Avances en técnicas serológicas, de imagen y diagnóstico molecular de la infección por Toxoplasma gondii

1. 2
1
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4
REVISIÓN
Palabras clave Avances · Diagnóstico · Infección por Toxoplasma gondii · Toxoplasmosis
Antecedentes La toxoplasmosis es una enfermedad infecciosa zoonótica de distribución mundial con importancia médica en pacientes
inmunocomprometidos, mujeres embarazadas y recién nacidos con infección congénita. Tener información básica sobre los métodos tradicionales
y nuevos desarrollados es fundamental para los médicos generales y especialistas en enfermedades infecciosas para elegir un enfoque de
diagnóstico adecuado para el diagnóstico rápido y preciso de la enfermedad y, en consecuencia, el tratamiento oportuno y eficaz.
Ali Rostami1 · Panagiotis Karanis2 · Shirzad Fallahi3,4
Métodos Realizamos búsquedas de literatura en inglés en PubMed desde 1989 hasta 2016 utilizando palabras clave relevantes y resumimos los
avances recientes en el diagnóstico de toxoplasmosis.
Resultados El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) fue el método más utilizado en el siglo pasado. Los métodos basados en
ELISA recientemente avanzados, incluidos los ensayos de quimioluminiscencia (CLIA), el ensayo de fluorescencia ligada a enzimas (ELFA), la
prueba inmunocromatográfica (ICT), la prueba de avidez de IgG en suero y los ensayos de aglutinación inmunoabsorbente (ISAGA), han
demostrado una alta sensibilidad y especificidad. Estudios recientes que utilizan antígenos recombinantes o quiméricos y el método de péptidos
multiepítopos demostraron resultados muy prometedores para el desarrollo de nuevas estrategias capaces de discriminar infecciones adquiridas
recientemente de infecciones crónicas. La PCR en tiempo real y la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) son dos métodos basados
en PCR recientemente desarrollados con alta sensibilidad y especificidad y podrían ser útiles para el diagnóstico temprano de infecciones. La
tomografía computarizada, la resonancia magnética, la imagen nuclear y la ultrasonografía podrían ser útiles, aunque sus resultados podrían no ser específicos po
La infección por el parásito protozoario Toxoplasma gondii tiene una
distribución mundial. Los seres humanos, así como prácticamente
todos los animales de sangre caliente, incluidos los mamíferos y las
aves, pueden infectarse con este parásito intracelular obligado [1–3].
Las principales fuentes de infección son la carne poco cocinada, las
verduras sin lavar y los suelos contaminados [1, 4]. La infección
primaria por T. gondii en huéspedes con un sistema inmunitario sano
suele aparecer como síntomas leves parecidos a los de la gripe,
mientras que en pacientes con un sistema inmunitario debilitado o
deteriorado puede causar infecciones potencialmente mortales.
Además, la transmisión transplacentaria de T. gondii durante el
embarazo puede causar problemas graves que pueden dar lugar a
abortos, mortinatos o anomalías neonatales [5–9]. También
recientemente, la toxoplasmosis se conoce como un factor de riesgo
para trastornos neurológicos y psiquiátricos [10]. En consecuencia, el diagnóstico de to
Conclusión Esta revisión proporciona un resumen de los métodos desarrollados recientemente y también intenta mejorar su sensibilidad para el
diagnóstico de toxoplasmosis. Las tecnologías serológicas, moleculares y de imagen tienen cada una sus propias ventajas y limitaciones que
ciertamente pueden lograr un diagnóstico defnitivo de toxoplasmosis al combinar estas técnicas de diagnóstico.
Resumen
Introducción
Vol.:(0123456789) 1 3
Avances en técnicas serológicas, de imagen y diagnóstico molecular
de la infección por Toxoplasma gondii
Departamento de Parasitología Médica y Micología, Facultad de Medicina,
Universidad de Ciencias Médicas de Lorestan,
Centro de Investigación de Enfermedades Infecciosas y Medicina Tropical,
Centro de Investigación de Medicinas Herbales Razi, Universidad de
Ciencias Médicas de Lorestan, Khorramabad, Irán
Instituto de Investigación en Salud, Universidad de Medicina de Babol
Khorramabad, Irán
Recibido: 23 de junio de 2017 / Aceptado: 22 de diciembre de
2017 © Springer-Verlag GmbH Alemania, parte de Springer Nature 2018
* Shirzad Fallahi
Shfupdate@gmail.com; Falahi.sh@lums.ac.ir
Ciencias, Babol, Irán
Infección
https://doi.org/10.1007/s15010-017-1111-3
Academia Qinghai de Ciencia Animal y Veterinaria
Medicina, Universidad de Qinghai, Xining, China
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2. En DT, se utilizan taquizoítos vivos que son muy peligrosos. Los
antígenos solubles se utilizan en LAT e IHA. Los taquizoítos fijados y
muertos en formalina se utilizan en las pruebas MAT e IFA,
respectivamente. Los procedimientos para producir estos antígenos
son muy diferentes entre laboratorios y también están asociados con
altos costos y preparación prolongada y la posibilidad de infección del
personal [22]. Además, las limitaciones destacadas de estos métodos
son su incapacidad para estimar el momento preciso de la infección
por T. gondii y la dificultad para estandarizar las pruebas [15, 23]. Un
enfoque desarrollado recientemente para mejorar el diagnóstico de la
infección por T. gondii y también discriminar entre las diferentes fases
de la infección es utilizar antígenos recombinantes en lugar del TLA.
