GENÓMICA FUNCIONAL

1. UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
LIC. EN BIOTECNOLOGIA GENOMICA
Genómica Funcional
PPA2
“RNA silenciadores”
EQUIPO: 8
SAN NICOLAS DE LOS GARZA, NUEVO LEON
5 DE ABRIL DEL 2016

2. RNA interferencia
La interferencia por ARN, ARN de interferencia o
ARNi, es un proceso de silenciamiento génico
mediado por moléculas de ARN. Es característico de
células eucariotas y tiene gran importancia en
procesos de desarrollo y diferenciación celular.
Es mediado por moléculas de ARN conocidas.
Estas moléculas de ARN interferente pueden ser
siRNA (Small Interfering RNA) o microRNA según
su procedencia.

3. Mecanismo
• El mecanismo inicia con la
incorporación a la célula de una
molécula larga de ARN de cadena
doble, conocida como dsRNA (Double-
Stranded RNA).
• En el citoplasma la molécula de dsRNA
es reconocida por la enzima Dicer que
la fragmenta en pequeñas moléculas
de cadena doble, llamadas siRNA o
miRNA . Cada molécula de es
incorporada a un complejo
multiproteico conocido como RISC
(RNAi Silencing Complex).
• Este complejo separa las dos hebras
de la molécula de RNA quedándose
una de las hebras incorporada en el
complejo.
• La hebra que queda en el complejo es
usada como molde para reconocer a la
molécula de ARNm
• Si la complementariedad con la
molécula de ARNm diana es perfecta el
complejo RISC degrada este ARNm.
• Si por el contrario la
complementariedad no es perfecta, el
complejo RISC no degrada el ARNm
pero sí evita la unión del ribosoma.

4. Variación entre organismo
• Entre plantas y animales se
observa una distinción general
amplia en la utilización de
los miRNA endógenos; en plantas,
los miRNA son normalmente
perfectamente (o casi)
complementarios a su gen diana, e
inducen el corte directo del ARN a
través de RISC,
• Mientras que los miRNA de
animales tienden a ser más
divergentes en la secuencia e
inducen represión a nivel de la
traducción del ARNm diana.

5. ARN interferentes y pseudogenes
• Una de las funciones propuesta para los
pseudogenes es la regulación génica, y el
mecanismo propuesto para realizar esta
función es el RNAi.
• En estudios resientes se han descrito el
descubrimiento de pequeñas moléculas de
siRNA naturales en moscas y en ratones,
algunas de las cuales son potencialmente
transcritas a partir de pseudogenes.

6. • Un RNA de cadena sencilla de 18 a 24 nucleótidos de longitud
que es generado por la enzima Dicer, una RNAsa de tipo III, a
partir de un transcrito endógeno que contiene una estructura
de horquilla.
• Se cree que tienen un efecto importante en la modulación de la expresión de genes por su
regulación negativa por apareamiento de bases a los sitios parcialmente complementarios
sobre los ARNm diana, por lo general en la 'UTR parte 3
• La unión de un miARN a su ARNm diana , dentro del complejo RISC , por lo general conduce a
la represión de traducción y descomposición de ARNm exonucleolıtica. Algunos estudios
revelaron que miRNAs tienen la capacidad de activar la expresión de genes
Varilh J. et al., (2015)
Vázquez-Ortiz, et al. (2006)

7. IMPORTANCIA
Más del 3 por ciento de los genes humanos
en el genoma humano son sometidos a la
regulación de genes miARN mediada en
diferentes procesos celulares.
A mediados de 2013, se supo que el genoma
humano codifica más de 2000 diferentes
miRNAs que dispersos en todos los
cromosomas humanos, excepto el
cromosoma Y
Relacionados adistintas patologías: cánceres,
de enfermedades cardíacas y neurológicas.
Ayla Valinezhad O. et al. (2014) http://naturemiri.com/

8. • En exones e intrones de RNA no
codificante
• La mayoría, en intrones de mRNA
codificante en la misma orientación
que los mRNA
• La mayoría de los miRNA están
aislados a lo largo del genoma, algunos
se encuentran formando clusters
• La mayoría de los genes que codifican
miRNA en nemátodos y en humanos
están aislados, mientras que
en Drosophila son secuenciales
Varilh J. et al. (2015)
Luares genómicos miRNAs. los genes miARN , aislados o en grupos , están ubicados
en regiones intergénicas (miR -494 ) o intragenicas del genoma , incluyendo exones
no codificantes (miR -155) o de codificación(miR-985) e intrones de no codificación
(clúster miR-15a ~ 16-1 ) o de codificación (miR - 126 ).
Ayla Valinezhad O. et al. (2014)

