1. ESTUDIO CINETICO DEL ENZIMA ALFA – AMILASA
a
Carolina González Restrepo, b
Andres Felipe Tascon
a
carolina.gonzalez7@correo.icesi.edu.co,b
andres.tascon1@correo.icesi.edu.co
a
Universidad ICESI, Facultad de Ciencias Naturales, Programas de Biología y Química
farmacéutica
Bioquímica Y Laboratorio
Santiago de Cali, Colombia
Noviembre de 2013
Introducción
La cinética enzimática tiene por objeto el
estudio de la velocidad de las reacciones
catalizadas por enzimas, así como los
factores que en ella influyen y los
mecanismos por los cuales transcurren.
La velocidad de las reacciones
enzimáticas se puede medir por factores
clave tales como la cantidad de sustrato
que desaparece en cierto tiempo, y la
cantidad de producto que se genera en ese
mismo tiempo, esta última requiere de
equipos especializados. [1]
La a-amilasa es una enzima proteica que
se encuentra en la saliva humana y
cataliza la degradación del almidón, que
es un polisacárido de reserva vegetal. El
almidón está formado por dos tipos de
moléculas: la amilosa y la amilopectina,
ambos polisacáridos de glucosa. La
amilosa se conforma por cadenas lineales
de glucosas unidas por enlaces a- C1-C4,
mientras que la amilopectina tiene,
además de estos últimos enlaces, uniones
C1 con C6, formando cadenas
ramificadas. La a-amilasa rompe uniones
C1-C4, tanto en la amilasa como en la
amilopectina, dejando dextrinas lineales y
ramificadas (oligosacáridos) como
productos, estos productos serán la
glucosa y maltosa.
La enzima α-amilasa, es una enzima de
naturaleza gluproteica que existe en seis
formas moleculares (isoenzimas),
diferente por su composición en
aminoácidos o contenido en glúcidos.
Tiene un pH óptimo de 6 a 8, siendo en
Cl- su principal activador. Por la acción
de esta enzima, en la boca la longitud de
la cadena del almidón se reduce de varios
miles a unas ocho unidades de glucosa.
[2]
La práctica realizada tenía como principal
objetivo evaluar la acción de la a-amilasa
deshidrolizando el almidón, eso es visible
al momento de teñir el almidón con el
lugol, la coloración producida por el
Lugol se debe a que el yodo se introduce
entre las espiras de la molécula de
almidón.
No es por tanto, una verdadera reacción
química, sino que se forma un compuesto
de inclusión que modifica las propiedades
físicas de esta molécula, apareciendo la
coloración azul violeta. Más
específicamente, lo que ocurre con el
almidón es que es una sustancia formada
por 2 constituyentes macromoleculares
lineales, llamados amilosa ( - amilosa) y
amilopectina ( - amilosa). [3]
2. El degradar almidón significo en algún
momento para nosotros como especie
algo fundamental, lo podemos explicar si
nos remontamos a la dieta que llevaban
nuestros antepasados, se tienen registros
que tenían como principal alimento
aquellos con origen vegetal, la necesidad
de estos alimentos permite el desarrollo
de la agricultura, y este es uno de los
factores más importantes en la creación
de las civilizaciones humanas.
En comparación con el almidón, la
celulosa no es asimilable ni degradable
para nosotros, a pesar de que están
formados por el mismo monómero (la
glucosa), la diferencia son los enlaces
glucosídicos que unen tales moléculas de
glucosa: en el almidón son los enlaces
alfa y en la celulosa son los enlaces beta.
El almidón es una forma de reserva de
muchos seres vivos, sobre todo de las
plantas; mientras que la celulosa le
confiere la dureza al reino vegetal, es de
lo que está conformada la pared celular,
que es propia de los vegetales
Los humanos, así como la mayoría de los
animales, no podemos romper los enlaces
beta de la celulosa, y por eso lo llamamos
"fibra" por que como no es absorbido por
los intestinos acelera el tránsito intestinal.
Mientas que los enlaces alfa del almidón
son cortados sin complicación (el almidón
en las plantas es homólogo del glucógeno
en los animales).
