1. EFECTOS DEL ENTRENAMIENTO DE
FUERZA SOBRE LA SENSIBILIDAD
DEL MÚSCULO ESQUELÉTICO
HUMANO A LA LEPTINA
Hugo Olmedillas Fernández

2. INDICE
q Introducción
q Hipótesis
q Objetivos
q Metodología
-Modificación del procedimiento elecroforético para la separación MHC
q Resultados
q Conclusiones
q Perspectivas de futuro

3. INTRODUCCIÓN
ü ACSM 19981: Aconseja la necesidad de añadir sesiones de fuerza a los
programas de entrenamiento teniendo como objetivo que los principales
grupos musculares del cuerpo se ejerciten.
ü ACSM 20012: El mantenimiento de la masa muscular es un componente
importante para lograr el éxito dentro de programas de entrenamiento
que tengan como objetivo la pérdida de masa grasa.
ü NCSA 2001: Existen evidencias científicas que sugieren que la
participación en programas de fuerza generan beneficios para la salud:
- Disminución de la presión sanguínea.
- Leves mejoras en el perfil lipídico.
- Aumento de la tolerancia a la glucosa y mayor sensibilidad a la
insulina.
MSSE 30(6):975-991, 1998; MSSE 33(12):2145-2156, 2001; MSSE 34(2):364-380, 2002; National Strength & Conditioning
Association: 23(6), 9-23,2001

4. INTRODUCCIÓN
LEPTINA
ü Dickie et al (1950),
comunican la aparición en una de sus colonias de
ratas, un mutante asociado con obesidad mórbida (ob/ob).
ü Coleman et al (1978), describen otra alteración genética en ratones, que
consistía en la aparición de obesidad y diabetes y que fue denominado db/
db.
ü Zhang et al (1994), consiguen clonar el gen ob, que codifica para la
leptina, una proteína de 167aa que se expresaba únicamente en el tejido
adiposo.
ü Tartaglia et al (1995), logran clonar y secuenciar el gen db, que codifica
para las distintas isoformas del receptor de leptina (OB-R).
Dickie MD, J Hered 1950; 41: 317-318; Coleman DL. Diabetologia 1978; 14: 141-148; Zhang et al, Nature 1994; 372: 425-432;
Tartaglia et al Cell 83, 1263-1271.

5. INTRODUCCIÓN
Funciones de la leptina
v Central
- Disminución del apetito
- Aumento gasto energético
v Periférico
- Aumento oxidación A.G.
- Aumento captación de glucosa
- Aumento metabolismo basal
Argiles et al, Med Res Rev. 2005 Jan;25(1):49-65. Review.
Zhang et al, Nature. 1994 Dec 1;372(6505):425-32. Erratum in: Nature 1995 Mar 30;374(6521):479.;

6. INTRODUCCIÓN
Isoformas del receptor de leptina
ü Isoformas secretada o
ü Isoformas cortas
soluble (OB-Re)
(OB-Ra,c,d,f)
ü Isoforma larga
(OB-Rb)
Lee et al., 1996; White y Tartaglia 1996
Tartaglia 1997; Chua et al., 1997.

7. INDICE
q Introducción
q Hipótesis
q Objetivos
q Metodología
-Modificación del procedimiento elecroforético para la separación MHC
q Resultados
q Conclusiones
q Perspectivas de futuro

8. HIPÓTESIS
1. El entrenamiento de fuerza orientado a producir hipertrofia muscular se
asocia a un descenso de la masa grasa.
2. El entrenamiento de fuerza aumenta los niveles de expresión proteica de
receptores de leptina (OB-R) en el músculo esquelético humano.
3. El entrenamiento de fuerza aumenta la sensibilidad a la leptina.

9. HIPÓTESIS
MÚSCULO
ESQUELÉTICO

10. HIPÓTESIS
1. El entrenamiento de fuerza orientado a producir hipertrofia muscular se
asocia a un descenso de la masa grasa.
3. El entrenamiento de fuerza aumenta la cantidad de expresión proteica de
receptores de leptina (OB-R) en el músculo esquelético humano.
5. El entrenamiento de fuerza aumenta la sensibilidad a la leptina.
6. La sensibilidad muscular a la leptina está aumentada en los sujetos con
mayor porcentaje de fibras musculares de tipo I.

11. INDICE
q Introducción
q Hipótesis
q Objetivos
q Metodología
-Modificación del procedimiento elecroforético para la separación MHC
q Resultados
q Conclusiones
q Perspectivas de futuro

12. OBJETIVOS
1. Determinar la expresión proteica de OB-R en músculo esquelético
humano.
2. Investigar si el entrenamiento de fuerza altera los niveles de expresión de
los receptores musculares de leptina.
3. Estudiar si el entrenamiento de fuerza aumenta la sensibilidad a la leptina
en el músculo esquelético humano.

