis
serológicos.
A. EQUIPAMIENTO y MATERIALES
a) Recipientes estériles para mezclar (Capítulo II, 1.).
b) Vasos de precipitado de 500 ml.
c) Espátula de Drigalsky.
d) Balanza con sensibilidad de 0,1 gr y pesas de hasta 2.000 grs de capacidad.
e) Balanza con sensibilidad de 5 gr y pesas de hasta 120 grs de capacidad.
f) Estufa de cultivo de 37° C.
g) Baño María de 50° C.
h) Cucharas estériles para pesar el alimento.
i) Placas de Petri estériles de 100 x 15 mm, plásticas o de vidrio.
j)Pipetas estériles de 1 ml de capacidad graduadas en 0,01 ml; de 5 y 10 ml graduadas
en 0,1 ml y de 0,2 ml graduadas en 0,02 ml.
k) Ansa de platino para siembra de 3 mm de diámetro.
B. MEDIOS DE CULTIVO y REACTIVOS
a) Caldo LACTOSADO.
b) Caldo SELENITO CISTINA.
c) Caldo TETRATIONATO.
d) Agar VERDE BRILLANTE.
e) Agar SS (Salmonella – Shigella).
f) Agar SULFITO de BISMUTO (Actualmente se utiliza el Agar SIM: Sulfito – Indol
– Movilidad y es un medio semisólido).
g) Agar TSI (Triple azúcar – hierro).
h) Agar TRIPTONA o TRIPTOFANO.

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i) Caldo RM – VP.
j) Agar CITRATO de SIMMONS.
k) Agar UREA.
l) Caldo MALONATO.
m) Agar LISINA HIERRO.
n) Caldo LISINA DESCARBOXILASA.
o) Caldo CIANURO de POTASIO.
p) Caldo ROJO FENOL.
q) Caldo PURPURA CARBOHIDRATO.
r) Agar Mac CONKEY.
s) Caldo NUTRITIVO.
t) Reactivo de KOVACS para Test de Indol.
u) Reactivo para VOGES – PROSKAUER.
v) Indicador para ROJO de METILO.
w) Solución Fisiológica estéril.
x) Solución Fisiológica estéril formalizada.
y) Antisuero polivalente Salmonella somático (O).
z) Antisuero polivalente Salmonella flagelar (H).
aa) Pool de antisuero polivalentes Salmonella (O) Grupos: A, B, C1, C2, D, E1, E2, E3,
E4, F, G, H, I y Vi.
bb) Antisuero Salmonella flagelar (H) “Spice – Edwards”.
cc) Tiras indicadoras de pH o Peachímetros digitales.
dd) Agua destilada estéril.
ee) Solución verde brillante al 1%.
ff) Caldo TRIPTICASE SOYA con 10 % de ClNa.
C. METODO PARAAISLAMIENTO DE SALMONELLA EN ALIMENTOS
 Procedimiento para: Huevos (enteros, claras o yemas) deshidratados, Huevos
pasteurizados líquidos o congelados, Productos de pastelería o panadería, y
Fórmulas infantiles.

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a) Si la comida fuese congelada, debe trabajarse rápidamente para evitar aumentar el
número de microorganismos o la destrucción de Salmonellas, evitando sobrepasar
los 45° C por más de 15’, ni trabajar por debajo de los 5 – 10° C.
b) Pesar asépticamente 25 grs de la muestra problema.
c) Añadir 225 ml de Caldo LACTOSADO. Si la muestra fuese pulverulenta, agregar
primero 10 a 15 ml de caldo, homogeneizando bien y sin grumos. Luego
completar el volumen anteriormente indicado.
d) Tapar la mezcla dejándola por 60’ a temperatura ambiente.
e) Determinar el pH de la misma.
f) De ser necesario, ajustar a pH 7,00 con solución estéril 1 N de Na (OH) o ClH.
g) Incubar por 24 hs a 37° C.
h) Continuar según D., 1 – 9, de éste mismo Capítulo.
 Procedimiento para: Leches descremadas y en polvo.
a)Pesar asépticamente 100 grs de la muestra y llevar a un recipiente estéril de 2.000
ml de capacidad.
b) Agregar 1.000 ml de agua destilada estéril, mezclando adecuadamente.
c)Determinar el pH ajustándolo en el caso de encontrarse por debajo de 6,6, con Na
(OH) 1 N hasta pH 6,8 + - 0,2.
d) Añadir 2 ml de solución acuosa de VERDE BRILLANTE al 1% y mezclar.
e) Incubar por 24 hs a 37° C.
f) Continuar según D., 1 – 9, de éste mismo Capítulo.
 Procedimiento para: Productos con huevos no pasteurizados y congelados.
a) Pesar por duplicado y asépticamente, 25 grs de la muestra.
b) Agregar 225 ml de Caldo SELENITO CISTINA en una muestra y 225 ml de
Caldo TETRATIONATO en la otra.
c) De ser necesario, ajustar a pH 7,00 con Na (OH) 1 N.
d) Incubar por 24 hs a 37° C.
e) Continuar según D., 3 – 9, de éste mismo Capítulo.

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 Procedimiento para: Productos farináceos (pastas secas y frescas).
a) Pesar asépticamente 25 grs de la muestra.
b) Agregar 225 ml de Caldo LACTOSADO, y centrifugar durante 2’ a 8.000 rpm.
c) Transferir asépticamente el sobrenadante a otro recipiente estéril.
d) Ajustar el pH que se encuentre por debajo de 6,6 a 7,00 con Na (OH) 1 N.
e) Incubar por 24 hs a 37° C.
f) Continuar según D., 3 – 9, de éste mismo Capítulo.
 Procedimiento para: Carnes animales y de pescados.
a) Productos cocinados, procesados y/o deshidratados.
1) Pesar asépticamente 25 grs del producto a investigar.
2) Agregar 225 ml de Caldo LACTOSADO estéril, y centrifugar durante 2’ a
8.000 rpm.
3) Incubar por 24 hs a 37° C.
4) Continuar según D., 1 – 9, de éste mismo Capítulo.
b) Productos crudos y/o altamente contaminados.
1) Pesar asépticamente 25 grs por duplicado de cada producto a investigar.
2) Agregar 225 ml de Caldo SELENITO CISTINA estéril en una muestra y
225 ml de Caldo TETRATIONATO VERDE BRILLANTE estéril en la
muestra duplicada.
3) Mezclar ambas muestras por 2’.
5) Continuar según D., 3 – 9, de éste mismo Capítulo.
D. AISLAMIENTO DE SALMONELLA
1) De las incubaciones anteriores, tomar 1 ml en forma estéril y llevarlo a un tubo con
10 ml de Caldo SELENITO CISTINA estéril y a otro semejante pero con 10 ml de
Caldo TETRATIONATO estéril.
2) Incubarlos por 24 hs a 37° C.

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3) De cada tubo, tomar con un ansa de 3 mm y sembrar en estrías sobre una placa de:
Agar SS, Agar VERDE BRILLANTE y Agar SIM.
5) Colonias típicas de Salmonella en:
a)Agar VERDE BRILLANTE: De color rosa pálido a fucsia, opacas a translúcidas
con un halo circundante de rosado a rojo. Algunas colonias pueden aparecer no
obstante, con tonalidades verde transparente a verde amarillentas o decididamente
verdes.
b)Agar SS: Incoloras a rosa claras, opacas, transparentes a translúcidas. Alguna
colonias pueden presentar centro negro.
c) Agar SIM: Marrones a negras y a veces con brillo metálico. Halos marrones que
luego pasan a negros. Otras colonias pueden ser verdes con pequeños halos
obscuros alrededor.
6) De cada colonia típica, se saca material con un ansa puntiforme y se siembran tubos
en pico de flauta con Agar TSI. Puede sin embargo, se necesaria otra incubación por
24 hs a 37° C si no se vieran colonias típicas.
7) Incubar los tubos de Agar TSI por 24 hs a 37° C.
8) Los tubos (+) a Salmonella, darán: Reacción alcalina (tonalidad roja del medio) en
el pico de la flauta y ácida en el culote del tubo (tonalidad amarilla del medio).
Algunas veces habrá producción de SH2 (Sulfuro de Hidrógeno o Acido
Sulfhídrico), que podrá ennegrecer total o parcialmente al medio.
9) Realizar pruebas de tipificación bioquímica y sexológica en por lo menos tres
muestras de Caldo SELENITO CISTINA y en otras tres de Caldo
TETRATIONATO.
E. IDENTIFICACION DE SALMONELLA
a) Cultivos Mixtos
1)Tomar 1 porción de las colonias del pico de flauta del Agar TSI y resembrar en
estrías en una placa de Agar Mac CONKEY o de Agar VERDE BRILLANTE.