Resultados y Análisis de resultados
preliminares
Se preparó una solución llamada extracto
enzimático, la cual consiste 20mL de
solución repartidos en 1mL de saliva (que
contiene la enzima amilasa salival) y
19mL de agua destilada.
Estudio del efecto de la [E] sobre la
velocidad de la reacción enzimática.
Antes de comenzar el procedimiento se
realiza una prueba de lugol, en esta
debemos ser capaces de determinar que
concentración de lugol es capaz de
reaccionar por completo con el almidón,
para esto, a continuación se añade unas
gotas de almidón (3 gotas) a una placa de
Elisa, después se procede a añadir el lugol
gota a gota hasta obtener una tonalidad
azul oscura, en nuestro caso fue necesario
1 gota para obtener este color.
“Si disolvemos yodo molecular, ión
yoduro y amilosa en agua, obtenemos un
producto de intenso color azul oscuro.
Parece que el yodo molecular y el ión
yoduro disueltos forman iones I3
−
que se
quedan introducidos en el eje de la
hélice de amilosa; vista de lejos, esta
estructura es de color azul oscuro”. [4]
El almidón cambia de color en contacto
con yodo porque se forma un compuesto
de inclusión al introducirse moléculas de
yodo dentro de la molécula de almidón.
El almidón es un polímero, es decir una
macromolécula formada por varias
unidades idénticas unidas entre sí
(monómeros).
3. El almidón está formado por un gran
número de moléculas de glucosa unidas
entre sí en forma lineal, formando una
especie de hebra o fibra, la cual tiene una
determinada conformación espacial. Al
ponerse en contacto con yodo, éste se
coloca en los espacios intermoleculares
del almidón, intercalándose en su
estructura, por lo que modifica las
propiedades físicas de dichas moléculas,
formando un compuesto de inclusión que
se ve de color violeta o azul.
La amilasa, denominada también ptialina
o tialina, es un enzima hidrolasa que tiene
la función de digerir el glucógeno y el
almidón para formar azúcares simples. [5]
La α – amilasa es una glucanasa
endoactiva que cataliza la hidrólisis de los
enlaces α – (1,4) glicosídicos de la región
central de las cadenas de amilosa y
amilopectina, menos en las proximidades
de los puntos de ramificación. [6]
A 4 tubos de ensayo se les añade 2 mL de
almidón y se llevan a baño de maría con
una temperatura constante de 37°C, se les
agregaron 2.9m 2.8, 2.7 y 2.6mL de agua
destilada y 0.1, 0.2, 0.3 y 0.4mL de
extracto enzimático respectivamente; al
momento de añadir este extracto sabemos
que la reacción de hidrólisis del almidón
ha comenzado, esto debido a la afinidad
de la enzima a-amilasa por el almidón.
Los resultados se evalúan al momento de
colocar 3 gotas de la solución en la placa
de Elisa y añadir el lugol, este
procedimiento se realiza en ciertos
periodos de tiempo, en intervalos de 2
minutos durante 30 minutos.
Los resultados obtenidos se reportan en la
Tabla 1.
Tabla 1. Estudio del efecto de la [E]
sobre la velocidad de la reacción
enzimática.
Tiempo
de
reacción
(Minuto)
Observación
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4
0 Azul
turquí
Azul
fuerte
Azul más
claro que el
2
Naranja
oscuro
5 Naranja
oscuro
Naranja
más claro
que 1
Naranja Amarillo
anaranjad
o
10 Naranja
oscuro
Naranja
claro
Amarillo
anaranjado
Amarillen
to
15 Naranja Naranja
claro
Amarillo
fuerte
Amarillo
20 Amarill
o
anaranj
ado
Amarillo
anaranjad
o
Amarillo
claro
Amarillo
claro
25 Amarill
o claro
Amarillo
claro
- -
Al apreciar la tabla encontramos que
conforme pasa el tiempo la reacción
cambia de coloración, esto se debe a la
hidrólisis del almidón. Mientras más
hidrolizado se encuentre el almidón, lo
encontraremos de un color más claro y
amarillento. Si la solución se encuentra
azul oscuro o café oscuro, quiere decir
que la hidrólisis es muy poca o es nula,
indica también que todavía reacciona el
lugol; si por el contrario la solución se
encuentra en un color naranja o amarillo
anaranjado, quiere decir que la hidrólisis
es parcial; finalmente si la solución se
encuentra de color amarillo (claro, o casi
transparente), quiere decir que la
hidrólisis es total.
