Curso de Microbiología cap v

CAPÍTULO V
FISIOLOGÍA
BACTERIANA
CURSO DE MICROBIOLOGÍA UNIVERSIDAD DE LAS AMÉRICAS
UDLA
ESCUELA DE INGENIERÍA AMBIENTAL

OBJETIVOS
 Conocer las particularidades fisiológicas, desarrollo y crecimiento de los
microorganismos y su importancia para la Biosfera.
 Identificar las rutas metabólicas microbianas comunes a todos los organismos
vivos y específicas para estos, en especial las de obtención de energía.
 Analizar los mecanismo de reproducción de microorganismos.
 Comparar los mecanismos de motricidad microbiana con la de los organismos
eucariotas.

CONTENIDO
 Fisiología bacteriana:
1. Crecimiento. Cinética microbiana
2. Metabolismo: Catabolismo y anabolismo. Rutas metabólicas
3. Nutrición: Procesos de membrana. Obtención de energía
4. Reproducción: Tipos
5. Movimiento.

CINÉTICA MICROBIANA
 CRECIMIENTO MICROBIANO
 “El crecimiento de células, microorganismos, células vegetales y animales,
puede mirarse bajo dos aspectos o tipos de crecimiento reproductivo.
 a) Células individuales o población de células en crecimiento sincronizado
para estudio del ciclo de vida celular. Procesos en laboratorio.
 b) División estocástica de la población, o división al azar.

CRECIMIENTO MICROBIANO
MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO .
 El cálculo del número de células que existen en una suspensión se
puede llevar a cabo mediante :
1. el recuento celular (microscopía),
2. número de colonias),
3. masa celular (peso seco, medida del nitrógeno celular,
turbidimetría) o
4. actividad celular (grado de actividad bioquímica con relación al
tamaño de la población).
Todos estos métodos se clasifican en dos apartados: métodos
directos y métodos indirectos.

 Métodos directos:
 Recuento del número
de células en una
cámara Thoma
 Peso seco celular
 Determinación de
nitrógeno o de
proteínas totales
 Determinación de DNA

Métodos indirectos:
1. Recuento de colonias en placa
2. Recuento sobre filtro de membrana
3. Consumo de oxígeno
4. Liberación de dióxido de carbono
5. Concentración de un enzima constitutivo
6. Decoloración de un colorante
7. Incorporación de precursores radiactivos
8. Medida de la turbidez

 El peso seco (contenido de sólidos) de las
células bacterianas que se encuentran en una
suspensión se obtiene por el secado de un
volumen en un horno a 105°C hasta peso
constante. Esta técnica es útil para grandes
volúmenes de muestra.
 La desventaja de este método es que
componentes volátiles de la célula pueden
perderse por el secado y puede existir alguna
degradación.
 También la muestra seca puede recobrar
humedad durante el pesado, principalmente si
el ambiente tiene una humedad relativa alta.

 PESO ESPECÍFICO ANHIDRO:
 ρ0 = Peso anhidro
Volumen Anhidro
PESO ESPECÍFICO A H% DE HUMEDAD
 ρk = Peso al H% de humedad
Volumen al H% de humedad
Cuando la humedad es del 12 %,se llama peso
específico normal

ABSORCIÓN:
 La nefelometría mide la luz dispersada por
una solución de partículas.
 La turbidimetría mide la luz dispersada
como un decrecimiento de la luz
transmitida a través de la solución.
 Los métodos de dispersión de la luz son las
técnicas más utilizadas para monitorear el
crecimiento de los cultivos bacterianos.

 Turbidimetría: La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de luz
debido a partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida.

RECUENTO MICROSCÓPICO:
 Para estos recuentos se utilizan
generalmente cámaras de recuentos,
aunque también pueden realizarse a
partir de muestras filtradas en
membranas y transparentes o teñidas
con colorantes fluorescentes (Naranja
de acridina).
 Las cámaras más utilizadas son las de
Hawksley y la de Petroff-Hausser. La
primera tiene la ventaja que puede ser
utilizada con objetivos de inmersión,
aunque la mayoría de los recuentos se
realizan con objetivos secos.