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3) En Agar Mac CONKEY, las colonias típicas son transparentes a incoloras con
centro obscuro. En Agar VERDE BRILLANTE, serán de rosas a fucsias con un halo
rosado a rojo.
b) Cultivos Puros
1) Test de Ureasa:
a. Repicar cada colonia sospechosa en Agra UREA, incubando por 24 hs a 37° C.
b.Descartar a Ureas (+) (rosados) y conservar a los Ureas (-) (amarillos sin cambio
de color).
c) Test de Screening para estudio serológico flagelar (H)
1)Transferir material de una colonia en tubo de Ureasa (-) a un tubo con Caldo BHI,
incubándolo por 5 – 6 hs a 37° C o a un tubo con Caldo TRIPTICASE SOYA,
incubándolo por 24 hs a 37° C (Test del mismo día o Test del día siguiente, según
correspondiera).
2) Por cada 5ml de Caldo, agregar 2,5 ml de Solución salina isotónica estéril.
3) Seleccionar 2 tubos y testear con Antisuero Salmonella Flagelar (H):
 En tubos para tests serológicos, se colocan 0,5 ml de antisuero polivalente
flagelar (H) diluido convenientemente.
 Se adiciona a cada tubo, 0,5 ml de los tubos preparados en c), 2).
 Se prepara un tubo control con 0,5 ml de solución salina + 0,5 ml de antígeno.
 Incubar por una hora a Baño María de 50° C.
 En una hora, observar con intervalos de 15’:
* Positivos: Aglutinación de tubos problemas y no aglutinación en el control.
* Negativos: Ninguna aglutinación en ninguno de los tubos.
*No específicos: Aglutinan ambos tubos. Se requiere de tests adicionales con
el Método “Spicer – Edwards” flagelar (H) de siete tubos.
d) Test de Cultivos Ureasa (-):
1) Agar LISINA HIERRO (LIA)
a.Sembrar en pico de flauta tomando una muestra del culote de un tubo con Agar
TSI.
b. Incubar por 48 hs a 37° C.
c. Examinar a las primeras 24 hs.

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d. Salmonella sp dará una reacción alcalina con un color púrpura en todo el medio.
En los casos (-), hay rojo en el pico de flauta y culote amarillo.
2) Caldo LISINA DESCARBOXILASA
a. Inocular el caldo con una colonia de Agar TSI.
d.Salmonella sp alcalinizará el caldo dándole una tonalidad púrpura homogénea. En
los casos (-), el medio continuará de color amarillo.
3) Caldo DULCITOL ROJO FENOL
a. Inocular el caldo con una colonia de Agar TSI.
1.Test (+): Salmonella sp dará formación de gas y una reacción ácida (color
amarillo).
2. Test (-): Reacción alcalina con un color rojo en todo el medio y sin formación
de gas.
4) Caldo TRIPTOFANO
a. Inocular el caldo con material de Agar TSI.
c. Repicar en Caldo MALONATO
1. Incubar por 48 hs a 37° C.
2. Test (+): Vira el medio a color azul.
3. Test (-): Continúa el medio de color verde.
d. Repicar en Agar INDOL
1. Inocular desde Caldo TRIPTOFANO.
3. Adicionar 2 – 3 gotas de Reactivo de KOVACS.
4. Test (+): Formación de anillo rojo en la superficie del medio.
5. Test (-): Ausencia del anillo.
e. Repicar en Caldo RM – VP
1. Inocular desde Agar TSI.

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2. Incubar por 48 hs a 37°
C. (a). Test VP
(1)En 1 ml del cultivo anterior, agregar 0,6 ml del Reactivo de VP (alfa
naftol) y agitar.
(2) Agregar 0,2 ml de Na (OH) 40% y agitar.
(3)Leer luego de 4 hs a temperatura ambiente; en los (+) habrá desarrollo
de eosina con un color rojo, mientras que Salmonella sp dará (-), es decir
que el medio no virará su coloración.
(a) Test RM
(1)En 1 ml del cultivo de e., 1., 2., agregar 5 – 6 gotas de Solución ROJO
de METILO.
(2)Leer inmediatamente; en los (+) habrá un color rojo persistente
(Salmonella sp), mientras que en los (-) el medio no virará su coloración
amarilla normal.
f. Agar CITRATO de SIMMONS
1. Inocular desde Agar TSI (flauta y culote).
3. Test (+): El color verde del medio, vira al azul con formación de colonias.
4. Test (-): No hay formación de colonias ni cambio de color en el medio.
5. Salmonella sp, normalmente dará resultados (+).
e) Resultados que indican ausencia de Samonella sp:
1) Indol (+) y Test Serológico Flagelar (H) (-).
2) Caldo KCN (+) y Lisina Descarboxilasa (-).
3) Caldo KCN (+), VP (+) y RM (-).
F. TEST SEROLOGICO PARASALMONELLA SP
a) Test en placa somática polivalente
1)Con un lápiz de alcohol, se delimitará en un portaobjetos o en una placa de Petri,
un área de 1 x 2 cm.
2)En cada sección desleír una porción de colonia de la flauta de Agar TSI más una
gota de solución salina isotónica.

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3)En una de las secciones, añadir 1 gota de antisuero somático polivalente (O) de
Salmonella, mezclando bien por espacio de 1’.
4) Observar inclinando el preparado con buena iluminación.
5)Cualquier grado de aglutinación observada, se interpretará como resultado (+).
(+): Aglutinación de la mezcla, no aglutinación del control salino.
(-): No aglutinación de ninguna sección.
No específica: Aglutinación de ambas secciones.
b) Determinación de grupos somáticos
1) Seguir lo indicado en los pasos anteriores.
2)Continuar con lo indicado en la Sección 41.038 del Método Oficial de Análisis
(AOAC – 1970).
c) Test del Método en tubos para Antígeno Polivalente Flagelar (H)
1) Ver E., c).
d) Test en tubos para “Spicer – Edwards” flagelar (H)
1) Ver E., c).
TABLA VIII – 1: CARACTERISTICAS de SALMONELLA y NO SALMONELLA
Test o Substrato Salmonella A Samonella B No Salmonella Arizona
Ureasa - - + -
Lisina Descarboxilasa + + - +
Rojo Fenol Dulcitol AG AG/A/- - -
Caldo KCN - - + -
Caldo Malonato - - +/- +
Indol - - + -
Test flagelar poliv. + + - +/-
Test somático poliv. + + - +/-
Caldo lactosa rojo fenol
- - AG AG/A/-
Caldo sucrosa rojo fenol
- - AG -
VP - - + -
RM + + - +
Agar Citrato + +/- +/- +

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CAPITULO IX: SHIGELLA
Son sospechosos los alimentos que requieren un procesado manual o un mínimo calentamiento
antes de su consumición. Pueden ser productos animales o productos frescos listos para ser
consumidos. Es altamente probable en aquellos productos con bruscas variaciones de pH (5,5 a
7,5). En general, los alimentos con elevada incidencia de Coliformes, Escherichia coli y
Salmonellas, serán también sospechosos de Shigella.
A. EQUIPAMIENTO y MATERIALES (Semejantes a Samonella, en Capítulo VIII, A.)
B. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
1. Antisuero somático de Shigella poligrupos: A, A1, B, C, C1, C2, D y AD.
2. Caldo CEREBRO CORAZON.
3. Caldo para fermentación de carbohidratos.
4. Agar CITRATO DESOXYCHOCOLATE.
5. Caldo GRAM (-).
6. Agar CITRATO DE KOSER.
7. Caldo RM – VP.
8. Caldo TRIPTONA.
9. Caldo KCN.
10. Agar EMB de Levine.
11. Caldo MALONATO.
12. Agar SIM.
13. Agar NUTRITIVO.
14. Caldo NUTRITIVO.
15. Caldo SELENITO CISTINA.
16. Agar TSI.
17. Caldo UREA.
18. Agar XLD.
19. Solución ALFA NAFTOL.
20. Buffer fosfato para dilución.
21. Reactivo de KOVACS.

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22. Solución de ROJO de METILO.
23. Solución salina estéril.
24. Reactivo de VOGES – PROSKAUER.
C. PROCEDIEMIENTO PARA EL ENRIQUECIMIENTO DE SHIGELLA
1. Enriquecimiento con Caldo GRAM (-):
a. Pesar asépticamente 10 grs de la muestra.
b. Añadir a 20 ml de Caldo GRAM (-) y dispersar completamente.
c. Completar a 240 ml con ese mismo caldo.
d. Tapar y mezclar la solución.
e. Incubar por 16 hs a 37° C.
f. Sembrar en medios selectivos (XLD, DC, EMB. . .) y continuar con el exámen.
g. Reincubar por otras 24 hs a 37° C.
2. Enriquecimiento con Caldo SELENITO CISTINA:
a.Pesar asépticamente 25 grs de la muestra y completar a 225 ml con Caldo
SELENITO CISTINA.
c. Sembrar en medios selectivos (XLD, DC, EMB. . .) y continuar con el exámen.
d. Reincubar por otras 24 hs a 37° C.
D. AISLAMIENTO DE SHIGELLA
1.Mezclar suavemente y sembrar los medios selectivos con ansa de platino de 3 mm de
diámetro.
2. Incubar las placas por 24 hs a 37° C.
3.En todos los medios selectivos, Shigella aparecerá con colonias gris pizarra
completas, con reflejos a la luz y con el tamaño acorde al medio inhibitorio utilizado.
Las colonias en Agar XLD, aparecen también de color rosa y rodeadas de un halo
rosado cuando se ven a luz transmitida.
4.Repicar las colonias sospechosas en Agar TSI en pico de flauta, en toda la superficie y
en el culote.