4. De acuerdo con lo anterior podemos
decir de este experimento que la
concentración de la enzima permite
acelerar la reacción, llevándola a su
velocidad máxima más rápido, esto lo
podemos evidenciar al momento de
comparar los resultados, vemos por
ejemplo que los tubos 3 y 4 tienen mayor
concentración de enzima, y fueron los
primeros en hidrolizar, por el contrario
los tubos 1 y 2 fueron los últimos.
En la Tabla 2 vemos las concentraciones
que usamos en cada tubo
Tabla 2. Concentraciones
Tubo Concentración de enzima
(mL de extracto
enzimático)
1 0.1
2 0.2
3 0.3
4 0.4
Aplicando los resultados obtenidos en una
gráfica, tendríamos los siguientes
resultados
Figura 1. Gráfico de la concentración
sobre 1/Tiempo
La concentraciones de almidón arrancan
en un mismo punto, 2 mL, y observamos
como la línea verde alcanza la velocidad
máxima en un tiempo menor que las
anteriores, esta línea verde nos representa
el tubo 4, quien tenía una mayor cantidad
de extracto enzimático, después y a un
tiempo similar la línea azul alcanza la
misma velocidad máxima, esta línea
representa el tubo 3, luego seguiría la
línea rosa que representa el tubo 2 y la
línea negra el tubo 1, como se es
apreciable todas las líneas alcanzan una
velocidad máxima igual, pero lo que en
realidad se ve afectado es el tiempo que
demoran en llegar a esta velocidad.
Se puede apreciar en este caso que el
tiempo de reacción del almidón fue
rápido, pero este tiempo puede variar
dependiendo de la persona, en cada
persona la a-amilasa actúa diferente, en
unas degrada en menor tiempo, mientras
en otras el tiempo de degradación en
mayor [7]
5. Si tomamos una gráfica que siga la
cinética de Michaelis - Menten donde la
concentración se evalúa en función del
tiempo obtendríamos que las enzimas
tendrían un comportamiento similar al
aquí expuesto
Figura 2. Cinética de Michaelis-Menten
ANÓNIMO. Cinética enzimática. Cinética de
Michaelis-Menten. [En línea]. S.F. [Citado 20
marzo de 2014]. Disponible en:
http://es.wikipedia.org/wiki/Cin%C3%A9tica_enz
im%C3%A1tica
En caso de que se hubiesen presentado
diferentes resultados pasaríamos entonces
a contemplar los posibles errores que se
pudieron tomar, un ejemplo de ello es la
temperatura, si esta variable no se
mantiene constante vemos que los
resultados obtenidos serían
completamente distintos, pues como en la
mayoría de los casos la enzima se ve
afectada por la temperatura.
Las mediciones realizadas pueden ser un
factor que altere los resultados, puede
acelerar o desacelerar la reacción, y
obtener resultados poco acordes.
Método 2. Efecto del tiempo y el pH
sobre la velocidad de una reacción
enzimática
En la práctica, utilizamos una solución
constituida por 2.5mL de almidón al 0.5%
y 1mL de solución buffer pH 7.0 (tubo 1)
y pH 4.0 (tubo 2). Éstas fueron incubadas
a baño María a 37ºC manteniendo
constante la temperatura. Se procedió
luego a agregar 0.5mL de extracto
enzimático a cada tubo iniciando así la
reacción.
Se realizó el mismo procedimiento en
placa Elisa del método 1, pero esta vez en
intervalos de 5 minutos durante 30
minutos observando los cambios de
coloración.
