El documento discute el efecto de diferentes factores ambientales y agentes químicos en el crecimiento microbiano. Se evaluó cómo la temperatura, el pH, la concentración de sal y glucosa, y diferentes desinfectantes afectan el crecimiento de bacterias como E. coli, B. subtilis y S. aureus. Los resultados mostraron que la temperatura, la sal y los desinfectantes como el yodo y el formol inhiben el crecimiento, mientras que el pH y la glucosa solo afectan a algunos microorganismos.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
FACULTAD DE INGENIERÍA
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E.A.P. INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
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Control microbiano:
acción de los agentes
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físicos y químicos
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CURSO:
Laboratorio de Microbiología
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DOCENTE: Mblgo. Carlos Azañero Díaz
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GRUPO:
¨D¨
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ALUMNA: Aburto Rodríguez Ruddy
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2. Control Microbiano: Acción de los Agentes Físicos y Químicos
I.
INTRODUCCIÓN
A pesar de que todavía no existe un documento legal que exija el control
microbiológico de superficies, cada vez más se toma en cuenta que se tiene que
verificar un plan de limpieza y desinfección. Así, los programas de limpieza y
desinfección se diseñan con el objetivo de reducir, y en algunos casos, eliminar la
carga bacteriana y restos de materia orgánica e inorgánica de las superficies. De
esta forma, se pretende minimizar el riesgo de contaminación cruzada para
garantizar un producto seguro y de calidad.
Actualmente, un factor a considerar en el diseño del plan de higienización es la
eliminación de unas estructuras denominadas biofilms, las cuales, no se habían
tenido en consideración hasta que no se han desarrollado sistemas que permiten
realizar su detección.
Tanto es así que en los últimos años ha ido creciendo el interés en la investigación,
desarrollo y/o mejora de técnicas rápidas, fiables y sencillas para evaluar la
contaminación de superficies. Sin embargo, el conocimiento acerca de su validez
en el uso industrial práctico es todavía escaso. Hay técnicas tradicionales y rápidas
para evaluar la contaminación microbiológica en superficies y la formación de
biofilms en condiciones experimentales, especialmente organismos alterantes y
patógenos como L. monocytogenesy posteriormente y con la experiencia adquirida
por los años, se ha llevado estudios de monitorización y estableciente de límites
críticos en las diferentes industrias.
Además, el trabajo de décadas de microbiólogos hace que destaque la importancia
de aislar los microorganismos del ambiente industrial y las posibilidades y
perspectivas de futuro para utilizar las técnicas descritas en el ambiente industrial
como herramientas de verificación de la limpieza y control de superficies.
Microbiología General
1

3. Control Microbiano: Acción de los Agentes Físicos y Químicos
II.
OBJETIVO
Demostrar e interpretar el efecto de la temperatura, pH y concentración de
glucosa y NaCl sobre el crecimiento microbiano.
Demostrar y comparar el efecto germicida de algunos antisépticos y
desinfectantes de uso corriente.
III. MATERIALES
Material biológico
Cultivos puros bacterianos:Saccharomyces serevisiae, Bacillus subtilis,
Escherichia coli, Staphylococcus aureus.
Material de Laboratorio
Cultivo puro de Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella y Klebsiella
Tubos de ensayo con agar TSI, medio SIM
Tubos de ensayo con Agar citrato de Simmons
Tubos de ensayo con caldo común
Tubos de ensayo con caldo RMVP
Prueba de citocromo oxidasa 1
Reactivo de Kovacs
Rojo de metilo (pH 4)
Microbiología General
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4. Control Microbiano: Acción de los Agentes Físicos y Químicos
IV. procedimiento:
1. Efecto de la temperatura y tiempo de exposición sobre el crecimiento de
microorganismos.
En dos tubos con caldo común, sembramos por suspensión cultivos
puros de Escherichia coli y Bacillus subtilis.