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5.reincubar las placas por otras 24 hs a 37° C si el crecimiento no fuese francamente
visible.
6.Incubar el Agar TSI por 24 hs a 37° C. Los cultivos (+) a Shigella darán flautas
alcalinas rojas y culotes ácidos amarillos sin producción de gas SH2.
7. Si no hubiera reacciones típicas, reincubar los tubos de TSI por otras 24 hs a 37° C.
8. Cultivos mixtos:
a. Realizar una suspensión liviana con solución fisiológica estéril.
b. Sembrar en estrías sobre Agar BHI.
c. No usar medios inhibidores.
d. Incubar por 24 hs a 37° C.
e. Sembrar en Agar TSI.
E. IDENTIFICACION DE SHIGELLA
1. Tests preliminares
a. Test de Ureasa:
1)Transferir con ansa de 3 mm una porción de colonias de TSI a Caldo UREA,
incubando por 24 hs a 37° C.
2) Descartar Ureas (+) de color rojo.
3) Retener para futuros estudios las Ureas (-) de color amarillo anaranjado.
b. Caldo NUTRITIVO:
1) Inocular tubos con colonias de TSI.
2) Utilizar éste medio para control de inóculo y chequear su movilidad.
c. Agar NUTRITIVO:
1) Sembrar desde cultivos en TSI.
3) Utilizar éste crecimiento para obtener cultivos puros.
4)Testear con Coloración de GRAM: Shigella es Gram (-); Bacilo de 1 – 3 micras x
0,4 – 0,6 micras; no capsulado, no esporulado y por lo general solo y separado.
d. Test de Movilidad:
1)Inocular un tubo de Agar SIM tomando material de Agar TSI con un ansa
puntiforme, de manera vertical y con una profundidad de aproximadamente 5 mm.

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2) Incubar durante 48 hs a 37° C.
3)Un crecimiento circular a la columna de siembre, se considera como movilidad (+)
y debemos tener en cuenta que Shigella en no móvil o movilidad (-).
2. Otras pruebas bioquímicas
El microorganismo sospechoso, es Gram (-), inmóvil, ureasa (-) y debe seguir siendo
sembrado en éstos medios de cultivo:
a. Caldo KCN:
1) Inocular el Caldo KCN con ansa de 3 mm según E, 1, h.
2) Incubar por 48 horas a 37° C.
3)El Caldo KCN (+) dará turbidez en el tubo, mientras que se mantendrá límpido en
el caso de Shigella.
b. Caldo MALONATO:
1) Inocular según 1) del paso anterior.
3)Una reacción (+) se indica por el cambio en el color del indicador que pasará del
verde al azul oscuro; mientras que Shigella es (-), o sea, sin cambios de color.
c. Test del INDOL:
1) Ídem a b., 1).
3) Agregar 0.5 ml del Reactivo de KOVACS y agitar el tubo suavemente.
4)La prueba (+) se indica por un anillo superior de color rojo profundo; Shigella
puede causar la prueba positiva o negativa.
d. Test RM y VP:
1) Inocular un tubo con Caldo MR – VP de acuerdo a c., 1).
2) Incubar 48 a 37° C.
3)Realizar Test de VOGES PROSKAUER (Capítulo VIII, E.) y Test de ROJO de
METILO (Capítulo VIII, E.)
e. Utilización del Citrato:
1)Inocular un tubo con Agar CITRATO de KOSER en pico de flauta y llegando al
culote según d., 1).
2) Incubar 4 – 5 días a 37° C.

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3) Una prueba (+) consistirá en un visible crecimiento que enturbiará el medio y lo
pasará a color azul, mientras que Shigella será (-).
3. Reacciones de fermentación en medios carbohidratados
a. Inocular en Caldos con distintos azúcares desde el cultivo madre.
b. Incubar 4 – 5 días a las 35'C.
c. Examinar diariamente producción de ácido y de gas.
d.Shigella no produce el ácido en: lactosa, sucrosa, salicina, inositol, y adonitol; el
ácido se produce en glucosa, y puede o no producirse en: maltosa, arabinosa, xylosa,
y manitol. Asimismo, Shigella no produce gas en éstos hidratos de carbono.
4. Identificación serológica presuntiva de Shigella (Test de aglutinación en placa)
a. Pruebe un crecimiento de 24 hs de Shigella en Agar NUTRITIVO con el
agregado de poligrupos somáticos: A, A1, B, C, C1, C2, D y Alkalescens – Dispar
(A – D).
b.Emulsionar el crecimiento en 2 ml de solución salina al 0.85% para lograr una
suspensión algo pesada.
c. Marque ocho zonas de 10 mm en una placa de Petri con un lápiz de cera.
d.Localizar una gota de la suspensión de b. en cada borde superior izquierdo de cada
zona dibujada.
e.Colocar en la 1ra zona, 0,05 ml de antisuero A, la misma cantidad pero de A1 en la
segunda y así sucesivamente.
f.Colocar una zona extra con una gota de solución salina al 0,85% como control de
autoaglutinación.
g. Mezclar cada zona con los respectivos antisueros ayudados con una aguja.
h.Usualmente la aglutinación no será rápida, sino que podrá demorarse entre 3 a 4’,
dando casi siempre una floculación total rodeada de líquido clarificado.
i. Una aglutinación (+) con los grupos: A, A1, B, C, C1 y C2, es presuntiva
evidencia de presencia de Shigella, no obstante, deberá esperase el tiempo máximo
para una interpretación final en cada reacción.

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j. En los casos (-), puede calentarse la suspensión celular de b. por un lapso de 30’ a
efectos de destruir al antígeno K que puede interferir en la reacción. Repetir
nuevamente el Test de aglutinación.
5. Características del Grupo Shigella
a. Bacilo Gram (-) inmóvil.
b. Reacción negativa a: Urea, SH2, VP y Citrato.
c. No desarrolla en Caldos KCN ni MALONATO.
d. Indol (-) o (+).
e. Reacción ácida (-) en: Lactosa, Sucrosa, Salicina, Inositol y Adonitol.
f.Reacciones ácidas negativas o positivas pero sin producción de gas en: Glucosa,
Maltosa, Arabinosa, Xylosa y Manitol.
g. No produce gas en caldos carbohidratados.
h. Presuntiva evidencia con aglutinaciones (+) en grupos de antisueros: A, B, C y D.

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CAPITULO X: AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE VIBRIO
PARAHEMOLYTICUS
Vibrio parahemolyticus es un microorganismo marino cuya identidad fue establecida en 1963, por
Sakasaki y colaboradores. Es un germen enteropatogénico, halófilo, Gram (-), anaerobio
facultativo y presente en todos los mares del mundo. En Japón, donde la dieta diaria es en base a
pescados, es la bacteria con mayor clínica de epidemias de gastroenteritis. Está presente de
manera natural en muchas especies marinas y de hecho en los EEUU, se lo ha podido encontrar
tanto en peces como en crustáceos provenientes del Golfo de México, y de los Océanos Atlántico
y Pacífico.
En el verano de 1971, ocurrió en Maryland una sucesión de casos de intoxicaciones atribuidas a
V.parahemolyticus en cangrejos hervidos y salados, que constituyeron la primera evidencia
epidemiológica de intoxicación en dichos alimentos por ésta bacteria dentro de los EEUU, ya que
la misma fue aislada tanto en pacientes como en las comidas contaminadas.
1. Semejantes a Samonella, en Capítulo VIII, A.
2. Hisopos de algodón.
B.MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS (Todos los medios de cultivo utilizados,
deberán tener al menos un 2 – 3% mas de lo normal en concentraciones de ClNa).
1. Agua peptonada alcalina.
2. Medio de cultivo nutritivo para HALOFILISMO (Caldo HSCM).
3. Caldo RM – VP.
4. Caldo (TSB) y Agar TRIPICASE SOYA (TSA) con 3% de ClNa.
5. Caldo SALINO GLUCOSADO (GSTB).
6. Caldo GLUCOSADO HUGH – LIEFSON.
7. Agar SIM.
8. Gelatina.
9. Medio carbohidratado.
10. Caldo ARGININA – LISINA – DESCARBOXILASA.
11. Caldo TRIPTICASE SALADO.