La Tabla 3 indica los resultados
obtenidos para esta prueba
Tabla 3. Efectos de Ph sobre la actividad
de la a-amilasa
Tiempo de
reacción
(Minutos)
Observación (coloración)
pH 7.0 (neutro) pH 4.0 (ácido)
5 Amarillo
anaranjado
Azul oscuro
10 Amarillo Azul oscuro
15 Amarillo claro Azul oscuro
20 Amarillo claro Azul oscuro
25 Amarillo claro Azul Oscuro
30 Amarillo muy
claro
Azul Oscuro
Según los resultados reportados en la
tabla 3, la hidrólisis total del almidón a
pH neutro tomo 15 minutos, mientras que
a pH ácido no se dio.
6. Las enzimas posees grupos químicos
ionizables de sus cadenas laterales de sus
aminoácidos, los cuales pueden tener
cargas de acuerdo al pH en el que se
encuentren. Debido a que las
conformaciones de las proteínas
dependen en parte de las cargar eléctricas
que posean, debe haber un pH en el cual
la conformación sea la más adecuada para
la actividad catalítica. A esto se le conoce
como pH óptimo. [8]
La información anterior nos permite
deducir cómo será el comportamiento de
la enzima a diferentes pH, teniendo al
igual que todas las enzimas un estado
óptimo a pH neutro, en acido la enzima
no actuará hidrolizando alguna clase de
almidón, en pH alcalino la enzima si
hidroliza, pero no al 100%. [9]
La siguiente grafica nos muestra cómo
será el comportamiento de las enzimas a
diferentes pH
Figura 3. Actividad de la enzima a
diferentes valores de pH
Método 3. Estudio del efecto de la [S]
sobre la velocidad de la actividad
enzimática.
Se llevaron 4 tubos de ensayo con 0.5,
1.0, 1.5 Y 2.0mL de almidón al 0.5% a
baño María manteniendo constante la
temperatura. Luego se le agregaron 2.0,
1.5, 1.0 y 0.5mL respectivamente de agua
destilada, agregando a cada tubo 0.5mL
del extracto enzimático iniciando así la
reacción.
Se realizó el mismo procedimiento en
placa Elisa del método 1, pero esta vez en
intervalos de 10 minutos observando los
cambios de coloración.
Los resultados los podemos apreciar en la
Tabla 4
Tabla 4. Resultados de las pruebas de
Concentración de sustrato
Tiempo de
reacción
(Minutos)
Observación
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4
10 Amarill
o
anaranja
do
Amarill
o fuerte
Amarill
o más
claro
que el
anterior
Amarill
o claro
20 Amarill
o claro
Amarill
o claro
Amarill
o claro
Amarill
o claro
La velocidad de una reacción puede
depender de las concentraciones de
sustrato en ciertas condiciones, aunque
generalmente un cambio de [S] no afecta
a la velocidad de la reacción.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Rendimientodelaenzima%
Valores de Ph
Actividad Enzimatica
Actividad
Enzimatica
7. La Tabla 5, nos indica los valores de
tiempo neto obtenidos después de esta
prueba.
Tabla 5. Tiempo neto de reacción a
diferentes concentraciones de sustrato
Tubo Concentración de
sustrato (mL)
Tiempo de
reacción neta
(minutos)
1 2.0 20
2 1.5 20
3 1.0 20
4 0.5 20
Una enzima puede alcanzar una velocidad
máxima de acción si posee la cantidad de
sustrato adecuado sobre la cual puede
actuar a su capacidad máxima. Es decir,
la cantidad de producto producido será la
máxima que puede producir la enzima, si
se tienen las cantidades máximas de
sustrato las cuales pasan a producto por
acción enzimática.
Las concentraciones de sustrato sobre la
velocidad de una reacción catalizada por
una enzima afectan de la siguiente
manera:
Una enzima necesita una concentración
de sustrato específica para actuar a su
capacidad máxima. Si las concentraciones
de sustrato no son suficientes, la enzima
no trabaja a su capacidad máxima y no se
alcanzara una velocidad máxima de
reacción; por otro lado, si una enzima
llega a su capacidad máxima, el aumento
en las concentraciones de sustrato no
afectaran la velocidad de reacción ya que
la enzima se encuentra saturada y no tiene
capacidad para actuar sobre mas sustrato
manteniendo la velocidad (velocidad
máxima) constante.