de individuos; pacientes inmunocomprometidos, como pacientes
infectados por el VIH o trasplantados de órganos, mujeres embarazadas
que adquieren la infección durante el embarazo, fetos y recién nacidos
con infección congénita, y aquellos con retinocoroiditis [1, 11]. Los
médicos generales (GP), así como los especialistas en enfermedades
infecciosas (IDS) no deben ignorar los riesgos de la toxoplasmosis en
los entornos de atención médica. Pueden encontrar una serie de
problemas de toxoplasmosis, incluida la manifestación clínica, el
diagnóstico preciso y el tratamiento eficaz. Las manifestaciones clínicas
de la infección por T. gondii son inespecíficas y poco fiables; por lo
tanto, el diagnóstico de toxoplasmosis se basa tradicionalmente en
pruebas de laboratorio, en particular bioensayos y métodos serológicos.
Variación en la sensibilidad y la especificidad, el tiempo y la incapacidad
de estos métodos para diferenciar las cepas de parásitos y también la
alta sensibilidad y especificidad de los métodos moleculares en la
detección de T. gondii
Durante los últimos años, muchos métodos de prueba inmunológica,
incluida la prueba de colorante Sabin Feldman (SFDT), la prueba de
anticuerpos fluorescentes indirectos (IFAT), la prueba de aglutinación
de látex (LAT), la prueba de hemaglutinación indirecta (IHA), los
ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas ( ELISA), prueba de
aglutinación modificada (MAT), western blotting (WB) y prueba de
avidez de IgG se utilizaron para la detección de la infección por T.
gondii en diferentes pacientes y estos métodos de diagnóstico han sido
La mayoría de los métodos serológicos mencionados anteriormente
utilizaron antígenos de lisado de toxoplasma (TLA) completos o
antígenos nativos de taquizoítos cultivados en ratones y/o cultivo de tejidos.
Los métodos inmunológicos fueron el método de diagnóstico preferido
y más común para el diagnóstico de toxoplasmosis en los laboratorios
clínicos en el siglo pasado. Estos métodos se basan en el
reconocimiento de antígenos de superficie de T. gondii por
inmunoglobulinas específicas de T. gondii del huésped [ 1 ] . Diferentes
métodos inmunológicos a menudo miden diferentes anticuerpos (IgA,
IgM, IgG e IgE) que poseen patrones únicos de aumento y disminución
con el tiempo después de la infección [1, 14].
revisado por publicaciones anteriores [1, 13–15]. Aunque en las dos
últimas décadas, se han desarrollado otros métodos inmunológicos,
incluidos los ensayos de quimioluminiscencia (CLIA), el ensayo de
fluorescencia ligada a enzimas (ELFA), la prueba inmunocromatográfica
(ICT), la prueba de avidez de IgG en suero y los ensayos de
aglutinación inmunoabsorbente (ISAGA) para mejorar la capacidad de
diagnóstico de la infección por T. gondii [12, 15]. CLIA y ELFA son
variaciones completamente automatizadas del ELISA estándar que
tienen varias ventajas, incluida la reproducibilidad, la rentabilidad y la
medición rápida y precisa de los niveles de anticuerpos IgG e IgM.
Además, CLIA es útil en la medición del índice de avidez de IgG incluso
a niveles bajos de anticuerpos IgG específicos de Toxoplasma [16, 17].
Las TIC son un método adecuado para la aplicación de campo porque
tienen un bajo costo, un procedimiento simple y no requieren técnicos
calificados. En las TIC, se utiliza una membrana de celulosa como
portador y un antígeno o anticuerpo marcado con oro coloidal como
trazador [18]. Recientemente, Wang et al. desarrolló una tira ICT rápida
para la detección de antígenos excretores/secretores (ESA) en la
infección aguda por T. gondii tan pronto como 2 a 4 días después de
la infección [19]. En ISAGA, los anticuerpos IgM antihumanos se
utilizan para el diagnóstico de toxoplasmosis aguda o congénita. La
desventaja de este método es el requisito de un gran número de
taquizoítos de T. gondii . Aunque este problema se resolvió
reemplazando los taquizoítos de T. gondii con perlas de látex
recubiertas con antígenos solubles [12, 20, 21].
El antígeno de taquizoíto y/o el antígeno excretado-secretado fueron
los antígenos de prueba primarios en los ELI SA indirectos
convencionales en los que mostraron sensibilidad y especificidad
satisfactorias. Sin embargo, las limitaciones antes mencionadas para la serología
Como se mencionó anteriormente, aunque se aplican varios métodos
para el diagnóstico de toxoplasmosis, ELISA sigue siendo el método
más común en los laboratorios clínicos. Crudo
Tener información básica sobre los métodos tradicionales y nuevos
desarrollados para la detección de toxoplasmosis es esencial para que
los médicos de cabecera y los IDS elijan un enfoque de diagnóstico
adecuado para un diagnóstico rápido y preciso de la enfermedad y, en
consecuencia, un tratamiento oportuno y eficaz. Esta revisión describió
los avances recientes en el diagnóstico serológico y molecular de la
toxoplasmosis, así como también revisó brevemente las técnicas de
imagen para el diagnóstico de la infección. En este sentido, realizamos
búsquedas bibliográficas en inglés en PubMed desde 1989 hasta 2016
utilizando las palabras clave Toxoplasma gondii, toxoplasmosis,
serological, molecular, diagnosis, imaging technologies y resumimos
los avances en el diagnóstico de toxoplasmosis.
infección condujo al uso generalizado de estas técnicas para detectar
y diferenciar varias cepas de T. gondii [12, 13].