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12. Medio de transporte CARY – BLAIR.
13. Agar TCBS (TIOSULFATO – CITRATO – BILIS – SUCROSA– SALADO).
14. Agar TSI.
15. Caldo TRIPTONA.
16. Medio salino en gradiente.
17. Coloración de GRAM.
18. Reactivo de KOVACS.
19. Solución de Fenildiamina.
20. Solución de ClNa 3% en agua destilada.
21. Reactivo para VOGES – PROSKAUER.
22. Creatina en cristales.
23. Aceite de Parafina estéril.
24. Agar Test KANAGAWA– WAGATSUMA.
C.PROCEDIMIENTO PARA AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE V.
PARAHEMOLYTICUS
1. Muestra de deyecciones: La importancia de de obtener al germen desde hisopados
anales, materia fecal o vómitos de personas enfermas, no debe ser subestimada. Es
altamente probable hallar organismos Kanagawa (+) que son responsables en
definitiva de dichos brotes. La muestra deberá obtenerse de forma rápida al igual que
su transporte al laboratorio, pues la sobrevida es corta.
a. Primer día
1) Si el tránsito será de más de 8 horas:
a)Colocar la muestra de la deyección en el Medio de transporte de CARY –
BLAIR.
b) En el laboratorio, sembrar en estrías sobre Agar TCBS.
c) Proceder según D., 1. (Identificación Bioquímica) de éste mismo Capítulo.
2) Si el tránsito será de 8 horas o menos:
a) Colocar la muestra de la deyección en Agua peptonada alcalina.
b)En el laboratorio, incubar por 8 horas a 37° C y sembrar en estrías sobre
Agar TCBS.

44
3) Hisopado rectal:
a)Colocar el hisopo con la muestra de la deyección en 7 ml de los medios de
1), a) o de 2), a).
b) En el laboratorio, sembrar en estrías sobre Agar TCBS.
2. Muestra de alimentos:
a. Primer día
1)Pesar 50 grs de la muestra del producto marino (peces, mariscos o crustáceos)
eligiendo de preferencia las partes blandas y comestibles de los mismos.
2) Adicionar 450 ml de solución salina al 3% de ClNa.
3) Llevar ésta dilución de 1:10 a centrifugadora de 8.000 rpm durante 1’.
4)Preparar diluciones hasta 1:10.000 o mayores, utilizando la más conveniente de
acuerdo al grado de contaminación alcanzado.
5)Inocular 3 tubos de Caldo GSTB doble concentración con 10 ml de la dilución
1:10 (constituye una porción de 1 gramo).
6)Inocular 1 ml de la dilución 1:10 en diluciones 1:100, 1:1.000 y 1:10.000 sobre
Caldo GSTB concentración simple.
b. Segundo día
1)De cada tubo incubado en a., 5) y 6), sembrar con ansa de 3 mm en sendas
placas con Agar TCBS.
c. Tercer día
1) Apariencia de las colonias de V. parahemolyticus en placas de Agar TCBS:
a) Colonias redondas de 2 – 3 mm de diámetro, con centro verde o azul.
b)Las colonias de V. alginolyticus aparecerán más alargadas y de color
amarillo.
c)Si se presentan Coliformes como Proteus y Enterococos, sus colonias serán
pequeñas y translúcidas.

45
d) Cuando las colonias verde azuladas sean confirmadas como de V.
parahemolyticus con pruebas bioquímicas y/o serológicas (Ver D. a
continuación), se aplicará la Tabla del NMP (Apéndice C) para la enumeración
final de microorganismos/gramo de alimento.
D. PROCEDIMIENTO PARALA IDENTIFICACION BIOQUIMICA
1. Tercer día (Test diferencial I)
a. Repicar con ansa puntiforme en la colonia sospechosa y sembrar en los siguientes
medios:
1) Agar TSI
a) Sembrar en superficie y en profundidad.
b) Incubar toda la noche a 37° C.
c)V. parahemolyticus produce flauta alcalina y culote ácido; asimismo es gas y
SH2 (-).
2) Agar TSA y Caldo TSB con 3% de ClNa
a) Sembrar en superficie y en profundidad, incubando toda la noche a 37° C.
b) Usar como base éstos cultivos para futuros exámenes y coloraciones.
c)V. parahemolyticus es un bacilo Gram (-) pleomórfico (curvado o derecho),
con un flagelo polar.
3) Agar SIM (Teste de Movilidad)
a) Sembrar en profundidad y perpendicularmente por aproximadamente 5 mm.
b) Incubar por 24 hs a 37° C.
c)Un test (+) será cuando haya un crecimiento circular alrededor de la línea de
siembra.
2. Cuarto día (Test diferencial II)
a. Este será otro test a partir de gérmenes móviles, Gram (-), productores de
ácido en culotes y álcalis en flautas de Agar TSI, así como (-) en formación de
gas y de SH2. Se seguirán las siguientes marchas:
1) Caldo HLGB
a) Sembrar 2 tubos de éste medio a partir de Agar TSA con ansa.
b) Sellar uno de los tubos con un anillo de parafina estéril.

46
c) Incubar al menos por 48 hs o más de ser necesario, a 37° C.
d)El cambio de color que puede producirse será de púrpura a amarillo por
fermentación de los carbohidratos presentes en el medio.
e)Si el cambio ocurriera solamente en el tubo abierto, será por oxidación
de los carbohidratos.
f)V. parahemolyticus es (+) a la fermentación de glucosa, sin producción
de gas.
2) Test de la Citocromo oxidasa
a) Sembrar un pico de flauta de Agar TSA del control D., 1., a., 2), b).
c)Agregar 2 – 3 gotas de la solución de alfa naftol sobre la colonia
desarrollada en el pico de flauta.
d) Seguidamente hacer lo mismo con la solución de fenildiamina.
e)La reacción (+) será un rápido desarrollo (dentro de los 2’ siguientes) de
un color azul obscuro.
f) V. parahemolyticus es (+) a dicho test.
3) Caldo ARGININA DESCARBOXILASA
a)Sembrar un tubo de esteclado según Agar TSA del control D., 1., a., 2),
b).
c) Examinar cada 24 hs durante los siguientes 4 días.
d) El medio virará al amarillo por acidificación de la glucosa.
e) V. parahemolyticus es (-) a dicho test.
4) Caldo LISINA DESCARBOXILASA
a)Sembrar un tubo de esteclado según Agar TSA del control D., 1., a., 2),
b).
b) V. parahemolyticus es (+) a dicho test.
5) Nutriente de GELATINA (Hidrólisis de la Gelatina)
a) Sembrar un tubo gelatina según Agar TSA del control D., 1., a., 2), b).
b) Incubar por 1 – 7 días a 37° C.

47
c) Enfriar a 20 º C para proteólisis; si el medio no solidificara, la gelatina
ha sido licuada. Para una mayor certeza, deberá existir un buen desarrollo
de gérmenes. V. parahemolyticus, es un rápido licuefactor de gelatina.
6)Caldo STB (Tripticase salado para halofilismo) Es una de las 3 alternativas
válidas y la elección de la técnica, dependerá de la capacidad del
laboratorio.
a)Utilizando cepas según Agar TSA del control D., 1., a., 2), b).,
sembraremos 4 tubos de Calo STB conteniendo ClNa a las siguientes
concentraciones: 0%, 6%, 8% y 10%.
c)V. parahemolyticus desarrollará en concentraciones de 6% y 8% de
ClNa, mientras que no crecerá en las de 0% ni en las e 10% de ClNa.
7)Medio de cultivo para Halófilos (Caldo HSCM) – Test de alternativa para
gérmenes tolerantes a la sal.
a) Utilizar cuatro matraces con 25 ml de Caldo HSCM, a los cuales se le
agregarán las siguientes concentraciones de ClNa: 0%, 6%, 8% y 10%. A
cada uno se le sembrarán 0,1 ml de solución madre de Caldo TSB
concentración 1:10.
c)V. parahemolyticus desarrollará en concentraciones de 6% y 8% de
ClNa, mientras que no crecerá en las de 0% ni en las e 10% de ClNa.
7)Medio Salado en gradiente con Técnica de Szybalski – Test de alternativa
para gérmenes tolerantes a la sal.
a) Sumergir un hisopo de algodón estéril por 2h hs en Caldo TSB.
b)Escurrir el hisopo en el borde del tubo y sembrar la placa del medio en
estrías siguiendo e gradiente salino, dejando 1 cm entre las siembras.
c) Incubar por 24 hs a 37° C las placas invertidas.
c) V. parahemolyticus desarrollará hasta los límites de la zona roja
concentraciones de 6% y 8% de ClNa, mientras que no crecerá en las de
0% ni en las e 10% de ClNa.
9) Crecimiento a 42° C.