Estos resultados los podemos interpretar
en la gráfica que se presenta a
continuación
Figura 4. Grafico representativo,
concentración de sustrato Vs tiempo neto
de reacción
ANÓNIMO. Efectos de las concentraciones
sobre la actividad enzimática. [En línea]. S.F.
[Citado 20 marzo de 2014]. Disponible en:
http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/e
nz22.htm#ph
Método 4. Estudio del efecto de la
temperatura sobre la velocidad de la
reacción enzimática
Se llevaron a cabo experimentos a 3
temperaturas distintas, 4, 25 (temperatura
ambiente) y 50ºC en 3 tubos de ensayo. A
cada tubo se le agregó 2mL de almidón
al 0.5%, sometiendo cada tubo a la
temperatura correspondiente. Luego se le
adicionó 0.5mL del extracto enzimático.
8. Se realizó el mismo procedimiento en
placa Elisa del método 1, pero esta vez en
intervalos de 2 minutos durante 10
minutos, observando los cambios de
coloración y registrado las observaciones
en la Tabla 6
Tabla 6. Reacción con respecto a la
temperatura
Tiempo de
reacción
(minutos)
Observación
4ºC Temperatura
ambiente
50ºC
2 Café oscuro Amarillo anaranjado claro
4 Más claro que
el anterior
Amarillo claro Amarillo
fuerte
6 Naranja - Amarillo
claro
8 Naranja claro - -
10 Amarillo
anaranjado
- -
12 Amarillo - -
Generalmente los aumentos de
temperatura aceleran las reacciones
químicas: por cada 10ºC de incremento,
la velocidad de reacción se duplica. Las
reacciones catalizadas por enzimas
también siguen esta generalidad, aunque
al ser éstas proteínas, comenzaran a
desnaturalizarse a partir de cierta
temperatura. La temperatura a la cual la
actividad catalítica es máxima se conoce
como temperatura óptima.
Si la temperatura a la que se somete una
reacción catalizada por una enzima
sobrepasa la temperatura optima de la
enzima, ésta se desnaturalizará y la
actividad enzimática decrece rápidamente
gracias a dicha desnaturalización térmica.
[6]
Al analizar los resultados obtenidos
podemos concluir que la
desnaturalización de la enzima no ocurre
a esta temperatura, si no que esta es
óptima para ella, tanto los 50° como los
0°, aunque a frio se puede observar como
la enzima reacciona de manera más lenta
en temperaturas como esta, lo cual sería
un indicio, si disminuimos o aumentamos
la tempera unos grados más, lo más
probable es que la enzima se
desnaturalice y la reacción con el lugol y
almidón se efectué.
Si analizáramos en la gráfica el
comportamiento de la enzima con
respecto a la temperatura obtendríamos
que.
Figura 5. Comportamiento de una
Enzima con respecto a la temperatura
ANÓNIMO. Efectos de la temperatura sobre la
actividad enzimática. [En línea]. S.F. [Citado 20
marzo de 2014]. Disponible en:
http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz22.ht
m
9. Conclusiones
- La amilasa es un enzima que tiene la
función de digerir el glucógeno y el
almidón para formar azúcares simples, se
produce principalmente en las glándulas
salivares (glándulas parótidas) y en el
páncreas.
- La celulosa no es asimilable ni
degradable para nosotros, a pesar de que
están formados por el mismo monómero
(la glucosa), la diferencia son los enlaces
glucosídicos que unen tales moléculas de
glucosa: en el almidón son los enlaces
alfa y en la celulosa son los enlaces beta.
Bibliografía
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Internacional Thomson Editores. México.
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[Citado 20 de marzo 2014]. Disponible
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http://karenaguilar06.blogspot.com/2010/
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[Citado 20 de marzo 2014]. Disponible
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http://www.bdigital.unal.edu.co/7435/1/7
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Disponible en:
http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/
enz22.htm#ph
9. Karp, G. (2009). Biología Celular y
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