1 3
Métodos serológicos
Avances en métodos serológicos
basados en antígeno recombinante de T. gondii
Avances recientes en el diagnóstico serológico
A. Rostami et al.
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3. Beghetto et al. [61] evaluaron por primera vez la utilidad
diagnóstica de dos antígenos quiméricos, EC2 (que contiene regiones
antigénicas MIC1 y MIC2) y EC3 (que contiene regiones antigénicas
M2AP, GRA3 y GRA7) para el diagnóstico serológico de toxoplasmosis
aguda. Sus resultados han demostrado que los antígenos quiméricos
mejoraron significativamente la capacidad de los ELISA Rec (ELISA
IgM con antígenos recombinantes quiméricos) en comparación con
los ensayos estándar, especialmente en el diagnóstico de
toxoplasmosis congénita. Holec-Gÿsior et al. [64] han demostrado que
la sensibilidad del antígeno quimérico recombinante MIC1-MAG1 para
el serodiagnóstico de la toxoplasmosis humana es comparable con el
TLA (90,9 y 91,8%, respectivamente). En un estudio posterior, los
mismos autores encontraron que el antígeno quimérico de tres
regiones antigénicas MIC1-MAG1-SAG1 arrojó mejores resultados
que el antígeno quimérico que contiene solo dos fragmentos de las
proteínas MIC1 y MAG1 [65]. En 2012, Dai et al. desarrolló un péptido
de fusión multiepítopo recombinante (rMEP) compuesto por
determinantes antigénicos de los antígenos SAG1, SAG2 y SAG3. En
este estudio, se realizaron ELISA IgG e IgM con este ensayo basado
en rMEP en sueros humanos y los resultados han demostrado que
rMEP tiene una sensibilidad tan alta como los kits ELISA disponibles
comercialmente y también tiene un potencial significativo para
distinguir entre toxoplasmosis aguda y crónica [ 62]. Ferra et al. [22]
evaluaron la utilidad diagnóstica de cinco antígenos quiméricos en
compresión con mezclas de tres antígenos recombinantes. Su estudio
demostró que los antígenos quiméricos eran generalmente más
reactivos que las mezclas de antígenos recombinantes. Además,
demostraron que
Un número creciente de estudios realizados recientemente han
demostrado las ventajas potenciales de los antígenos peptídicos
sintéticos o quiméricos para el diagnóstico serológico de T. gondii
Las variaciones en la sensibilidad y la especificidad y la
contaminación con proteínas de los organismos que se utilizan para
la producción de antígenos recombinantes (p. ej., Escherichia coli)
son las principales limitaciones de los antígenos recombinantes [60]. Usar
En los últimos años, se han expresado varios antígenos
recombinantes en Escherichia coli o levadura mediante técnicas de
clonación y expresión de genes, y se evaluó su valor diagnóstico
potencial para la detección de anticuerpos IgG e IgM específicos
contra el parásito T. gondii en diferentes huéspedes infectados. Estos
antígenos incluyen los antígenos de superficie SAG1 (P30), SAG2
(P22), SAG3 (P43) y P35 [23, 25–30]; antígenos de gránulos densos
GRA1 (P24), GRA2 (P28), GRA4, GRA5, GRA6 (P32) y GRA7 (P29)
[30–39]; antígenos micro neme MIC2, MIC3, MIC4 y MIC5 [12, 40,
41]; antígenos de matriz MAG1 [42]; y antígenos de roptría ROP1
(P66) y ROP2 (P54) [30, 43, 44]. La ventaja destacada de estos
antígenos recombinantes es la identifcación de anticuerpos específcos
de fases agudas o crónicas y la discriminación entre estas dos etapas
de la infección por T. gondii usando una sola muestra de suero [23].
Además del ELISA convencional, la aplicación de T. gondii
infección, como estandarización simple, alta sensibilidad, baja
contaminación con proteínas de los organismos, reduciendo los
costos de producción y aumentando la probabilidad de discriminar
diferentes etapas de toxoplasmosis [61–66].
métodos como los difíciles de estandarizar, la contaminación con
materiales extraparásitos y la discrepancia en los resultados también
existen para los ELISA que utilizan estos antígenos nativos [14, 24].
Reemplazar el TLA con antígenos recombinantes es un enfoque
alternativo para mejorar estas pruebas. Las principales ventajas de
los antígenos recombinantes son el uso de más de un antígeno
defnido, antígenos purificados estandarizados, métodos de preparación
estándar, estandarización simple del método y la capacidad de
discriminar entre las etapas aguda y crónica de la infección por T.
gondii [14, 23].
Los antígenos recombinantes en otros métodos serológicos, como la
prueba de avidez de IgG, CLIA y ICT, han demostrado resultados
muy prometedores para la detección de la infección aguda por T.
gondii [45–54].
Estos antígenos peptídicos quiméricos y/o sintéticos incluyen varios
epítopos inmunorreactivos de diferentes T. gondii
de antígenos peptídicos quiméricos y/o sintéticos es un enfoque
alternativo para resolver estas limitaciones.