 Recuento de microorganismos.
Tipo de cuadro
Area
[cm2]
Volumen
[ml]
Factor
[1/Volumen]
Cuadrado total 1.00 x 10-2 2.00 x 10-5 5.00 x 104
Cuadrado grande 4.00 x 10-4 8.00 x 10-7 1.25 x 106
Cuadrado pequeño 2.50 x 10-5 5.00 x 10-8 2.00 x 107

 CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE UN CULTIVO INTERMITENTE

 La fase Lag, en la que el microorganismo se adapta a las
nuevas condiciones y pone en marcha su maquinaria
metabólica para poder crecer activamente. La duración de
esta fase es variable y en general es mayor cuanto más
grande sea el cambio en las condiciones en las que se
encuentra el microorganismo.
 La fase de crecimiento exponencial. El número de
bacterias crece en forma exponencial en un tiempo
relativamente corto

 La fase estacionaria, en la que no hay aumento neto
de microorganismos, lo que no significa que no se
dividan algunos, sino que la aparición de nuevos
individuos se compensa por la muerte de otros.
 La fase de muerte, en la que el número de
microorganismos vivos disminuye de forma
exponencial con una constante k que depende de
diferentes circunstancias.
16

 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO .
 la generación del producto se mantiene constante mientras la concentración del
sustrato no sea limitante. Esto se definiría como
[ES] = [Et] [S]
[S] + (k2 + k -1) / k1
 La velocidad inicial de la reacción está determinada por
 v = k2 [ES]
 Si definimos KM como (k2 + k -1) / k1 y Vmax como k2 [Et], obtenemos que
 v = Vmax [S] / KM + [S]
 Esta es la ecuación de Michaelis-Menten.

 Estos últimos dos parámetros son importantes, porque nos dan información
directa sobre cuán bien el microorganismo se une al sustrato (KM) y sobre
cuán bien el microorganismo convierte el sustrato en producto una vez se une
(Vmax).
 De hecho, KM es la constante de disociación dinámica del microorganismo con
el sustrato, y
 Vmax es la concentración molar del microorganismo por la constante catalítica
(Kcat).
Km, es igual a la concentración de sustrato, bajo la cual la concentración
molar microbiana (velocidad de reacción);es igual a la mitad de la
concentración molar máxima. Cada sepa, se caracteriza por una valor de Km
específico.

 RELACIONES MATEMÁTICAS:
 En un cultivo estático con crecimiento
exponencial el tiempo de generación celular es
equivalente al tiempo de generación del cultivo y
viene dado por 1/k. En un quimiostato, el tiempo
de generación en cultivo es la inversa del ritmo de
crecimiento instantáneo de un cultivo, el cual se
expresa por la siguiente ecuación diferencial:
 dx = μx ó μ= 1 dx
dt x dt

 Donde x es el número de células o la concentración del organismo (miligramos
de peso seco por mililitro) a un tiempo t, y μ es el ritmo o velocidad de
crecimiento instantáneo. Con la integración de la ecuación anterior entre los
límites xo y xt, se obtienen la siguiente ecuación:
 ln xt -ln xo = μt
o, como se expresa generalmente la solución,
Xf = xo e μt
 μ = k(ln 2) = 0.693 k
 Con esta fórmula, se puede calcular μ, el ritmo de crecimiento instantáneo para
un quimiostato, multiplicando k por 0.693

Tasa (µ) ideal de crecimiento
microbiano
21

Ecuación del proceso
 La ecuación de un proceso aeróbico, muestra como el
conocimiento de la fórmula del contaminante, es
fundamental, para determinar la cantidad de O2. A
partir de la ecuación es factible hacer el cálculo
(extrapolación), del volumen de oxígeno necesario por
m3 de residuos.
22
CnHaObNc + (2n + 0,5 a - 1,5c –b)/2 O2→nCO2 + cNH3 + a-3c/2 H2O

Grafico construido a partir datos
experimentales
23
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5 6
CONCENTRACIÓNENppm
ln UFC
DEGRADACIÓN VS UFC
TPHs
Ufc

Ejemplo de cálculo de tasa de
crecimiento microbiano
24
CEPAS 4 horas 24 Horas lnN1 lnN2 K
Cepa 1
32 160 3,40 5,07 0,081
Cepa 2
21 92 3,04 4,52 0,124
Cepa3
25 112 3,21 4,71 0,075
Cepa 4
15 63 2,70 4,13 0,071
Cepa 5
9 42 2,19 3,73 0,077
Cepa 6
41 85 3,71 4,44 0,036
Cepa 7
63 154 4,14 5,03 0,044
Cepa 8
6 41 1,79 3,71 0,126
Cepa 9
12 43 2,48 3,76 0,064
𝑲 =
𝒍𝒏𝑵𝟐 − 𝒍𝒏𝑵𝟏
𝒕𝟐 − 𝒕𝟏