13. INDICE
q Introducción
q Hipótesis
q Objetivos
q Metodología
-Modificación del procedimiento elecroforético para la separación MHC
q Resultados
q Conclusiones
q Perspectiva de futuro

14. MATERIAL Y MÉTODOS
Sujetos:
8 Adultos (activos):
Variable
Edad (años) 34 ± 4.4
Altura (cm) 176 ± 2.8
Peso (Kg) 85 ± 12
BF (%) 23.8 ± 7.5

15. MATERIAL Y MÉTODOS
• Test de fuerza: 1 Repetición máxima (1RM)
• Absorciometría fotónica dual de rayos-X (DXA) (Hologic QDR-1500)
• Biopsia muscular (Técnica de Bergstrom)
Electroforesis
• D. fibras musculares
Histoquímica
• Kit ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay )
• Western Blot

16. 1RM
MATERIAL Y MÉTODOS
Femoral
Leg Prensa Alta
Press Polea
RemoBanca
Extension
TrícepsSentadilla
½ Sentado

17. DXA
MATERIAL Y MÉTODOS
ü Masa grasa corporal (MGC)
ü Masa muscular corporal (MMC)
ü Masa muscular brazos (MMB)
ü Masa muscular piernas (MMP)

18. Biopsia
MATERIAL Y MÉTODOS

19. MATERIAL Y MÉTODOS
Programa de
entrenamiento

20. Determinación de fibras musculares
• Histologica
- ATPase
• Electrophoresis
- SDS-PAGE (Sodium Dodecil Sulfate
Polyacrilamide Gel Electrophoresis)

21. ATPase Technique
4.6
10.3
4.3 4.6 10.3
1 1 5 Tipo I
1
5
3
5
1
1
Tipo IIc
Tipo IIa
4.3
5 3 1 Tipo 2ax
5 1 1 Tipo 2x

22. SDS-PAGE
Isoformas cadena pesada de
miosina (MHC)
IIx
IIa
I
Enhanced protein electrophoresis technique for separating human skeletal muscle myosin heavy chain
isoforms. Bamman J Physiol. Sci. Vol. 56, No. 5; Oct.2006

23. INDICE
q Introducción
q Hipótesis
q Objetivos
q Metodología
-Modificación del procedimiento elecroforético para la separación MHC
q Resultados
q Conclusiones
q Perspectiva de futuro

24. Problemas
I La expresión de mRNA de OB-R en
músculo esquelético humano ya había sido
descrita (Ceddia, et al 2001). Aunque se desconocía
sí existía expresión proteica de las isoformas de
OB-R en este tejido (Guerra et al, 2007).
II Dificultad de establecer la distribución de
las fibras en el músculo esquelético humano.
Mediante la técnica electroforética somos
capaces de determinar las isoformas de la
cadena pesada de miosina (MHC).

25. I OPTIMIZACIÓN DEL WESTERN BLOT PARA
OB-R
• Tampón de extracción de proteínas: UREA 6M-SDS 1%
• Electroforesis: No > 90 min.
• Incubación con anticuerpo primario: la incubación con rabbit-anti-
OB-R O/N a 4ºC 1:2000 en tampón de bloqueo (leche desnatada al 5% diluida en
TBS-Tween 0.1%).
• Lavados: TBS-Tween 20 (0.2%) para disminuir el ruido de fondo.
• Incubación con anticuerpo secundario: la incubación con el anti-rabbit-HRP 1
hora R.T. a 1:20.000 en tampón de bloqueo.
Guerra et al, 2007

26. II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
1. VARIABLES EN LA MUESTRA
2. VARIABLES EN EL GEL

27. II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN LA MUESTRA
ü Degradación extracto proteico

28. II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN LA MUESTRA
ü Degradación extracto proteico
ü Selección de la muestra

29. II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN LA MUESTRA
ü Degradación extracto proteico
ü Selección de la muestra
ü Buffer de extracción

30. II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN LA MUESTRA
ü Degradación extracto proteico
ü Selección de la muestra
ü Buffer de extracción
ü Cuantificación de proteínas

31. II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
1. VARIABLES EN LA MUESTRA
2. VARIABLES EN EL GEL

32. II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN EL GEL
ü Protean II; Mini-protean III

33. II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN EL GEL
ü Protean II; Mini-protean III
ü Grosor del gel

34. II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN EL GEL
ü Protean II; Mini-protean III
ü Grosor del gel
ü Separating gel