Está demostrado que la combinación de antígenos recombinantes
complementarios mejora significativamente la sensibilidad y
especificidad de las pruebas cuando se compara con un solo antígeno
[55–57]. Informó que la mezcla de antígenos recombinantes GRA7,
GRA8, ROP1 y SAG2A, GRA2, GRA4, ROP2, GRA8 y GRA7 son
potencialmente útiles para detectar IgM e IgG, respectivamente [55,
58]. Otros antígenos recombinantes combinados y sus características
diagnósticas se revisan en artículos de revisión publicados
recientemente [12, 23, 41].
antígenos que han sido seleccionados adecuadamente. Estos
epítopos inmunoreactivos son hidrofóbicos y generalmente están bien
expuestos en la superficie del antígeno. Durante los últimos años, se
han desarrollado una variedad de herramientas innovadoras que
incluyen análisis de micromatrices de péptidos mediante métodos
bioinformáticos, mapeo de epítopos, presentación de fagos de
bibliotecas de ADNc y reactividad con anticuerpos monoclonales para
la predicción de epítopos específicos y su localización en antígenos
de T. gondii [23]. , 60, 67–70].
Además, en 2014, Drapaÿa et al. [59] evaluaron la utilidad de dos
mezclas de antígenos recombinantes (rROP1 + rSAG2 y rROP1 +
rGRA6) en la prueba de avidez de IgG. Sus resultados han demostrado
que estas dos mezclas tienen una alta sensibilidad (100 y 95,4%,
respectivamente) para la detección de toxoplasmosis aguda, lo que
sugiere que la nueva prueba de avidez de IgG que utiliza mezclas de
antígenos recombinantes puede ser útil para el diagnóstico de
infecciones difíciles de identificar. Fases de la toxoplasmosis.
1 3
Avances en métodos serológicos basados en
antígenos quiméricos y péptidos multiepítopos de T. gondii
Avances en técnicas serológicas, de imagen y diagnóstico molecular de Toxoplasma gondii…
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4. La PCR multiplex es otro tipo de métodos de PCR para detectar
múltiples patógenos utilizando múltiples conjuntos de cebadores, cada
uno de los cuales se dirige a un patógeno en particular. Este método
permite el análisis simultáneo de múltiples objetivos en una sola muestra.
A pesar de las importantes mejoras en los métodos serológicos, aún
existen limitaciones irresolubles, como la incapacidad de estos
métodos para confrmar la presencia del parásito en el feto y el cerebro
en pacientes con transmisión congénita y/o inmunocomprometidos. El
desarrollo de los métodos moleculares durante las últimas tres
décadas indujo una gran revolución en el diagnóstico de enfermedades
infecciosas en general. Para superar las limitaciones de las pruebas
serológicas, se han desarrollado diferentes métodos moleculares que
incluyen PCR, PCR anidada, PCR en tiempo real y también técnicas
de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) para detectar
ADN de T. gondii en muestras biológicas (Tabla 1) [71–73].
Nowakowska et al. utilizó muestras de líquido amniótico y
cefalorraquídeo de casos de toxoplasmosis congénita para determinar
el genotipo del parásito mediante PCR multiplex anidada. Informaron
una sensibilidad de > 25 parásitos/ml en muestras de líquido
cefalorraquídeo y amniótico mediante PCR anidada multiplexada [87].
Los métodos basados en RT-PCR son ensayos desarrollados
recientemente que hicieron posible la cuantificación de la carga
parasitaria y tienen un alto grado de precisión diagnóstica específica
del complejo para el diagnóstico de patógenos en muestras clínicas.
La RT-PCR es el ensayo molecular más sensible para la detección de
patógenos, especialmente cuando el ADN objetivo se encuentra en
bajas concentraciones. Además, estos ensayos son más rápidos, sensibles
los antígenos quiméricos compuestos por SAG2–GRA1–ROP1L son
más sensibles para la detección de toxoplasmosis. En un estudio
posterior, el mismo equipo demostró que estos antígenos quiméricos
(SAG2–GRA1–ROP1L) también tienen una alta sensibilidad y
especificidad en IgG CLIA [45].
Rahumatullah et al. desarrolló un ensayo de PCR triplex dirigido al
gen B1, la región de repetición 529 y la región ITS1 de T. gondii.
Según su informe, este ensayo fue capaz de detectar tan solo 10 pg
de ADN de T. gondii , 104 taquizoítos en fluidos corporales enriquecidos
y ADN de T. gondii en los tejidos de órganos de ratones infectados
experimentalmente [88].
El lavado broncoalveolar, los líquidos pleurales y peritoneales se han
utilizado con eficacia para diagnosticar la toxoplasmosis en pacientes
inmunocomprometidos.
En los métodos basados en PCR, se puede amplificar un fragmento
específico del genoma, lo que da como resultado muchos millones de
copias de la molécula de ADN objetivo. Burg et al., establecieron la
primera técnica de PCR para la detección de T. gondii , en la que se
amplificó el gen B1 de 35 repeticiones del genoma de T. gondii [74].
Después de esto, se han utilizado varios genes dirigidos a múltiples
copias, incluidos los genes 18S rRNA-, P30-, B1, el fragmento repetido
de 529 pb o el elemento AF146527 para la detección de T. gondii en
diferentes muestras biológicas [39, 73–79 ]. Se ha informado que la
PCR con el gen RE de 529 pb es de 10 a 100 veces más sensible que
el gen B1 [76, 77]. Para el diagnóstico de toxoplasmosis congénita y
ocular, la PCR se ha utilizado con éxito con líquido amniótico, tejido
placentario y cerebral, humor acuoso y líquido vítreo.