Conteo rutinario de control durante un proceso de
biorremediación
25
CEPA
Ufc x106
I II III IV V
Cepa 1
32 0,08 0,51 0,09 0,78
Cepa 2
21 1,10 1,80 2,60 3,70
Cepa3
25 0,70 0,40 0,80 0,95
Cepa 4
15 0,05 0,90 0,70 1,00
Cepa 5
9 0,03 0,20 0,50 0,84
Cepa 6
41 0,80 0,92 1,40 1,70
Cepa 7
63 0,70 0,92 1,10 1,20
Cepa 8
6 0,02 0,04 0,05 0,08
Cepa 9
12 0,03 0,80 0,67 0,97
Tiempo
24h 30 días 60 días 90 días 120 días

Ejemplo de cálculo de la Tasa de
Biodegradación
26
Cepa
Muestra A ppm Muestra B ppm
I II III IV V I II III IV V
X1 5000 4629 3731 2978 2120 850 837 819 798 720
X2 5000 4896 4662 4132 3700 850 652 387 105 78
X3 5000 4021 3657 2133 1867 850 812 779 721 720
X4 5000 4729 4119 3027 2630 850 845 832 812 801
X5 5000 4502 4194 3645 3112 850 827 814 802 798
X6 5000 4679 4510 4467 4230 850 721 413 156 94
X7 5000 4003 3729 2765 2079 850 691 396 138 97
X8 5000 4867 4622 4139 4002 850 800 784 726 710
X9 5000 4902 4762 4473 4137 850 770 625 251 112
Tiempo/días
0 30 60 90 120 0 30 60 90 120

27
Capa X1 Capa X2 Capa X3
lnCo/C=kt lnCo/C=kt lnCo/C=kt
Ln 5000/4629= 0,07
Ln 5000/3731=0,29
Ln 5000/2978=0,51
Ln 5000/2120=0,85
ln5000/4896= 0,02
ln5000/4662= 0,06
ln5000/4132= 0,19
ln5000/3700= 0,30
ln5000/4021= 0,21
ln5000/3657= 0,31
ln5000/2133= 0,85
ln5000/1867= 0,98
Pendiente = Y2-Y1 / X2 – X1 Pendiente = Y2-Y1 / X2 – X1 Pendiente = Y2-Y1 / X2 – X1
K=0,85-0,07/1-120
K=0,78/119
K= 0,0065
K=0,30-0,02/1-120
K=0,28/119
K= 0,0023
K=0,98-0,21/1-120
K=0,77/119
K= 0,0064
ln5000/4729= 0,05
ln5000/4119= 0,19
ln5000/3027= 0,50
ln5000/2630= 0,64
ln5000/4502= 0,10
ln5000/4194= 0,17
ln5000/3645= 0,31
ln5000/3112= 0,47
ln5000/4679= 0,06
ln5000/4510= 0,10
ln5000/4467= 0,11
ln5000/4230= 0,16
K=0,64-0,05/1-120
K=0,59/119
K= 0,0049
K=0,47-0,10/1-120
K=0,37/119
K= 0,0031
K=0,16-0,06/1-120
K=0,1/119
K= 0,00084
ln5000/4003= 0,22
ln5000/3729= 0,29
ln5000/2765= 0,59
ln5000/2079= 0,87
ln5000/4867= 0,02
ln5000/4622= 0,07
ln5000/4139= 0,18
ln5000/4002= 0,22
ln5000/4902= 0,019
ln5000/4762= 0,048
ln5000/4473= 0,11
ln5000/4137= 0,18
K=0,87-0,22/1-120
K=0,65/119
K= 0,0054
K=0,22-0,02/1-120
K=0,20/119
K= 0,0016
K=0,18-0,019/1-120
K=0,161/119
K= 0,0013

Variación de lnCo/C sustrato
28
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9
lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C lnCo/C
0 0 0 0 0 0 0 0 0
0,07 0,02 0,21 0,05 0,10 0,06 0,22 0,02 0,019
0,29 0,06 0,31 0,19 0,17 0,10 0,29 0,07 0,048
0,51 0,19 0,85 0,50 0,31 0,11 0,59 0,18 0,11
0,85 0,30 0,98 0,64 0,47 0,16 0,87 0,22 0,18