35. II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN EL GEL
ü Protean II; Mini-protean III
ü Grosor del gel
ü Separating gel
ü 2-Metamercaptoethanol o Dithiothereitol (DTT)

36. II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN EL GEL
ü Protean II; Mini-protean III
ü Grosor del gel
ü Separating gel
ü 2-Metamercaptoethanol o Dithiothereitol (DTT)
ü 30% Glicerol

37. II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN EL GEL
ü Protean II; Mini-protean III
ü Grosor del gel
ü Separating gel
ü 2-Metamercaptoethanol o Dithiothreitol (DTT)
ü 30% Glycerol
ü Running Buffer

38. II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
Running Buffer
6X (Kohn et al, 2006)
2X Comercial 6X Comercial
• Lower Running Buffer (LRB)
50mM Tris, 75 mM glycine, 0.05%SDS
• Top Running Buffer (TRB)
2x TRB
6x TRB
Electrophoretic Separation of Human Skeletal Muscle Myosin Heavy Chain Isoforms: The Imporatance of
Reducing Agents. T.A. Kohn, K. H. Myburgh. J. Physiol Sci Vo.56, No. 5; 2006; pp.355-360

39. II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN EL GEL
ü Protean II; Mini-protean III
ü Grosor del gel
ü Separating gel
ü 30% Glycerol
ü 2-Metamercaptoethanol o Dithiothreitol (DTT)
ü Running Buffer
ü Temed

40. II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
TEMED 0.1% TEMED 0.25%
TEMED 0.03%
TEMED 0.05%

41. II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
VARIABLES EN EL GEL
ü Protean II; Mini-protean III
ü Grosor del gel
ü Separating gel
ü 30% Glycerol
ü 2-Metamercaptoethanol o Dithiothreitol (DTT)
ü Running Buffer
ü Temed
ü Tinción del gel

42. II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
Tinción del gel
SILVER
Type IIx
Type IIa
Type I
COOMASSIE
Western Blot

43. II OPTIMIZACIÓN DE SDS-PAGE PARA MHC
MHC

44. INDICE
q Introducción
q Hipótesis
q Objetivos
q Metodología
-Modificación del procedimiento elecroforético para la separación MHC
q Resultados
q Conclusiones
q Perspectivas de futuro

45. RESULTADOS
1RM MIEMBROS
SUPERIORES
* * 36%
1RM (kg)
*
A B A B A B
P. BANCA REMO EXT.TRICEPS

46. RESULTADOS
1RM MIEMBROS
INFERIORES
* 14%
1RM (kg)
*
*
A B A B A B
PRENSA ½ SQUAT L.E.

47. RESULTADOS
GRASA CORPORAL
*
Grasa Corporal (%)
A B

48. Leptin Concentration (ng/
mL)
A
LEPTINA
B
*P=0.002
RESULTADOS

49. RESULTADOS
OB-R
OB-R/alpha-Tubulin band density
P= 0.33
P= 0.43
(arbitrary units)
P= 0.64
A B A B A B
170KDa 128KDa 98KDa

50. RESULTADOS
MMC
MMC (kg) P= 0.46
A B

51. INDICE
q Introducción
q Hipótesis
q Objetivos
q Metodología
-Modificación del procedimiento elecroforético para la separación MHC
q Resultados
q Conclusiones
q Perspectivas de futuro

52. CONCLUSIONES
ü Hemos identificado OB-R en músculo esquelético
humano.
ü Hemos mejorado la técnica electroforética
permitiendo la identificación de las tres isoformas
de MHC en músculo esquelético humano de forma
reproducible.
ü Tras un programa de 12 semanas de entrenamiento
de fuerza se produce una reducción de la masa
grasa y una disminución significativa de la
concentración de leptina en suero, pero la expresión
proteica de OB-R no cambia.

53. CONCLUSIONES
ü Los resultados son compatibles con un aumento
de la sensibilidad a la leptina en músculo esquelético
humano en respuesta al entrenamiento de fuerza.

54. INDICE
q Introducción
q Hipótesis
q Objetivos
q Metodología
-Modificación del procedimiento elecroforético para la separación MHC
q Resultados
q Conclusiones
q Perspectivas de futuro

55. PERSPECTIVAS DE
FUTURO
1. Analizar eletroforéticamente todas las fibras musculares
de las muestras que tenemos en el laboratorio (± 300).
2. Conocer las vías de señalización activadas por el OB-Rb
en respuesta al ejercicio.
3. Localizar histoquímicamente el OB-R en la fibra
muscular.

56. Localizar histoquímicamente el OB-R en la fibra muscular
25µm
25µm
200X_ Goat anti Rabbit 200X_ Rabbit antiOBR
25 µm
400X_ Rabbit antiOBR

57. ATENCIÓN