9. 1. Los transcritos primarios de
miRNAs, se transcriben como genes
individuales.
2. La Rnasa Drosha procesa aún más
el pri-miARN en 70 a 100 nt,
llamado pre-miARN.
3. Es exportado desde el núcleo por
exportin 5.
4. En el citoplasma, la pre-miARN es
escindido por Dicer en un miARN:
los genes miARN *dúplex.
5. Ensamblado dentro de RISC, miARN
regula negativamente expresión
por medio de represión de
traducción o la degradación del
ARNm, que depende de la
secuencia de complementariedad
entre el miARN y el mRNA objetivo.

10. Las enzimas RNAsa de tipo III son una familia de ribonucleasas que reconocen específicamente al RNAdc y
que se cree que están presentes en todas las células vivas.
• Las RNAsas de tipo III es que al digerir el RNAdc introducen dos nucleótidos en el sitio de digestión
• Drosha: participa en el procesamiento de los RNA humanos en el núcleo.
• Dicer: genera casi exclusivamente miRNA y siRNA.
Vázquez-Ortiz, et al. (2006)

11. Si-RNA
SiRNA miRNA
Comparten algunas funciones, su composición química y
mecanismos de acción.
Los siRNA provienen generalmente
de grandes moléculas de RNA
dúplex.
Los miRNA son procesados
principalmente a partir de
transcritos en horquillas
Cada siRNA precursor genera varios
siRNA dúplex diferentes
Cada molécula precursora de
horquilla genera un solo RNA
dúplex
No están conservadas entre
organismos relacionados las
secuencias endógenas de siRNA.
Las secuencias de miRNA están
relativamente conservadas en
organismos relacionados
Es posible que los siRNA endógenos
realicen un "autosilenciamiento",
ya que silencian el mismo locus, o
uno muy similar al que les dio
origen
Los miRNA llevan a cabo un
"heterosilenciamiento", ya que
algunos se producen a partir de
genes que pueden silenciar a varios
genes blanco.
Vázquez-Ortiz, et al. (2006)

12. • Denominado como ARN pequeño de
interferencia (ARNip) o ARN de
silenciamiento es una clase de RNA
bicatenario interferente con una
longitud de 20 a 25 nucleótidos que
es altamente específico para la
secuencia de nucleótidos de su RNA
mensajero diana, interfiriendo por
ello con la expresión
del gen respectivo.
• siRNA interfiere con la expresión de
un gen específico, reduciéndola. Además,
los siRNAs también actúan en otras rutas
relacionadas con el RNAi, como en la
defensa antiviral o en la organización de la
estructura de la cromatina en un genoma. La
complejidad de estas rutas es el objeto de
intensos estudios

13. Importancia
• El complejo RISC tiene que ser activado
(RISC*) a partir de una forma latente,
mediante el desapareamiento de las dos
hebras de los siRNAs. RISC* utiliza la hebra
antisentido del siRNA como guía para
seleccionar su substrato: el ARNm
complementario de la hebra de siRNA
presente en el complejo.
• Por otro lado, los siRNAs promueven la
modificación del ADN, facilitando el
silenciamiento de la cromatina, puesto que
favorecen la expansión de los segmentos de
heterocromatina, a través del complejo RITS

14. Identificación de Dicer
Para poder unirse a las moléculas de dsRNA, Dicer
necesita formar un complejo con otras proteínas que
la asisten en sus funciones, como la proteína R2D2
en Drosophila o RDE-4 y RDE-1 en C.elegans.
Se conocían tres tipos de ARNasa III:
• ARNasa III canónica (E. coli): 1 motivo ARNasaIII y 1
dsRBD (en inglés, double strand RNA binding domain)
• Drosha: 2 motivos ARNasa III y 1 dsRBD
• Dicer: 2 motivos ARNAsa III, 1 dominio helicasa y 1
dsRBD

15. El complejo RISC
• El componente activo del complejo RISC es una proteína de la familia de
las endonucleasas denominadas Argonautas, que cortan la hebra de ARNm diana complementaria al
siRNA que está asociado a RISC.
• Como los fragmentos producidos por Dicer son de doble hebra, en teoría ambas hebras podrían
producir un siRNA funcional.
• Aunque existen diferentes proteínas de la familia Argonauta (Ago1, Ago2, Ago3 en mamíferos), sólo
Ago2 puede formar complejos RISC capaces de fragmentar el ARNm diana.