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a)Sembrar un tubo de Caldo TSB, repicando con un ansa desde otro
semejante con inóculo de 24 hs realizado desde el control D., 1., a., 2), b).
b) Incubar en baño de agua a 42° C durante 24 hs.
c) Considerar como (+) a un profuso crecimiento.
d) V. parahemolyticus es (+) a ésta prueba.
10) Test de VOGES – PROSKAUER
a) Inocular un tubo con Caldo RM – VP del control D., 1., a., 2), b).
c) Procedimiento para Test de VP:
(1) Transferir 1 ml del caldo cultivado a 48 hs a un tubo limpio.
(2) Añadir 0,6 ml de α – naftol y mezclar.
(3) Agregar 0,2 ml de Na (OH) 40% y mezclar nuevamente.
(4) Opcionalmente agregar algunos cristales de creatina.
(5) Leer resultados luego de 4 hs a temperatura ambiente.
(6) Test (+) a VP, será aquél que desarrolle una coloración rosa – eosina.
(7) V. parahemolyticus, será (-) a VP.
11) Test del INDOL
a) Inocular un tubo con Caldo TRIPTONA del control D., 1., a., 2), b).
c) Agregar 0,5 ml de Reactivo de KOVACS y mezclar.
d)El test (+) será cuando se forme un anillo de color rojo profundo en la
superficie del tubo.
e) V. parahemolyticus será Indol (+).
12)Fermentación de Carbohidratos (Celobiosa, Sucrosa, Maltosa, Manitol y
Trialosa)
a)Inocular un tubo con cada uno de dichos carbohidratos a partir del
control D., 1., a., 2), b).
b) Incubar por 4 – 5 días a 37° C.
c)Una reacción ácida se verificará por el viraje del color púrpura del caldo
carbohidratado al amarillo.

49
d) V. parahemolyticus no producirá una reacción ácida en celobiosa dentro
de las primeras 24 hs; no fermentará la sucrosa, pero sí fermentará a
maltosa, manitol y a trialosa.
13) Fenómeno KANAGAWA (Agar WAGATSUMA)
La División Microbiología de la FDA – Washington DC, ofrece éste Test de
Fenómeno Kanagawa para el aislamiento de V. parahemolyticus en brotes
sospechosos. Se evidencia por un fenómeno específico de hemólisis en el
Agar WAGATSUMA. Ha sido encontrada una reacción (+) como correlato
de cierra a casos de aislamiento del germen en cuestión, y por lo general
aquellos que dan reacciones (+) en pacientes enfermos, dan reacciones (-) en
aislamiento de productos de mar contaminados.
a)Partiendo de un cultivo de 18 hs en Caldo TRIPTICASE SOYA con 3%
de ClNa, se repicará con ansa en estrías, sobre una placa de Petri con Agar
sangre WAGATSUMA.
c)Un test (+) se considerará cuando exista β hemólisis, es decir se
producirá una zona transparente alrededor de la colonia sospechosa.
d)Es muy importante recordar que la no observación más allá de 24 hs
será muy importante en éste test.
13) Serología: La identificación de los variados serotipos de V.
parahemolyticus llevada a cabo por medio de antisueros específicos aún no
se encuentran comercialmente avalables en los EUA. La FDA a través de su
División Microbiología, ofrece el servicio de identificación serológica en
aislamientos de productos marinos, así como de brotes producidos.
E. CARACTERISTICAS PARA LA IDENTIFICACION DE V. PARAHEMOLYTICUS

50
TEST RESULTADOS
Coloración de Gram Gram (-)
Morfología Bacilo curvado a derecho
Movilidad Móvil
Hugh – Liefson glucosa Fermentación (+) sin gas
Citocromo oxidasa (+)
Arginina descarboxilasa (-)
Lisina descarboxilasa (+)
Gelatina Licuefacción
Tolerancia al ClNa (+) 6%, 8%; (-) 0% y 10%
Crecimiento a 42° C (+)
Voges – Proskauer (-)
Indol (+)
Celobiosa Fermentación (-) dentro de las 24 hs
Sucrosa No fermenta
Maltosa Fermenta
Manitol Fermenta
Trialosa Fermenta
1.Esta será una lista mínima de control rápido con características específicas para V.
parahemolyticus, cuya presunción podrá definirse simplificando en las siguientes:
a. Morfología: bacilo curvo Gram (-).
b. Citocromo oxidasa: (+).
c. Test de Hugh – Liefson: Glucosa (+) y gas (-).
d. Apariencia de colonias en Agar TCBS: Típico color azul verdoso.
e. Agar TSI: Flauta alcalina, culote ácido, gas y SH2 (-)
f. Crecimiento a 42° C: (+).
g. Test de halofilismo: (+) a 8% de ClNa y (-) al 10%.
h. Test de Lisina descarboxilasa: (+).
i. Voges – Proskauer: (-).
j. Sucrosa: (-).

51
F. SUPLEMENTO AL METODO DE DETECCION DE V. PARAHEMOLYTICUS
Recientemente (1971), Twedt R. M. y Novelli R. M., propusieron una modificación al
método selectivo y diferencial para el aislamiento de V. parahemolyticus. Posteriormente,
hubo modificaciones sobre el mismo, realizadas por Vanderzant y Nickerson, quienes
trabajaron en el marco de la Universidad de Texas. A continuación detallaremos éstos
procedimientos que demuestran la presencia del germen en muestras sospechosas de
alimentos. Para cualquier comentario al respecto, favor de dirigirse al Dr. M. Fishbein,
División Microbiología, FDA, 200 C Street, S. W., Washington D C 20204 (teléfono: 202
– 962 – 7209).
1.Medio de Cultivo: MT (Modificado por Twedt): 2% de peptona, 0,2% de extracto de
levadura, 1% de almidón de maíz, 7% de ClNa y 1,5% de agar, a pH 8.0.
2.Apariencia de las colonias en Agar MT: Color blancas a cremas, circulares, lisas y
amilasa (+).
3. Procedimiento:
a. Mezclar 50 grs del alimento con 450 ml de ClNa 7% por 2’.
b. Realizar diluciones seriales en ClNa 7% estéril.
c.Extender sobre placas de Agar MT, 0,1 ml de cada dilución e identificar a dichas
placas.
d. Incubarlas aeróbicamente por 24 – 48 hs a 42° C.
e.Repicar aquellas colonias sospechosas con las siguientes características: colonias
blancas o cremas, circulares, lisas y amilasa positivas.
f. Completar aislamiento con la identificación correspondiente.
g.Cada enriquecimiento estará identificado con la dilución efectuada en b. (10, 1 y
0,1 ml del homogenado del Caldo TRIPTICASE SOYA con ClNa 7%).
h.Luego de 18 hs a 42° C, repicar los tubos de caldo en estrías, sobre placas de Agar
MT.
i. Incubarlas por 24 – 48 hs a 42° C.
j. Identificar las colonias aisladas.

52
CAPITULO XI: CLOSTRIDIUM BOTULINUM
NOTA: NO REALIZAR ESTOS ANALISIS HASTA NO CONTAR CON LAS DEBIDAS
PROTECCIONES Y LOS CORRESPONDEINTES TOXOIDES.
1. Jeringas de 1 – 2 ml con aguja de 5/8”.
2. Filtro Millipore UF o similar.
3. Centrífuga refrigerada.
4. Mortero y licuadora o mezcladora, estériles.
5. Estufas de cultivo de 26° C y de 37° C.
6. Baño María a 37° C.
7. Tubos estériles para centrífuga.
8. Agujas estériles.
10. Pipetas graduadas y estériles de: 1, 5 y 10 ml.
11. Tubos de test estériles.
12. Bolsas plásticas impermeables con cierre hermético.
13.Ratas blancas de laboratorio de aproximadamente 20 grs: 14 para análisis de
screening y 24 para positivos.
B. Medios de cultivo y reactivos.
1. Antitoxinas A, B y E liofilizadas.
2. Tripsina DIFCO (Actividad 1:250) solución al 10% filtrada en agua destilada.
3. Alcohol etílico absoluto y al 70%.
4. Na (OH) 1 N.
5. Solución fisiológica estéril.
6. Diluyente de gel fosfato.
7.Caldo TRIPTICASE PEPTONA GLUCOSA LEVADURA con agregado de Tripsina
estéril (TPGYT).
8. Caldo de Hígado triturado.
9. Agar HUEVO ANAEROBICO.