Sometimos los tubos anteriores previamente rotulados a 60 °C y 100 °C
por 10 minutos.
Incubamos a 37 °C por 12horas.
Transcurrido el tiempo de incubación, observamos si hubo o no
crecimiento en cada uno de los tubos.
2. Efecto del pH, concentración de NaCl y concentración de glucosa sobre el
crecimiento de microorganismos.
Sembramos
por
suspensión
cultivos
purosde
Escherichia
coli,Staphylococcus aureusy Saccharomyces serevisiaeen tubos de
ensayos con caldo común a pH 7 y a pH 9, en tubos de ensayo con
caldo común con NaCl a 1%, 6.5% y 15% y en tubos con caldo común
de glucosa al 10%, 20% y 30%.
Microbiología General
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5. Control Microbiano: Acción de los Agentes Físicos y Químicos
Incubamos todos los tubos a 37 °C por 12 horas.
Transcurrido el tiempo de incubación observamos si hubo o no
crecimiento en cada uno de los tubos.
3. Acción de agentes químicos y orgánicos (Desinfectantes y/o Antisépticos) :
Preparar una suspensión turbia del cultivo puro bacteriano Escherichia
coli(Gram -) en un frasco de penicilina con SSF estéril.
Coger una a dos asadas del cultivo puro y disolver en la SSF, hasta
obtener una ligera turbidez.
Empapa un hisopo de la suspensión bacteriana antes realizada. Antes
de sacar del hisopo escurrir lo sobrante presionando el hisopo dentro
de las paredes del frasco.
Sembrar por estría en superficie toda la placa Petri con agar común.
Con ayuda de una pinza previamente esterilizada por flameado coger
un disco de papel filtro y embeber con alcohol a 70% y colocarlo dentro
de la placa Petri con agar común previamente sembrada. Repetir lo
anterior con formol, hipoclorito, detergente y yodo. Colocar los discos
embebidos con cada una de las sustancias químicas en forma
equidistante.
Microbiología General
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6. Control Microbiano: Acción de los Agentes Físicos y Químicos
Repetir todo lo anterior con cultivo puro deStaphylococcus aureus
(Gram +).
Rotular e Incubar las placas a 37 °C por 12 horas.
V.
RESULTADOS:
1. Agar Efecto de la temperatura y tiempo de exposición sobre el crecimiento de
microorganismos.
Muestraa 60°C:
1
2
Muestras de Bacillus subtilis (1) y E. coli (2):
1: (+++) Se observa mayor turbidez, prueba
positiva
2: (++) Turbidez, prueba positiva.
Muestra a 100°C:
1
2
Muestras de Bacillus subtilis (1) y E. coli (2):
La turbidez es indicar de crecimiento bacteriano.
1: Prueba negativa.
2: Prueba negativa.
Microbiología General
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7. Control Microbiano: Acción de los Agentes Físicos y Químicos
2. Efecto del pH, concentración de NaCl y concentración de glucosa sobre el
crecimiento de microorganismos.
Concentración de Glucosa en cultivo puro de Saccharomyces serevisiae:
10%
30%
Concentración de glucosa:
Turbidez indicador de crecimiento.
10%: (+++) turbidez, reacción positiva.
20%
20%: (+) turbidez, reacción positiva.
30%:(+) turbidez, reacción positiva.
Concentración de Glucosa en cultivo puro de Escherichia coli:
30%
10%
Concentración de glucosa:
Turbidez indicador de crecimiento.
20%
10%: (-) turbidez, reacción negativa.
20%: (-) turbidez, reacción negativa.
30%: (-) turbidez, reacción negativa.
Concentración de Glucosa en cultivo puro deStaphylococcus aureus:
10%
30%
Concentración de glucosa:
Turbidez indicador de crecimiento.
10%: (-) turbidez, reacción negativa.
20%
20%: (-) turbidez, reacción negativa.
30%: (-) turbidez, reacción negativa.