16. rasiRNAs
Trypanosoma brucei
•Especie de parásito
•Causante de trypanosomiasis africana
2002
Abundantes RNAs de 24-26nt de longitud 24-26 parecidos a siRNA
 representaban 2 retrotransposons en el genoma.
 De polaridad antisentido y sentido
En 2003 en un estudio llevado por por Aravin et al.,
sobre el perfil de expresión den RNAi, en
Drosophila se acuña el término “rasiRNA”
2003
2006
RNAs de 24-26nt de longitud pero de origen diferente a TE y
secuencias repetitivas  Piwi RNAs

17. rasiRNA
Presente en:
• Drosophila Melanogaster
• Plantas
• Zebra fish
• T. brucei
• Levaduras
ARN interferentes pequeños asociados a repeticiones
Derivan de RNA Antisentido y
con sentido de cadena simple
Tienen un tamaño: 24-27 nt
Elementos repetitivos y
Retrotransposones

18. rasiRNA biogenesis
Transcrito Sentido
Transcrito Antisentido
5’3’
AGO3
5’ 3’A
PIWI/
AUB
3’ 5’
U
Adenine en nucleotido 10
Uridina en extremo 5’ terminal
U
A
PIWI/
AUB
5’3’ U
5’ 3’
PIWI/
AUB
5’3’ U
Complementaridad de 10 nucleótidos
5’ 3’A
AGO3
5’ 3’A
AGO3
5’3’
U
? PIWI/
AUB
A5’ 3’
?AGO3
Zucchini/
squash
Zucchini/
squash
2’-O-Me
Pimet
Pimet
2’-O-Me
Helicasa (Spn-E y armi) Se
unen a RasiRNA y RNA blanco.
Pimet metiltransferasa
2’ O- metilación en extremo 3’
• Zucchini (zuc)
• Squash (squ)
 Interactúan con Aub y realizan
corte 3’ de RasiRNA maduro
Proteínas involucradas
Proteínas
Piwi
Moscas
• Piwi y Aubergine (Aub)
• Ago3

19. PiwiRNA
Otros
piRNAs rasiRNAs
Tamaño
24-32 nucleótidos
RNAs asociados a proteínas Piwi
RNAs pequeños no codificantes
• RNAs Reguladores
• Descubiertos en 2005
• Se unen a complejo de silenciamiento inducido por
RNA (RISC)
• Expresados principalmente en gónadas
• piRNA se asocian a la
familia de proteínas
argonautas
 subfamilia Piwi
= RISC
Precursor; RNAs de cadena simple
Independientes de RNAasa III (Dicer)

20. Función
En Drosophila melanogaster
 Influencian modificaciones epigenéticas
 Polaridad de ejes en células embrionarias.
 Maduración de oocyto
 Mantenimiento de telómeros
 Silenciamiento de TE y secuencias repetitivas.
 Formación de heterocromatina
 Herramienta potencial
La vía de RNA de interferencia puede ser usada para el
silenciamiento retrovirus VIH para frenar su propagación.

21. Hirotsugu Ishizu et al. Genes Dev. 2012;26:2361-2373

22. Función
Silenciamiento de genes y secuencias repetitivas
 Heterocromatina
Silenciamiento de elementos transponibles (TE):
• TGS: H3K9m3
• PTGS: corte de TE por complementariedad (ping-pong)
Protegen el genoma de TE
Mutaciones en los piRNA
• Inserción de TE
• Defectos en gametogénesis
• Activación puntos de control Chk2 daño de DNA;
• Defectos en la organización de microtúbulos y ejes
de desarrollo gonadal Infertilidad
Derivan de:
 piRNA clusters (elementos intergénicos
repetitivos) >100 kb, comprenden en su
mayoría de TE
 RNAm codificantes de proteínas
PiwiRNA
Biogénesis
Vía de procesamiento
primaria
Amplificación de loop
(ciclo ping pong)

23.  Proteínas Piwi
 Proteínas TDRD
 Otras proteínas
Factores involucrados en la
biogénesis de piRNAs
Hirotsugu Ishizu et al. Genes Dev. 2012;26:2361-2373