53
C. Detección de toxinas preformadas en alimentos.
1.Al tratar con alimentos sospechosos, las superficies serán bien fregadas con cepillos,
agua, jabón y mucho enjuague.
2.Sanitizar luego del lavado con ligeras capas de soluciones de yodo al 2% o alcohol
70%.
3.Finalmente, manipular el recipiente con el alimento problema, abriéndolo
cuidadosamente y con mucha precaución.
4. Registrar la condición de sus componentes.
5.Se puede testear rápidamente el líquido presente para detectar presencia de toxinas
y/o reservar para otros tratamientos.
6. Preparar el remanente del alimento sólido de la misma manera que las muestras
generales.
7.Macerar asépticamente la muestra remanente de alimento con idéntica cantidad de
diluyente gel fosfato, en un mortero estéril, hasta obtener una suspensión homogénea.
8. Centrifugar con refrigeración a 7000 rpm por 30’.
9.Filtrar por filtro millipore o similar (no Seitz) para obtener un filtrado estéril, que
deberá refrigerarse de ser necesario posponer su uso para el día siguiente.
10. Ajustar a pH 6.0 – 6.2 con ClH 1 N.
11.Por cada 1,8 ml de filtrado ajustado, adicionar 0,2 ml de una solución de Tripsina
2%.
12. Incubar en Baño María de 37° C por 45’ y enfriar.
13. No guardar el extracto tripsinizado de un día para el otro.
14. Calentar una porción de filtrado estéril a 100° C por 10’.
15.Diluir con gel fosfato tanto los filtrados tripsinizados como los no tripsinizados,
siguiendo las diluciones: 0 (no diluidos), 1:10 y 1:100.
16.En ratas de laboratorio, inyectar 0,5 ml de cada dilución de cada filtrado, de forma
intraperitoneal.
17. Asimismo, inyectar en 2 animales, 0,5 ml intraperitoneales de filtrado calentado
en 14.
18.Por un lapso de 72 hs, observar a los animales, registrando sus muertes y anotando
los posibles síntomas de botulismo y sus presentaciones.

54
19.Clasificar muy bien los animales para que al describir sus muertes concuerden con
los de evidencia de toxina botulínica. Asimismo, no deberían morir los inyectados en
17.
20. Confirmar los decesos con los ratones protegidos.
a. Diluir una nueva porción de filtrado tripsinizado o no tripsinizado escogiendo
cualquier título de 1:2, 1:10 y 1:100 el diluyente de gel fosfato (No guardar material
tripsinizado de un día para el otro).
b.En 6 ratas de laboratorio, inyectar intraperitonealmente 0,5 ml de una dilución
salina 1:5 de Antitoxina A, B y E liofilizadas y dejar otros 6 ratones sin protección.
c.Después de 30’, inyectar 0,5 ml de cada dilución del filtrado en los 2 ratones
protegidos y en 2 no protegidos.
d.Observar durante 72 hs a los roedores detectando los síntomas de botulismo, y
registrar todas las muertes.
e.Deberán morir, obviamente los ratones sin protección, y quedarán vivos los
inoculados con las antitoxinas de b.
D. Detección de Cl. botulinum tipo A, B y E.
Si un alimento es sospechoso de haber sido contaminado con toxina botulínica, o
deliberadamente envenenado, se deben seguir los pasos de C. y D. En cambio, si el
alimento es investigado en forma rutinaria y sin ninguna sospecha, solamente se seguirá lo
expresado en D. Si se encuentra evidencia de toxina, entonces deberá también aplicarse el
método de C.
1.Inocular 3 tubos de Caldo de Hígado picado estéril con 3 – 4 grs de la muestra a
analizar.
2. Realizar el mismo procedimiento, pero en 3 tubos de Caldo TPGYT.
3. Incubar 1. por 5 días a 37° C.
4. Incubar 2. por 5 días a 26° C.
5.Siguiendo con la incubación separadamente combinar alícuotas de ambos tubos
entre sí.
6. Centrifugar los tubos combinados refrigeradamente durante 30’ a 7000 rpm.

55
7.Filtrar por filtro millipore o similar (no Seitz) para obtener un filtrado estéril, que
deberá refrigerarse de ser necesario posponer su uso para el día siguiente.
8. Calentar una porción de filtrado estéril a 100° C por 10’.
9. De ése filtrado realizar diluciones en gel fosfato estéril, 1:5, 1:10 y 1:100.
10.Inyectar intraperitonealmente 0,5 ml de cada filtrado de cada dilución en 2 ratas de
laboratorio así como 0,5 ml del filtrado calentado no diluido en otros dos ratones.
11. Por un lapso de 72 hs, observar a los animales, registrando sus muertes y anotando
12.Clasificar muy bien los animales para que al describir sus muertes concuerden con
los de evidencia de toxina botulínica.
13. Confirmar muertes según C., 20., b.
E. Detección de Cl. botulinum tipo E en pescados ahumados.
1.Colocar una muestra de pescado ahumado que podrá ser o una pieza entera o bien el
jugo de su contenido, dentro de una bolsa plástica impermeable y de cierre hermético.
2.Adicionar aproximadamente 100 ml de Caldo TPGYT dentro de dicha bolsa
(suficiente para lograr cubrir la muestra).
3.Al mismo tiempo, conviene apretar cuidadosamente la bolsa a fin de excluir todo el
aire remanente sumergiendo así la muestra en el medio de cultivo.
4. La bolsa debe sellarse en lo posible térmicamente.
5. Incubar por 5 días a 26° C.
6.Siguiendo a la incubación, realizar un corte a la bolsa y extraer asépticamente 25 ml
del medio y llevarlo a un tubo de centrífuga estéril.
7. Centrifugar 30’ a 7000 rpm.
8.Filtrar por filtro millipore o similar para obtener un filtrado estéril, que deberá
refrigerarse de ser necesario posponer su uso para el día siguiente.
9. Diluir el filtrado estéril en diluyente de gel fosfato, 1:5, 1:10, 1:100 y 1:1.000.
10.Inyectar intraperitonealmente 0,5 ml de cada filtrado de cada dilución en 2 ratas de
laboratorio.
11.Por un lapso de 72 hs, observar a los animales, registrando sus muertes y anotando

56
12. Si no ocurriesen muertes no continuar con los tests.
13. Confirmar muertes con ratones protegidos.
a. Diluir de filtrados estériles, nuevas porciones como en E., 9.
b.Inyectar a cada uno de 8 ratones blancos, la cantidad de 0,5 ml de dilución salina
1:5 de antitoxina E, y mantener a 8 ratones más sin protección.
c.Después de 30’, inyectar 0,5 ml de cada dilución del filtrado en los 2 ratones
d.Observar durante 72 hs a los roedores detectando los síntomas de botulismo, y
registrar todas las muertes. La presencia de toxina tipo E se manifiesta por la muerte
de los ratones no protegidos y la inmunidad en los protegidos con la antitoxina.
e.Si muriesen todos los protegidos, repetir el test de neutralización serológica con
ratones protegidos con antitoxinas botulínicas tipos A y B de acuerdo a C., 20., b.
f. Observar durante 72 hs a los roedores detectando los síntomas de botulismo, y
registrar todas las muertes. La presencia de toxinas tipos A y B se manifestarán por
la muerte de los ratones no protegidos y la inmunidad en los protegidos con las
antitoxinas antes mencionadas. Si murieran todos los roedores protegidos, consultar
con la División Microbiología de la FDA en Washington DC para considerar otros
tests.
F. Aislamiento de Cl. botulinum.
El aislamiento del germen desde cultivos puros solamente se realizará previa
confirmación de la toxina específica que se encuentre.
1.En un tubo de ensayo estéril, colocar 1 – 2 ml de cultivo tóxico e igual volumen de
alcohol etílico absoluto.
2. Permitir reposar por una hora a temperatura ambiente.
3. Sembrar por duplicado y en estrías sobre Agar HUEVO para anaerobiosis.
4. Salvar el remanente del cultivo tóxico.
5. Incubar en anaerobiosis por 48 horas a 37° C.
6.Examinar la presencia potencial de colonias típicas de Cl. botulinum: Colonias blancas
a amarillo pálido, planas, irregulares, de 1 – 2 mm de diámetro, rodeadas de una
tono amarillo más intenso de 2 – 4 mm de diámetro que a la luz oblicua da tonos

57
perlados e iridiscentes que son asimismo característicos de otras colonias de Clostridium
y por ello hay que ser medidos en su apreciación y posterior interpretación de los
resultados.
7.Repicar ésas colonias sospechosas en Caldo TPGYT una vez que hemos confirmado la
toxinas tipos E y en Caldo de hígado triturado con las toxinas tipos A y B
confirmadas.
8.Incubar los tubos con Caldo TPGYT por 5 días a 26° C y los de Caldo de hígado
triturado también por 5 días pero a 37° C.
9.Seguidamente a la incubación, centrifugar cada cultivo (solamente el sobrenadante en
el caso del Caldo de hígado triturado) bajo refrigeración y a 7000 rpm durante 30’.
10. Filtrar por filtro millipore o similar para obtener un filtrado estéril, que deberá
refrigerarse de ser necesario posponer su uso para el día siguiente.
11. Diluir una porción del filtrado estéril en diluyente gel fosfato, 1:10 y 1:100.
12.Inyectar a 4 ratones intraperitonealmente con 0,5 ml de una dilución salina 1:5 de la
antitoxina previamente confirmada y a otros 4 roedores, dejarlos sin protección como
controles.
13.Después de 30’, inyectar 0,5 ml de cada dilución del filtrado en los 2 ratones
14. Observar durante 72 hs a los roedores detectando los síntomas de botulismo, y
registrar todas las muertes. Si mueren los no protegidos y se salvan los protegidos,
confirmaremos el aislamiento del germen con el tipo correspondiente a la antitoxina
estudiada.
G. Detección de la toxina en el suero sanguíneo.
1. Obtener el suero del paciente a estudiar.
a. 10 ml serán suficientes para testear y tipificar la toxina presente.
2. Refrigerar de ser necesario para otros estudios.
3. Calentar una porción de suero a 100° C por 10’.
4.Diluir una porción de suero no calentado 1:5 y retener otra porción no diluida para
inyección IP.
5. Inyectar 0,5 ml de cada dilución IP en 2 ratones.