Variación comparativa de lnCo/c de
sustrato
29

Tiempo de vida media
30
X1 X2 X3
t= - ln (0,5)/0,0065
t= -(-0,69)/0,0065
t= 106,6 días.
t= - ln (0,5)/0,0023
t= -(-0,69)/0,0023
t= 300 días.
t= - ln (0,5)/0,0064
t= -(-0,69)/0,0064
t= 107,8 días.
X4 X5 X6
t= - ln (0,5)/0,0049
t= -(-0,69)/0,0049
t= 140,8 días.
t= - ln (0,5)/0,0031
t= -(-0,69)/0,0031
t= 222,5 días.
t= - ln (0,5)/0,00084
t= -(-0,69)/0,00084
t= 821,4 días.
X7 X8 X9
t= - ln (0,5)/0,0054
t= -(-0,69)/0,0054
t= 127,7 días.
t= - ln (0,5)/0,0016
t= -(-0,69)/0,0016
t= 431,2 días.
t= - ln (0,5)/0,0013
t= -(-0,69)/0,0013
t= 530,7 días.

Tiempos de vida media de los
residuos
31
Cepa TIEMPO (días) A TIEMPO (días)B
X1 106,6 575,0
X2 300,0 40,58
X3 107,8 690,0
X4 140,8 1533,3
X5 222,5 1916,6
X6 821,4 40,8
X7 127,7 43,2
X8 431,2 750,0
X9 530,7 43,1

Tiempos de vida comparativos
32
0
500
1000
1500
2000
2500
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tiempo/días
Cepa microbiana
Tiempos de vida comparativos de Sustrato A y Sustrato
B
TPHs
HAPs

Eficiencia comparativa
33
𝒀 = 𝑪𝒇 𝒙 100
𝑪𝒐
Cepa % A % B
X1 57,60 15,29
X2 26,00 90,80
X3 62,60 15,29
X4 47,40 5,76
X5 37,76 6,11
X6 15,40 88,94
X7 58,42 88,58
X8 19,96 16,47
X9 2,60 86,82
Testigo 0 0

Clasificación de los microorganismos

Según la fuente de carbono que
emplean

Según el punto de vista biosintético

ANABOLISMO Y CATABOLISMO
 Dos procesos simultáneos, como la oxidación y reducción

ANABOLISMO Y CATABOLISMO
 Una expresión del flujo permanente de materia y energía

Transformaciones biológicas del carbono

Reacciones
de óxido
reducción
bacteriana

Obtención de ATP
 Fosforilación de sustrato

Obtención de ATP
 Flujo de electrones en la fosforilación oxidativa

Comparativo
de los dos
tipos de
fosforilización

CUESTIONARIO
 Para qué es necesario la determinación de la tasa de crecimiento microbiano?
 ¿Qué importancia tiene la determinación del tiempo de vida media de u
sustrato?
 ¿Cómo se determina la tasa de degradación (consumo del sustrato) y cuál es
su importancia ambiental y práctica en ingeniería ambiental?
 ¿Cuál es la relación entre la curva de crecimiento microbiano y curva de la
tasa de degradación? ¿Que relevancia técnico legal tiene?
 ¿Cuál s le metabolito central de todo el metabolismo microbiano y por qué se
dice eso?
 ¿Cuáles son las etapas del esquema general del metabolismo?
 ¿Cuáles son las rutas que sigue el piruvato?

CUESTIONARIO
 ¿En qué se diferencian los dos tipos de fosforilación?
 Esquemáticamente represente la cadena respiratoria y diga ¿cuál es su
importancia en el metabolismo biológico?
 ¿Qué tipo de reacciones de oxido reducción biológica se implementan en el
metabolismo intermedio?
 ¿Qué rol cumplen en el metabolismo NAD+, FAD+ y ADP?
 Elabore un esquema que represente al anabolismo ligado al catabolismo.
 ¿Por qué acetil coenzima A es importante para la síntesis de proteína?
 Elabore una tabla de clasificación de los microorganismos por la fuente de
energía que utilizan.

Cuestionario
 ¿Qué representa Km (Ks) y cuál es su importancia para ciencias ambientales?
 Describa las etapas de la curva de crecimiento microbiano.
 Diferencias entre medición turbidimétrica y nefelométrica.
 Enumere los métodos indirectos de conteo microbiano

BIBLIOGRAFÍA
 Jeffrey C. Pommerville. (2011). Alcamo´s Fundamental of Microbiology, Ninth
edition. Jones and Bartlett Publishers. Cap IV.
 Kurt Konhauser. (2007). Introduction to Geomicrobiology. Blackwell
Publishing. Cap III.
 Trivedi P.C. (2010). Text Book of Microbiology. Aavishkar Publishers. India.
 Anne Maczulak. (2011). Encyclopedia of Microbiology. Facts On File, Inc.

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