Concentración de NaCl en cultivo puro de Escherichia coli:
1%
Concentración de glucosa:
Turbidez indicador de crecimiento.
1%: (++) turbidez, reacción positiva.
15%
15%: (-) turbidez, reacción negativa.
Microbiología General
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8. Control Microbiano: Acción de los Agentes Físicos y Químicos
Concentración de NaCl en cultivo puro de Staphylococcus aureus:
Concentración de glucosa:
6,5%
1%
Turbidez indicador de crecimiento.
15%
1%: (+) turbidez, reacción positiva.
6,5%: (+) turbidez, reacción positiva.
15%: (-) turbidez, reacción negativa.
Concentración de NaCl en cultivo puro de Saccharomyces serevisiae:
Concentración de glucosa:
Turbidez indicador de crecimiento.
1%
6,5%
1%: (+) turbidez, reacción positiva.
15%
6,5%: (-) turbidez, reacción negativa.
15%: (-) turbidez, reacción negativa.
3. Acción de agentes químicos y orgánicos (Desinfectantes y/o Antisépticos):
Muestra de cultivo puro deEscherichia coli:
Muestras de Desinfectantes y/o Antisépticos:
Detergente (D): (-)no inhibe el crecimiento.
Yodo (Y): (-) inhibe el crecimiento microbiano.
Alcohol (A):(-)no inhibe el crecimiento microbiano.
Formol (F): (+++) inhibe el crecimiento microbiano.
Legía: (+)inhibe el crecimiento microbiano.
Muestra de cultivo puro deStaphylococcus aureus:
Muestras de Desinfectantes y/o Antisépticos:
Detergente (D): (-)no inhibe el crecimiento.
Yodo (I): (+) inhibe el crecimiento microbiano.
Alcohol (A):(-)no inhibe el crecimiento microbiano.
Formol (F): (++++) inhibe el crecimiento microbiano.
Legía: (++)inhibe el crecimiento microbiano.
Microbiología General
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9. Control Microbiano: Acción de los Agentes Físicos y Químicos
VI. DISCUSIÓN:
En Agar Efecto de la Temperatura y Tiempo de exposición sobre el crecimiento de
microorganismos. La temperatura es un factor ambiental importante en el
control de crecimiento microbiano. Las temperaturas cardinales o fundamentales
definen las temperaturas mínima, óptima y máxima a las que crece cada
microorganismo. Los microorganismos pueden agruparse según los márgenes de
temperatura requerida. Los organismos cuyas temperaturas óptimas de
crecimiento se sitúan entre los 45 a 80ºC se llaman termófilas. Estos organismos
que habitan en ambientes calientes, como fuentes termales en ebullición. Los
termófilos producen macromoléculas termoestables.Brook, Bioquímica de los
Microorganismos Pág. 157
Los mesófilos se encuentran en animales de sangre caliente y en medios
acuáticos y terrestres de latitudes templadas y tropicales. El E. coli, es un típico
mesófilo, se han definido con precisión las temperaturas cardinales o
fundamentales. La temperatura óptima de E. coli en un medio complejo es 39ºC,
la máxima es 48ºC y la mínima es 8ºC estos valores son susceptibles de pequeñas
variaciones debidas a diferentes cepas y, en general, las temperaturas máxima y
mínima suelen ser respectivamente mayores y menores cuando se usan medios
complejos
en
vez
de
medios
definidos.Brook,
Microorganismos Pág. 152
Microbiología General
Bioquímica
de
los
8

10. Control Microbiano: Acción de los Agentes Físicos y Químicos
La Concentración de Glucosa,tiene que ver con la actividad de agua que llega a ser
limitada por un organismo cuando aumenta la concentración de soluto disuelta en
el medio. El agua difunde desde una región con una alta concentración de agua
(baja concentración de solutos) hasta una región con menor concentración de
agua (mayor concentración de solutos) por el proceso denominado ósmosis. En la
mayoría de los casos, el citoplasma de una célula tiene una concentración de
solutos mayor que el medio, por lo que el agua tiende a entrar dentro de la célula,