58
6. Asimismo inyectar 2 ratones adicionales IP con suero calentado y sin diluir.
7.Observar durante 72 hs a los roedores detectando los síntomas de botulismo, y
8.Considerar las muertes de ratones inyectados con suero no calentado y con síntomas
de botulismo y los sobrevivientes a las inyecciones de sueros calentados y sospechosos
de toxina.
9. Confirmar muertos con protegidos.
a.Inyectar a 2 ratones IP con 0,5 ml de solución salina conteniendo 1 U de antitoxina
tipo A y similarmente en otros tantos animales la misma técnica y
cantidad de antitoxinas tipos: B, C, D, E y F.
b. Diluir todas las antitoxinas en 0,5 ml.
c. Dejar a 2 ratones sin protección.
d. Luego de 30’, inyectar 0,5 ml de suero no diluido en cada ratón.
e.Observar durante 72 hs a los roedores detectando los síntomas de botulismo, y
f.Si mueren los no protegidos y viven los protegidos, se confirmará el tipo presente
con el correspondiente vivo versus muerto.

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CAPITULO XII: AISLAMIENTO DE CLOSTRIDIUM
PERFRINGENS (WELCHII)
La presencia de Clostridium perfringens en alimentos contaminados, puede ocurrir por ejemplo,
cuando se cocinan aves y no se refrigeran adecuadamente antes de ser consumidas. El nivel de
oxígeno durante la cocción es suficientemente reducido como para permitir el desarrollo del
clostridio. El cuadro gastroentérico comienza unas 8 – 15 hs luego de la ingestión del alimento
con intensos calambres intestinales, meteorismo y diarrea; son raros de ver las náuseas y los
vómitos. Las víctimas se recuperan usualmente pronto, pero ocasionalmente pueden ocurrir
episodios graves de deshidratación y falla circulatoria.
En lo posible se deberá trabajar analizando la porción entera del alimento (carnes, pollos, etc). Se
analizará inmediatamente evitando el frizado de la muestra. Solamente usar éste medio cuando la
muestra no pueda ser analizada dentro de las próximas 24 – 48 hs. El frizado, destruirá el 99% de
las formas vegetativas de Cl. perfringens, mientras que solamente la refrigeración normal
destruye cerca del 90% de las mismas.
1. Jarra de anaerobiosis.
2. Licuadora de acero inoxidable estéril o mortero estéril.
3. Estufa de esterilización de 26° y 37° C.
4. Baño María a 46° C.
B. MEDIOS DE CULTIVO y REACTIVOS
1. Caldo de hígado triturado o medio de carne cocida.
2. Agar YEMA DE HUEVO CARNE VACUNA (LVEY).
3. Agar INDOL NITRATO o NITRATO MOVILIDAD.
4. Agar de ELLNER.
5. Agar SULFITO POLIMIXINA SULFADIAZINA (SPS).
6. Agar TRIPTOSA SULFITO CICLOSERINA (TSC).
7. Caldo TIOGLICOLATO.
8. Medio de Leche y Hierro.
9. Diluyente de agua peptonada.
10. Coloración de Gram.

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11. Reactivos I y II para reducción de nitrato.
C. PROCEDIMIENTO PARAEL AISLAMIENTO
1.Preparar sobre un portaobjeto un extendido del cultivo y realizarle la coloración de
Gram. Observar al microscopio en búsqueda de bacilos Gram (+).
2. Pruebas culturales.
a.Al examen directo se observan bacilos Gram (+) típicos, si es así repicar en Caldo
TIOGLICOLATO, salvo que la muestra se encuentre contaminada con
microorganismos aeróbicos.
b. De haber contaminación se debe repicar en Caldo de Hígado triturado.
c. Asimismo todas las muestras deben sembrarse en Agar SPS.
3. Caldo TIOGLICOLATO.
a.Inocular de dos a tres gramos en sendos tubos del medio anteriormente
mencionado.
b. Incubar en baño maría a 46°C durante cuatro a ocho horas.
c. Continuar la marcha sembrando en los medios detallados a continuación.
4. Caldo de Hígado triturado.
a.Calentar en baño maría de agua hirviendo los tubos con el medio alrededor de 10
minutos a fin de que pueda eliminarse casi todo el oxígeno antes de su uso. El medio
debe estar preparado en tubos con tapa a rosca. Inocular 2 a 3 gramos de la muestra
de 3., en los tubos anteriormente mencionados, los cuales deberán enfriarse
previamente.
b. Incubar en jarra de anaerobiosis a 37°C durante 24 a 48 horas.
c.Observar aquellos tubos con una profusa producción de gas y examinar la
probable presencia de bacilos Gram (+) en cada uno de ellos.
5. Repicar los tubos positivos en placas de Agar LVEY.
6.Incubar dichas placas en anaerobiosis a 37°C durante 24 o 48 horas; luego de la
incubación examinar las colonias productoras de lecitinasa (zonas opalescentes de 2 a
5 mm de diámetro rodeando la colonia). Para confirmar colonias de Clostridium
Perfringens ver D.
7. Conteo de Clostridios viables en placa.

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a.Macerar de 25 a 50 gramos de la muestra con agua de peptona en un mortero
estéril o en licuadora estéril durante un minuto a baja velocidad.
b. De ser necesario realizar diluciones seriadas con agua peptonada.
c.Preparar placas de Agar SPS; después que el agar ha solidificado colocar 5 ml en
una segunda capa pero previamente verter 0,1 ml de la dilución que se ha preparado.
Alternativamente sembrar 0,1 m de la solución apropiada en Agar TSC y en 10 ml
de Caldo yema de huevo.
d. Incubar las placas en anaerobiosis durante 18 a 24 horas a 37°C.
e. Se deben contar las colonias que reducen el sulfato y son de color negro.
f. Repicar dichas colonias para realizar las pruebas de confirmación.
D. CONFIRMACIÓN DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS.
1.Repicar la colonia típica desde Agar LVEY y Agar SPS al Caldo de Hígado triturado
o Caldo TIOGLICOLATO.
2. Incubar a 37°C por 18 a 24 horas.
3.Cuando se ha obtenido un cultivo puro prepara dos placas con Agar LVEY e incubar
aeróbica y anaeróbicamente a 37°C durante 18 a 24 horas, reportando cualquier
crecimiento en cualquiera de las placas.
4.Inocular el Medio de leche y hierro incubándolo a 37°C por 24 horas. Observar
producción de gas y coagulación o fermentación láctea.
5.Inocular por duplicado tubos con Medio indol nitrato o movilidad nitrato. El inóculo
será de 1 ml y deberá realizarse insertando la pipeta cuando el medio se encuentre en
estado semisólido insuflándolo al mismo tiempo que retiramos la pipeta
antes que se solidifique completamente.
6. Incubar a 26°C por 18 a 24 horas.
7.Examen del test para movilidad: Clostridium Perfringens es inmóvil, su crecimiento
ocurre a lo largo de la línea del inóculo pero no se difunde dentro del medio.
8.Adicionar 5 gotas de reactivos I y II a los tubos que experimenten crecimiento. Una
coloración rosa a roja indica reducción del nitrato al nitrito.
9.Reportar a Clostridium Perfringens como Gram (+), inmóvil, esporulado, anaerobio
obligatorio con reducción del nitrato al nitrito y producción de fermentación en el
Medio de leche y hierro.