Al resumir la información presentada en esta sección, aunque hoy
en día la mayoría de las pruebas serológicas y también los kits
comerciales utilizan TLA, pero debido a su incapacidad para distinguir
entre toxoplasmosis aguda y crónica y también otras limitaciones, es
necesario desarrollar nuevas estrategias para resolución de este
problema. El uso de antígenos recombinantes y mezclas de antígenos
recombinantes es un buen enfoque alternativo en el diagnóstico y
también discrimina diferentes etapas de la infección por T. gondii .
Además, estudios más recientes que utilizan antígenos quiméricos y
péptidos multiepítopos demostraron resultados muy prometedores
para el desarrollo de nuevas estrategias capaces de discriminar
infecciones adquiridas recientemente de infecciones crónicas.
La PCR anidada se utiliza para aumentar la especificidad de la
amplificación del ADN, así como para detectar los patógenos que se
producen en muy pocas cantidades. En un estudio publicado por
Alonso et al., se descubrió que la PCR anidada es un método molecular
rápido, sensible y eficaz en la detección temprana de toxoplasmosis
en pacientes con VIH [80]. En otro estudio, se demostró que la PCR
anidada tiene una alta sensibilidad para la detección de ooquistes de
T. gondii en aguas de ríos, pozos y mares [81]. Mousavi et al.
compararon los genes RE y B1 para el diagnóstico de toxoplasmosis
en pacientes diabéticos utilizando el ensayo PCR anidado. Sus
hallazgos mostraron que, en comparación con el gen RE, el gen B1
puede detectar más muestras positivas y puede utilizarse para la
detección de toxoplasmosis [82]. Vitale et al. desarrolló un ensayo de
PCR anidado de alta sensibilidad dirigido a una región entre el ADNr
28S y 18S para la detección de toxoplasmosis en muestras de
animales y alimentos [83]. Se ha demostrado que el ensayo de PCR
anidado de desarrollo adicional puede ser un método valioso, preciso
y específico para el diagnóstico de diferentes tipos de toxoplasmosis
[84, 85]. Martínez et al. desarrolló una técnica anidada de PCR-ELISA
para detectar una pequeña cantidad de ADN de T. gondii mediante
PCR acoplada a un paso de detección colorimétrica, mediante
hibridación con una sonda unida a una esfera de poliestireno [86]. Este
estudio informó que el ensayo de perlas PCR-ELISA anidadas es una
herramienta valiosa para la detección de ADN de T. gondii [86].
Además, sangre total, orina, líquido cefalorraquídeo (LCR),
Técnicas moleculares para la detección
de T. gondii
1 3
A. Rostami et al.
Técnicas basadas en PCR
PCR en tiempo real (RTÿPCR)
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5. 1 3
Avances en técnicas serológicas, de imagen y diagnóstico molecular de Toxoplasma gondii…
detección,
no
es
necesario
aislar
el
parásito
ADNr
18S,
ITS-1,
Resultados
95–
100
GRA6,
BTUB,
Falso
positivo
mecanografía,
se
necesita
equipo
costoso
LCR
líquido
cefalorraquídeo,
FA
líquido
amniótico,
ASF
líquido
ascítico,
BAF
líquido
broncoalveolar,
FT
tejidos
fetales,
SM
músculo
esquelético,
SNC
sistema
nervioso
central,
PPV
valor
predictivo
positivo,
VPN
90-100
LCR,
FA,
PPA,
2–
5
taquizoítos
Menos
sensible,
falso
Agua,
cerebro,
corazón,
tipificación
de
alta
resolución,
es
posible
que
no
sea
necesario
aislar
el
parásito
0.02–
1
genoma
necesario
SAG2,
SAG3,
PCR
anidado
resultados
positivos
85–
100%
75–
100
1–
50
fg
de
genómico
SAG1,
SAG2,
SAG3,
BTUB,
PCR
múltiplex
taquizoitos/
ml
100
detección
de
especies,
Desventajas
prestado
100
genoma
equivalente
98–
100
Gen
B1,
529
pb
RE,
resultados,
particiones
relativas
para
cada
Apico
85–
100
LÁMPARA
resultados
positivos
ADN
por
PCR
Gen
PCR
convencional
B1,
529
pb
RE,
sangre,
orina,
BAF SM,
SNC
de
genómica
VAN
taquizoitos/
ml
VPP
de
especificidad
gen
B1,
TgOWP,
~
10
genoma
sangre,
orina
basado
en
Mn-
PCR
90-100
alta
resolución
al
escribir
ADN/
103–
105
Difícil
de
configurar
AF,
CSF,
FT,
BF
Alta
resolución
en
Técnicas RT-
PCR
y
real
GRA6,
c22-8,
c29-2,
L358,
PK1,
1–
10
genoma
100
10–
100
pág.