diciéndose entonces que existe un balance de agua positivo. Sin embargo, cuando
una célula está en un medio con baja actividad de agua, existe una tendencia del
agua a salir de la célula. Entonces podemos decir que los organismos capaces de
crecer en ambientes con alta concentración de azucares (como es el caso de la
glucosa) se denominan osmófilos, son organismos que pueden crecer en
ambientes muy secos (por falta de agua).Brook, Bioquímica de los
Microorganismos Pág. 159
La Concentración de NaCl, en la naturaleza, los efectos de osmóticos tiene interés
principalmente en hábitat con altas concentraciones de sales. Los microorganismos
marinos tienen una dependencia específica del ion sodio además de tener un
crecimientoóptimo el valor de actividad de agua propio del agua del mar. Tales
microorganismos se les llama halófilos (requieren algo de NaCl), hay los halófilos
discretos (1-6% de NaCl) y los halófilos moderados (6-15% de NaCl). Los
organismos halotolerantes pueden soportar alguna reducción de aw del medio,
pero generalmente crecen mejor en ausencia de solutos añadidos. Por el contrario,
los organismos se desarrollan con muy baja actividad de agua, y estos son de gran
interés desde el punto de vista aplicado en la industria alimentaria, donde solutos
como la sal y la sacarosa se empleanen frecuentemente como conservadores para
inhibir el crecimiento microbiano. Los organismoscapaces de crecer en ambientes
muy salinos se les llama halófilos extremos y, según las especies, requieren 15-30%
de NaCl para su crecimiento óptimo.Brook, Bioquímica de los Microorganismos
Pág. 160
Microbiología General
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11. Control Microbiano: Acción de los Agentes Físicos y Químicos
Acción de agentes Desinfectantes y/o Antisépticos;a menudo se emplean
compuestos
químicos
para
controlar
el
crecimiento
microbiano.
Los
antisépticosson aquellos agentes químicos que matan inhiben el crecimiento
microbiano y pueden aplicarse en tejidos vivos dada su escasa toxicidad para los
tejidos. La mayoría de los compuestos que se encuentran en esta categoría se
utilizan para el lavado de manos, para tratar heridas superficiales y en algunos
casos antisépticos también son desinfectantes eficaces. Los desinfectantes son
productos químicos que matan microorganismos y se usan en objetos inanimados.
Los agentes esterilizantes son desinfectantes que, en condiciones apropiadas,
matan todos los tipos de vida microbiana, y se usan para esterilizar objetos
inanimados y superficies. Los desinfectantes químicos, frecuentemente llamados
microbicidas, tienen una gran aplicación en los casos enlos que no se puede usar el
calor o la radiación en la esterilización. La eficiencia de un agente químico
antimicrobiano se cuantifica determinando la concentración mínima necesaria
para inhibir completamente el crecimiento bacteriano.
Microbiología General
10

12. Control Microbiano: Acción de los Agentes Físicos y Químicos
VII. CONCLUSIÓN:
En Agar Efecto de la Temperatura y Tiempo de exposición sobre el crecimiento
de microorganismos, Bacillus subtilis (1) y E. coli (2)se evidenció que a
temperaturas menores de 60°C podemos esperar que haya crecimiento
microbiano, pero a mayores o iguales que 100°C el crecimiento no se da, ya
que son bacterias:(1) termófila y (2)mesófila.
La Concentración de Glucosa,esta prueba se realiza para definir su capacidad
de osmotoleranciapuesto que crecimiento microbianose evidencia cuando hay
presencia de turbidez en la muestra; en el caso del cultivo puro de
Saccharomyces serevisiae la menor concentración de glucosa (10%) facilita el
crecimiento microbiano, en cambio los cultivos puros de Escherichia coliy
Staphylococcus aureusno tienen capacidad de osmotolerancia con la glucosa.