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E. MÉTODO PARA LA INVESTIGACIÓN DE α TOXINA DE CLOSTRIDIUM
PERFRINGENS.
La población de formas vegetativas de esta bacteria declina rápidamente en alimentos
refrigerados o congelados. Para obtener recuentos viables de dicho microorganismo y
determinar brotes de enfermedades asociadas a él, las muestras remitidas al laboratorio
deberán examinarse de manera pronta con una conservación a baja temperatura (entre 8 a
10°C).
La α toxina que Clostridium Perfringens produce en el alimento es completamente estable
y proporcional al número de gérmenes presentes. Es importante conservar el máximo
nivel de población de gérmenes en el alimento para estimar una cuantificación de la
toxina lo más acertada posible. Este método es particularmente importante para muestras
llegar alque han estado congeladas o refrigeradas a bajas temperaturas antes de
laboratorio.
1. Equipamiento y material de vidrio.
a. Filtros Seitz de 250 mL de capacidad, estériles.
b. Licuadora estéril de hacer inoxidable.
c. Ultracentrífuga preferiblemente refrigerada.
d. Tubo de goma de un ¼” por 1/16” y de 5/16” por 1/16”.
e. Tubuladura para diálisis de ¾” de pulgada de diámetro.
f. Papel de filtro Whatman número 31 o equivalente.
g. Colador de malla fina.
h. Refrigerador a 4Colador de malla fina.
h. Refrigerador a 4°C.
i. Estufa de cultivo a 37°C.
j. Tubo de acero inoxidable de 3 mm de diámetro.
k. Frasco de vacío de 1 Litro.
l. Embudos de 75 a 100 ml.
m. Vasos de precipitado de varios tamaños.
n. Pipetas Pasteur.
o. Probetas de 100 y 500 ml.

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p. Botellas de 200 ml.
q. Tubos de centrifuga, de vidrio o policarbonato, de 100 a 250ml.
r. Tubos de ensayo estériles de 13 x 100 mm y 150 x 20mm.
s. Placas de Petri de 100 x 15 mm estériles.
t. Pipetas estériles de 1, 5 y 25 ml.
2. Materiales.
a. HEPES grado a.
b. Polietilenglicol 20.000 M. W.
c. Agar purificado.
d. Huevos frescos.
e. Glóbulos rojos humanos frescos.
f. Antisuero tipo A para diagnóstico de Clostridium Perfringens.
g. Solución fisiológica estéril.
3. Preparación de placas indicadoras de hemolisina.
a.Lavar los glóbulos rojos humanos por tres veces agregando tres o cuatro
volúmenes de solución salina 0,85% y centrifugar por 10 minutos a 2500 RPM.
b. Resuspender los glóbulos rojos lavados en igual volumen de solución salina.
c.Agregar 11 ml de glóbulos rojos lavados a 100 ml de Agar sangre base a 50°C;
mezclar y dispensar 7 ml dentro de una placa de Petri.
d. Dejar las placas toda la noche a temperatura ambiente y refrigerar a 4°C:
e.Realizar pocillos aplicando vacío con el tubo de metal estéril de 3 mm de diámetro
presionando sobre la superficie del agar, espaciados 3 cm entre sí.
f. Realizar dos pocillos adicionales separados 3 cm cerca del centro de la placa.
4. Proceso de extracción y dilución.
a.Homogeneizar 25 gramos de alimento (evitar las grasas) con 100 ml de HEPES-
salino en una licuadora estéril por dos minutos a alta velocidad.
b.Centrifugar el homogenado por 20 minutos a altas revoluciones a 5°C, y verter el
sobrenadante a través de un embudo de malla fina para remover las grasas; descartar
el precipitado.
c.Centrifugar nuevamente en caso de ser necesario para clarificar el sobrenadante.
Las grasas deberán ser removidas del homogenado centrifugado manteniéndolo a

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temperatura ambiente por 1 o 2 horas y luego llevar a 4°C filtrando previamente por
papel de filtro Whatman número 31 o similar.
d. Enjuagar el filtro Seitz de 250 ml con 15 ml de solución fisiológica estéril.
e. Una vez descartada la solución fisiológica, filtrar el sobrenadante esterilizado.
f.Enjuagar el filtro con otros 10 ml de solución salina para remover α toxinas
residuales.
g. Sumergir 30 cm de tubo de diálisis en agua destilada durante 30 minutos.
h. Siempre al enjuagar cualquier material utilizar solución salina estéril.
i. Transferir el extracto filtrado del alimento a un saco de diálisis, concentrándolo
entre 5 a 7 ml con 400 ml de polietilenglicol al 20 o 30 %.
j. Lavar o enjuagar el saco de diálisis el remover el polietilenglicol, coleccionando el
extracto concentrado en tubos estériles.
5. Prueba de la toxina.
a. Ajustar el volumen del extracto concentrado a 5-7 ml.
b.Prepara una batería de 10 tubos estériles de 13 x 100 mm. A todos ellos excepto el
primero y el último (todos los tubos estarán numerados del 1 al 10), adicionar 0,5
ml de solución salina estéril a pH 7.0.
c. Adicionar 0,5 mL de extracto concentrado al primer y segundo tubo.
d.Mezclar el extracto y la solución salina del segundo tubo transfiriendo 0,5 ml del
mismo al tercer tubo realizando la misma técnica de tubo en tubo, logrando
diluciones de 1:2 a 1:256. Utilizar una pipeta por cada tubo.
e. Mezclar 0,25 ml del extracto, 0,25 ml de solución salina y 0,1 ml de dilución 1:10
de antitoxina diagnóstica de Clostridium Perfringens tipo A en el último tubo para
determinar si la lecitinasa o la hemólisis es debido a la toxina (tubo control).
f. Preparar pipetas Pasteur flameándolas en un mechero Bunsen.
g.Preparar las siembras de los extractos puros y diluidos en placas por duplicado
para la prueba de la hemolisina. Sembrar el los pocillos periféricos de las placas.
h. Llenar los pocillos centrales de cada placa con la mezcla de antitoxina en uno y
en el otro pocillo con diluyente salino estéril.
i. Luego de preparar las placas, adicionar 0,5 ml de Solución Lecito – vitelina (LV) a
cada tubo de extracto diluido.

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j. Colocar las placas sembradas y los tubos dentro de bolsas plásticas impermeables,
e incubar a 37° C por 24 hs.
6. Crecimiento estimativo anterior de Cl. perfringens.
a. terminada la incubación anterior, refrigerar las placas por 2 hs y medir las zonas
de hemólisis desde los bordes de las mismas: las últimas tres diluciones antes del
punto final, deberán exhibir 1 mm de reducción en sus zonas conforme disminuyen
las diluciones; ejemplos: 4, 3, 2 y 1 mm. La última dilución será el “punto final de
dilución” de la serie.
b.Asimismo notaremos una actividad de lecitinasa en la Solución LV indicada por
una opacidad que irá decreciendo progresivamente con la dilución correspondiente.
Un máximo de 4+ de reacción, corresponderá a una gruesa película de lípidos sobre
una solución clara subyacente. Decrecerá hasta el 1+ en donde la película es casi
inexistente en una solución opaca y aquí se verificará entonces, el “punto final de
dilución” para la prueba de LV.
c.Para poder estimar la población de Cl. perfringens en al alimento analizado, se
deberá comparar el título de alfa toxina presente versus el estimado de
gérmenes/gramo de alimento (Tabla XII – 1). En el caso de observarse discrepancias
entre las comparaciones intratécnicas, será más real lo representado por las placas de
HI.
Tabla XII – 1: Correlación entre población estimada de Clostridium perfringens y
títulos de alfa toxina producida en alimentos
Títulos de Alfa toxina
Placas de HI Test LV
Estimado de Cl
perfringens/gramo (106
)
No diluido - 1,2
1:2 No diluido 2,5
1:4 1:2 6,5
1:8 1:4 9,5
1:16 1:8 25
1:32 1:16 55
1:64 1:32 80
1:128 1:128 150
1:256 1:256 210

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CAPITULO XIII: BACILUS CEREUS
Bacillus cereus es un germen ubicuitorio del organismo y del medio ambiente; esporulado,
aeróbico y encontrado además en las verduras, y en muchos alimentos crudos y procesados. El
crecimiento del microorganismo tendrá lugar cuando las comidas sobre todo húmedas, no fueran
refrigeradas adecuadamente. Conteos de B. cereus relativamente altos (107
o mayor por gramo)
tienen el potencial para causar sintomatologías similares a intoxicaciones por Cl. perfringens.
1.Requerimientos semejantes a los listados en el Capítulo II para la preparación de
homogenados de alimentos.
2. Placas de Petri de vidrio o plástico.
3. Pipetas de 1 ml graduadas.
4. Estufas de cultivo a 30° C.
B. MEDIOS de CULTIVO y REACTIVOS
1. Agar YEMA DE HUEVO – ROJO FENOL – PLOIMIXINA (HFP)
2. Caldo ROJO DE FENOL CABOHIDRATADO (RFC)
3. Caldo NITRATO
4. Agar ALMIDON
5. Leche tornasolada
6. Caldo MR-VP
7. Nutriente de Gelatina
8. Agar NUTRITIVO
9. Tinción de GRAM
10. Solución de Yodo de Gram
11. Solución de Acido Sulfanílico
12. Solución de alfa – naftilamina
13. Cristales de Creatina
14. Solución acuosa al 40% de K (OH)
15. Solución de alfa – naftol

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