24. Elementos de ARNm que se unen metabolitos o iones metálicos
como ligandos y regulan la expresión de ARNm mediante la
formación de estructuras alternativas en respuesta a esta unión.
1. El dominio de aptámero
actúa como un receptor que
se une específicamente a un
ligando.
2. La plataforma de expresión
actúa directamente sobre la
expresión génica a través de
su capacidad para cambiar
entre dos estructuras
secundarias diferentes.
Edwards, A. L. & Batey, R. T. (2010)

25. • Región no tradcida 5' UTR del ARNm bacteriano.
• En algunos ARNm eucariotas el pirofosfato de tiamina (TPP)
riboswitch regula empalme en el extremo 3 .
¿Dónde se encuentran riboswitches?
Edwards, A. L. & Batey, R. T. (2010)

26. Ligandos detectadas por riboswitches
La función de riboswitches está ligado a la capacidad de ARN para formar una diversidad de estructuras.
Edwards, A. L. & Batey, R. T. (2010)

27. Estructuras
• La más básica de ellas es la
hélice de doble cadena,
similar a la encontrada en el
ADN.
• Estructuras secundarias,
plegándose sobre sí misma.
• En ARN de mayor tamaño
estructuras terciarias.
Edwards, A. L. & Batey, R. T. (2010)

28. Los riboswitches controlan los genes esenciales para la supervivencia bacteriana, o genes
que controlan la capacidad de las bacterias para tener éxito en la infección.
• Los riboswitches no se han identificado en los mamíferos, no afectarían a éstos.
• No interferirán en la uniones de ligandos de las proteínas de mamíferos ya que su unión
es muy diferente
Edwards, A. L. & Batey, R. T. (2010)

29. Conclusiones
• Los miRNAs (18 a 24 n) generalmente regulan negativamente
expresión por medio de represión de traducción o la degradación del
ARNm y están involucrados en distintas patologías: cánceres, de
enfermedades cardíacas y neurológicas.
• Los riboswitch regulan la expresión de ARNm mediante la formación
de estructuras alternativas en respuesta a la union de ligandos.
• Las interacciones de los RNAs distintos con otros elementos ya sean
ligandos o proteínas permiten que una regulación ya sea
transcripcional o traduccional, pueden actuar en cis o en trans.

30. REFERENCIAS
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germlines. Genes & Development. Vol. 26, pág. 2361-2373
 Mikiko C. S., Kaoru S., Pezic D. (2011). Reviews: PIWI-interacting RNAs: the vanguard of genome defence. Molecular cell Biology. Vol. 12, pág. 247.
 Theurkauf W. E., Klattenhoff C. (2016). RasiRNAs, DNA damage, and Embryonic Axis Specification. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative
Biology. pp.171-179
 Sergey S., Dmitry K., Rozovsky Y. (2009). RasiRNA pathway controls antisense expression of Drosophila telomeric retrotransposons in the nucleus.
Nucleic acids research. Vol. 37, pp. 268-278
 Thalia. Farazi, Stefan A., Juranek.(2008). The growing catalog of smallRNAs and their association with distinct Argonaute/Piwi family members.
Development.Vol.135, pp. 1201-1214.
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http://doi.org/10.1016/j.biochi.2011.05.026
• Gwyn T. Williams & Farzin Farzaneh (2012) Are snoRNAs and snoRNA host genes new players in cancer? Nature Reviews Cancer 12, 84-
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• Ishizu, H., Siomi, H., & Siomi, M. C. (2012). Biology of PIWI-interacting RNAs: new insights into biogenesis and function inside and outside of
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• Vázquez-Ortiz, Guelaguetza, Piña-Sánchez, Patricia, & Salcedo, Mauricio. (2006). Grandes alcances de los RNAs pequeños RNA de interferencia y microRNA. Revista de
investigación clínica, 58(4), 335-349. Recuperado en 04 de abril de 2016, de http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-
83762006000400009&lng=es&tlng=es.
• Ayla Valinezhad Orang, Reza Safaralizadeh, and Mina Kazemzadeh-Bavili, “Mechanisms of miRNA-Mediated Gene Regulation from Common Downregulation to mRNA-Specific
Upregulation,” International Journal of Genomics, vol. 2014, Article ID 970607, 15 pages, 2014. doi:10.1155/2014/970607
• Edwards, A. L. & Batey, R. T. (2010) Riboswitches: A Common RNA Regulatory Element. Nature. Disponible en http://www.nature.com/scitable/topicpage/riboswitches-a-
common-rna-regulatory-element-14262702#