La Concentración de NaCl,el crecimiento de los halófilos requiere al menos
algo de NaCl, pero el óptimo varía con el microorganismo; en el caso de las
bacterias
estudiadas
(Saccharomyces
serevisiae,
Escherichia
coliy
Staphylococcus aureus)hay mayor crecimiento cuando la concentración de
NaCl es menor (1%) por lo cual se puede decir que son halófilas discretas.
Acción de agentes Desinfectantes y/o Antisépticos, tiene que ver con la
inhibición del crecimiento microbiano; lo cual en la práctica se observó que el
formol tiene mayor efectividad de desinfección y lo opuesto es con el alcohol y
detergente.
Microbiología General
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13. Control Microbiano: Acción de los Agentes Físicos y Químicos
VIII. CUESTIONARIO:
1. ¿Qué diferencia hay en cuanto al uso de la ebullición, la tyndalización
y la pasteurización para el control microbiano?
Ebullición
Tyndalización
Pasteurización
Temperatura
100ºC,
tiempo
variable,
virus
y
toxinas pueden ser
muy resistentes(ej.
Virus de Hepatitis B
requiere 1 h a 100
ºC).
Usos: desinfección
de instrumentos.
Preparación
de
conservas (pH<4.5
o baja aw), capazde
lograr
esterilidad
comercial
de
algunos productos
en
los
que
no
puede crecer el C.
Temperatura
100
LHT
(low
ºC por 30 minutos
temperature holding)
a un periodo de 3
a
días sucesivos.
62.8ºC.
Proceso
HTST
(high
temperature
short
discontinuo
con
períodos
de
30
minutos
a
time) a 15 segundos
incubación
a 71.6ºC
intercalados.
Destruye patógenos
Usos:
(Salmonella,
esterilización
de
Campylobacter,Lister
productos de baja
ia) y reduce flora de
resistencia
deterioro
térmica,
no
cuando
existe
otra
opción.
Usos: lácteos, jugos
de
fruta,
vinos,
cervezas
botulinum
2. ¿Cuál es la relación entre la temperatura y el tiempo sometido para
lograr la muerte de los microorganismos?
Para todos los microorganismos existe una temperatura máxima de
crecimiento por encima de la cual mueren.
A temperaturas altas casi todas las moléculas pierden su estructura y su
función, por el proceso denominado “desnaturalización”.
Microbiología General
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14. Control Microbiano: Acción de los Agentes Físicos y Químicos
El tiempo para que una fracción determinada de estas células muera es
independiente de la concentración inicial.
El tipo de calor también es importante: el calor húmedo tiene mayor
poder de penetración que el calor seco y produce una reproducción más
rápida de organismos vivos a una temperatura determinada.
Según la fig. la muerte por desnaturalización es una función exponencial,
de primer orden, y ocurre más rápidamente cuando mayor es la
temperatura, significa que a cualquier tipo de tasa de muerte es
proporcional a la concentración de microorganismos a ese tiempo.
3. ¿Cuál de los agentes químicos usados logran un efecto bactericida y/o
bacteriostático?
El formol (disolución acuosa al 40 % de aldehído fórmico).
4. Elabore una tabla e indique según el grado de inhibición si fue alto,
medio y/o bajo por parte dela gente químico usado sobre un
determinado microorganismo.
Agente químico
Grado de inhibición
Alcohol
Bajo
Detergente
Bajo
Formol
Alto
Microbiología General
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15. Control Microbiano: Acción de los Agentes Físicos y Químicos
Legía
Medio
Yodo
Medio
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:
MIDIGAN/ PARKERA/ MARTINKO, Broock – Biología de los Microorganismos,
Editorial Mc Graw Hill,10ma Edición, Impreso en España 1998, Capitulo 5, 6 y
24, Páginas:162, 108, 797-809.
http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/morfologiayestructurabacteriana.pdf
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap16.htm
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