5–
200
fg
de
Altamente
sensible,
hígado,
bazo,
riñón,
sangre,
BOLSA1,
GRA1
Sensibilidad
Ventajas
equivalente
tipificación
de
alta
resolución,
es
posible
que
no
sea
necesario
aislar
el
parásito
Sangre,
orina,
FT
equivalente
RE,
SU1 SAG1,
SAG2,
529
pb
RE,
GRA1
90-100
secuenciación
0.1–
1
genoma
genómico
Tabla
1
Comparación
de
los
métodos
moleculares
para
el
diagnóstico
de
toxoplasmosis
insensible,
aislado
de
tipificación,
adecuado
para
estudios
epidemiológicos
Desconocido
Desconocido
Desconocido
ADNr
18S
No
conocida
diseño
de
imprimación
difícil,
etapa
distinta
de
la
prueba
taquizoitos/
ml
85–
100
equivalente
detección
de
especies,
Sangre,
FT,
AF,
LCR
Muy
sensible
en
SAG1,
SAG2,
específico
y
rápido
en
la
detección,
el
aislamiento
del
parásito
no
es
necesario,
fácil
de
realizar,
ADN/
1-10
taquizoítos/
ml
No
conocida
No
es
adecuado
para
marcadores
MS,
B1,
valor
predictivo
negativo,
Mn-
PCR
PCR
anidada
multiplex,
microsatélite
MS
ADN/
10–
103
100
equivalente
80–
100
ADN/
105–
109
ción
de
parásito
detección
de
especies,
Gen
B1,
529
pb
RE,
95–
100%
85–
100
Menos
sensible,
falso
10
fg
de
genómica
tiempo
PCR
Regiones
diana
del
ADN
Muestra(s)
SAG1,
BOLSA1
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6. y reproducibles que la PCR convencional, y son útiles en
investigaciones como la cinética de infecciones y el seguimiento
de la respuesta terapéutica [89]. Las principales ventajas de la RT-
PCR sobre la PCR convencional incluyen la no necesidad de abrir
los tubos de reacción y, por lo tanto, el riesgo mínimo de
contaminación ambiental de los amplicones, la reducción de
resultados falsos positivos y la medición de los productos de
amplificación durante cada ciclo utilizando sondas o colorantes
intercalados. y proporcionar un diagnóstico valioso como opción
de tratamientos específcos para pacientes que albergan varios patógenos [79, 89–91].
Tras el uso generalizado de LAMP para identificar T. gondii, se
han utilizado varios genes dirigidos, incluidos el elemento repetitivo
de 529 pb, B1, 18S rRNA, SAG1, SAG2, GRA1 y la proteína de la
pared del oocisto (OWP) para la detección de T. gondii en
diferentes muestras biológicas y ambientales [12, 73, 108, 110,
111, 113–116]. En un estudio sobre muestras de agua y dirigido a
los genes B1 y TgOWP, se informó un límite de detección de
sensibilidad de 0,1 ADN de taquizoítos para ambos genes, lo que
sugiere que LAMP es una herramienta sensible y específica para
la detección de T. gondii en el agua y otros entornos . muestras
mentales [113]. Wang et al. informó que el ensayo LAMP que usa
SAG1 como gen objetivo tiene un potencial significativo para el
diagnóstico temprano de toxoplasmosis. En su estudio, LAMP
pudo diagnosticar la toxoplasmosis aguda 2 días después de la
infección [110]. En otro estudio, Lin et al. informaron que el ensayo
LAMP que usaba el objetivo SAG2 era más sensible que los genes
B1 y SAG1 para el diagnóstico de toxoplasmosis activa (87 versus
80 y 80 %, respectivamente) [111].
En la última década, varios estudios aplicaron RT-PCR para el
diagnóstico de toxoplasmosis en diversas muestras biológicas,
ambientales y alimentarias [79, 92–98]. La mayoría de estos
estudios informaron que la RT-PCR es un método más sensible
en comparación con otros métodos moleculares y biológicos [79,
92–98]. Lin et al. desarrolló un ensayo basado en RT-PCR para la
detección de T. gondii utilizando cebadores específicos y una
sonda TaqMan marcada con fluorescencia dirigida al gen B1 de T.
gondii. El ensayo fue capaz de detectar tan solo 0,05 taquizoítos
de T. gondii en una reacción. Con este ensayo, pudieron detectar
la infección por Toxoplasma en 10 secciones (33 %) de 30
secciones de tejido fetal incrustadas en parafina [99]. En otro
estudio, Costal et al. desarrolló un ensayo de RT-PCR utilizando
sondas de hibridación de transferencia de energía por resonancia
de fluorescencia (FRET) para detectar y cuantificar el ADN de T.
gondii en una muestra de suero. Sus resultados han demostrado
que la RT-PCR es un método valioso para identificar y hacer un
seguimiento de la reactivación de Toxoplasma en pacientes
inmunocomprometidos [91]. En estudios posteriores, se demostró
que la sensibilidad de la RT-PCR mejoró entre 10 y 100 veces
cuando se usó la orientación de 529 pb en lugar de B1 [77, 79,
100]. Además, demostró que la RT-PCR con el objetivo de 529 pb
resultó mejor que el gen B1 para el diagnóstico de toxoplasmosis
congénita tanto en el período prenatal (81,3 frente a 64,6%) como
en el nacimiento (36,0 frente a 20,0%) [100]. La combinación de
un método de captura magnética de secuencia específica y RT-
PCR ha demostrado resultados muy prometedores para la
detección de quistes de T. gondii y el sitio infectado de predilección
en la carne animal [94, 101].
LAMP es un método de PCR modificado en un solo paso, con
alta sensibilidad, especificidad, efciencia y rapidez. Este método
amplifica el ADN en condiciones isotérmicas (60–65 °C) utilizando
una ADN polimerasa (Bst) con actividad de establecimiento de
cadenas y 4–6 cebadores específicos, que pueden reconocer un
total de 6–8 regiones distintas dentro del ADN objetivo. [102–104].
Los pasos del procedimiento LAMP se muestran en la Fig. 1. Las
ventajas técnicas de usar LAMP en lugar de la PCR y la RT-PCR
convencionales incluyen la no necesidad de equipos altamente
sofisticados, no es costosa ni requiere mucho tiempo, no es
necesaria la extracción de ADN y es más tolerantes a los
inhibidores de la PCR, como la sangre, el suero y los ingredientes
alimentarios [104–109]. Aunque la sensibilidad y la eficiencia de
amplificación de LAMP son mucho más altas que las de la PCR
convencional, son lentamente más bajas que las de la RT-PCR
[108, 110, 111]. Además, debido a que los cebadores se unen a 6–
8 regiones distintas en el ADN diana, la especificidad de
amplificación de LAMP se considera muy alta [106, 109, 112].
Estas propiedades atractivas han motivado a muchos grupos de
investigación a usar LAMP para detectar varios patógenos, incluido T. gondii [39,
Lin et al. compararon el rendimiento de los ensayos LAMP y
PCR en tiempo real dirigidos a un elemento repetido de 529 pb del
genoma de Toxoplasma . Los límites de detección notificados para
los ensayos LAMP y PCR en tiempo real fueron de 10 y 1 fg/ÿl de
ADN de T. gondii , respectivamente [111]. Kong et al. desarrolló un
ensayo LAMP dirigido al gen RE para detectar ADN de T. gondii
en muestras de sangre de ratones infectados experimentalmente.
Informaron un límite de detección tan bajo como 0,6 fg de ADN de
T. gondii para el ensayo RE-LAMP. Además, se informó que la
sensibilidad de LAMP era 100 y 1000 veces mayor que la de B1-
LAMP y RE-nested PCR, respectivamente [117]. En 2013, Qu et
al., utilizando la secuencia conservada de 18s rRNA, desarrollaron
el método LAMP de transcripción inversa (RT-LAMP) para la
detección de T. gondii en carne con un límite de detección de un
taquizoíto en 1 g de carne. Sus resultados sugieren que la técnica
RT-LAMP proporciona una herramienta simple y confiable para inspeccionar
1 3
Amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP)
A. Rostami et al.
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7. Técnicas de imagen
1 3
Una tomografía computarizada del cerebro a menudo se usa como una pantalla inicial
La administración de material de contraste intravenoso (IV) con
cualquiera de las dos modalidades mejora el rendimiento y la precisión
del diagnóstico [118]. En los estudios de tomografía computarizada,
se observaron lesiones redondeadas isodensas o hipodensas con
pared delgada y lisa después de la administración de medio de
contraste IV y lesiones calcificadas con forma de punto o pared gruesa
después del tratamiento médico. Cuando se utiliza la exploración
diferida de dosis doble, se muestran las lesiones de relleno central y la tasa de detecc
carnes contaminadas con T. gondii [114]. En general, todas las
ventajas del ensayo RT-PCR, incluidas la alta sensibilidad y
especificidad junto con un procedimiento simple para facilitar la
flexibilidad en situaciones de campo, se pueden ver en el ensayo LAMP.
Resumiendo la información presentada en esta sección, debe
mencionarse que el uso de métodos moleculares de alta sensibilidad
basados en PCR ha mejorado significativamente el diagnóstico clínico
de diferentes tipos de toxoplasmosis. Los resultados de estudios
recientes indicaron que LAMP y RT-PCR con FA y LCR son métodos
más sensibles y específicos en pacientes con infección congénita e
inmunocomprometidos, respectivamente, y podrían usarse para el
diagnóstico temprano de la infección y también en el seguimiento
después del tratamiento. Además, la mejora de las tecnologías
bioinformáticas brinda la capacidad de reconocer posibles genes
dirigidos que podrían ser muy cruciales para mejorar la sensibilidad y
la especificidad de estos métodos y brindar perspectivas para el
diseño de nuevos enfoques de diagnóstico complementarios para la
toxoplasmosis.
y puede mostrar lesiones nodulares únicas o múltiples.
Las técnicas de imagen son útiles para el diagnóstico de toxoplasmosis
cerebral y ocular. En la toxoplasmosis cerebral (encefalitis), una
variedad de técnicas de imagen como la tomografía computarizada
(TC), la resonancia magnética nuclear (RMN), la imagenología nuclear
y la ultrasonografía (US) podrían ser útiles, aunque sus resultados
pueden no ser específicos.
Avances en técnicas serológicas, de imagen y diagnóstico molecular de Toxoplasma gondii…
Fig. 1 Pasos del procedimiento y diferentes métodos de diagnóstico de productos de la técnica LAMP
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8. se mejora signifcativamente. La exploración diferida demostró
características diagnósticas más sensibles, ya que en varios casos
se detectaron lesiones realzadas mediante la exploración retardada,
mientras que se lograron resultados negativos en la TC inmediata
[119]. En la toxoplasmosis del SNC, aproximadamente el 75% de las
lesiones son múltiples y los ganglios basales son el sitio más
prominente para inducir nódulos. En la toxoplasmosis congénita, las
tomografías computarizadas pueden demostrar hidrocefalia difusa y
calcifcaciones cerebrales que se asocian con calcifcaciones múltiples,
irregulares, nodulares y similares a quistes en las áreas
periventriculares y el plexo coroideo [120].
debido a toxoplasmosis congénita [126]. En una revisión exhaustiva
[122], Khan afirma que "los hallazgos ultrasonográficos en la
toxoplasmosis congénita incluyeron ulomegalia ventricular simétrica,
periventricular intracraneal y hepática/esplénica".
La toxoplasmosis ocular se puede diagnosticar mediante hallazgos
clínicos como la agudeza visual, la presión intraocular, la
biomicroscopia y la oftalmoscopia indirecta [129]. Aunque técnicas
de imagen como la autofluorescencia de fondo de ojo (FAF), la
oftalmoscopia con láser de barrido confocal (CSLO), la tomografía
óptica coherente (OCT), la angiografía fluorescente (AF), la ecografía
y la angiografía con verde de indocianina (ICG) pueden ser útiles
para su diagnóstico y manejo. de complicaciones que incluyen edema
macular, desprendimiento de retina, neovascularización retiniana,
oclusión vascular, atrofia del nervio óptico, lesiones vitreorretinianas,
glaucoma y cataratas [129].
LAMP en sangre de cordón o sangre completa puede ser útil para
el diagnóstico defn itivo. Además, la combinación de ELISA (usando
TLA, antígenos recombinantes o quiméricos), RT-PCR/LAMP en
LCR y hallazgos de imagen por RM o TC podría resultar en un
diagnóstico defnitivo en pacientes inmunocomprometidos (Fig. 2).
densidades, destrucción focal de tejido cerebral que se relaciona con
agrandamiento de la cisterna o ventrículo vecino, calcifcación ocular,
microftalmía, bandas metafisarias, irregularidad del borde metafisario
de la placa de crecimiento, ascitis fetal y aumento del grosor de la
placenta”. La ecografía posnatal se puede utilizar para controlar el
tamaño ventricular en bebés de hasta 18 meses de edad. En
pacientes adultos, la ecografía abdominal puede revelar
hepatoesplenomegalia y linfadenopatía abdominal debida a
toxoplasmosis [126–128].
Para este propósito, sugerimos ELISA IgG/IgM en combinación con
RT-PCR/LAMP en FA y US prenatal para la detección de infección
aguda en mujeres embarazadas y también para iniciar medidas
preventivas de transmisión congénita. El hallazgo serológico (ELISA
usando TLA, antígenos recombinantes o quiméricos) es el estándar
de oro en recién nacidos, aunque RT-PCR/
El diagnóstico temprano y preciso de la infección por T. gondii es
fundamental, especialmente en pacientes con transmisión congénita
e inmunocomprometidos. La elección del método de diagnóstico
adecuado es fundamental para esta propuesta. En esta revisión,
proporcionamos un resumen de los métodos desarrollados
recientemente y también intentamos mejorar su sensibilidad para el
diagnóstico de toxoplasmosis. Cada una de las tecnologías de
serología, molecular y de imagen tiene sus propias ventajas y
limitaciones que ciertamente pueden lograr resultados precisos y
efectivos para el diagnóstico de toxoplasmosis al combinar estas técnicas de diagnó
La ecografía prenatal puede ser útil para detectar anomalías cerebrales
La RM es más adecuada para determinar la extensión del daño
y mejora la capacidad de distinguir entre diferentes lesiones del SNC
[119]. Los patrones de copia de espectros de RM T1 y T2 son útiles
para mejorar la capacidad de discriminación de diferentes lesiones
del SNC. En las resonancias magnéticas ponderadas en T1, las
lesiones suelen ser isointensas o hipointensas en relación con el
tejido cerebral, mientras que en las resonancias magnéticas
ponderadas en T2 suelen ser hiperintensas, aunque a veces pueden
ser isointensas o hipointensas. Brightbill et al. informaron que la
hiperintensidad ponderada en T2 podría estar patológicamente
relacionada con la encefalitis necrotizante, mientras que la tensión
de isointensidad ponderada en T2 está relacionada con abscesos en
organización. Además, describieron que el cambio de hiperintensidad
a isointensidad en la resonancia magnética ponderada en T2 podría
deberse a una respuesta positiva al tratamiento con antibióticos, una
herramienta para evaluar la eficacia de la terapia médica [121]. El
diagnóstico diferencial entre linfoma del SNC y toxoplasmosis es un
tema importante entre los pacientes con ADIS. En la espectroscopia
de RM, el linfoma se caracteriza por un aumento de los picos de
lactato, lípidos y colina y una disminución de las señales de N-acetil
aspartato, creatina y mioinositol, mientras que en la toxoplasmosis
del SNC solo se muestran picos elevados de lactato y lípidos.
Además, las lesiones inducidas por toxoplasmosis tienen valores
signifcativamente mayores que las lesiones de linfoma. Además, en
los últimos años, las herramientas de imágenes nucleares como la
tomografía por emisión de positrones con fuorodesoxiglucosa (FDG-
PET), el cloruro de talio (201Tl) y el tecnecio-99 m (99mTc) sestamibi
(MIBI) han mostrado características prometedoras para distinguir la
toxoplasmosis del SNC del linfoma del SNC. en pacientes con VIH,
aunque se necesitan más investigaciones prospectivas para confrmar
la capacidad de estas herramientas de imagen [122-125].
1 3
Conclusión
A. Rostami et al.
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9. Cumplimiento de normas éticas
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