Este documento describe diferentes técnicas de tinción selectiva que permiten observar estructuras bacterianas como la pared celular, cápsula, flagelos, esporas y depósitos intracelulares. Explica cómo se pueden teñir estas estructuras para su observación microscópica y algunas aplicaciones clínicas como la detección de esporas de los géneros Clostridium y Bacillus.

1. TEMA 6. RECONOCIMIENTO
DE ESTRUCTURAS
BACTERIANAS MEDIANTE
TINCIONES SELECTIVAS
2°ENFERMERÍA
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
PROF. PATRICIA NARBÓN

2. Tinciones selectivas
• Las tinciones selectivas nos permiten observar estructuras de las
células gracias a su mayor afinidad por los colorantes utilizados
• Se pueden observar estructuras como la pared celular, cápsula,
flagelos, material nuclear, e inclusiones como depósitos de
materiales de reserva de poli-ß-hidroxibutirato, glucógeno y
gránulos metacromáticos.

3. Observación de esporas
• Algunas bacterias son capaces de desarrollar formas de
resistencia denominadas esporas como mecanismo de defensa a
agresiones ambientales. Son estructuras de pared gruesa en las
que el microorganismo logra soportar las condiciones
desfavorables de calor, desecación, acidez, etc. Cuando las
condiciones ambientales vuelven a ser favorables las esporas
"germinan" y vuelven a generarse formas vegetativas.
• Las endosporas son impermeables a los colorantes, por lo que
cuando se hace una tinción, se observan al microscopio como
cuerpos altamente refringentes y sin teñir. Sin embargo, las
endosporas se pueden teñir aplicando calor a la preparación
previamente cubierta con una solución de colorante que en la
técnica de Shaeffer y Fulton es el verde de malaquita. El lavado
con agua elimina este colorante de las células vegetativas y la
aplicación de un colorante de contraste permitirá distinguir
claramente a las esporas de color verde.

4. La detección de esporas debe realizarse en cultivos con
condiciones estresantes para la célula. Suelen utilizarse
cultivos viejos en los que la escasez de nutrientes provoca
la esporulación de las bacterias.
La presencia de esporas en el ámbito clínico nos dirige
hacia los géneros Clostridium y Bacillus. Algunas esporas se
desarrollan sin deformar a la célula vegetativa. Otras si lo
hacen y generan según la disposición formas centrales o
terminales (palillo de tambor). La posición relativa y la
morfología de la espora constituyen caracteres taxonómicos
en las especies de ambos géneros.

5. POSICIÓN DE ENDOSPORAS EN LAS BACTERIAS
terminal subterminal
central

6. Bacillus

7. Observación de cápsula
•Algunas bacterias presentan una capa externa a la
pared denominada cápsula. Está compuesta de
azúcares y proteínas. No es una estructura vital para
la bacteria, de modo que es posible que bajo
determinadas condiciones ambientales o del propio
desarrollo genere cápsula y bajo otras no lo haga. Se
ha comprobado que la presencia de cápsula dificulta
de algún modo la fagocitosis de las bacterias, es decir
las cápsulas constituyen un factor de virulencia de los
microorganismos.

8. • La tinción de cápsula se denomina tinción negativa
porque tiñe el fondo de la preparación y no el
microorganismo. Desde el punto de vista formal no
es una tinción propiamente dicha, porque no fija los
microorganismos. Se parece más a una preparación
en fresco. Su realización consiste en colocar la
muestra húmeda sobre el porta objetos y
mezclarla con tinta china. La tinta cubre toda la
preparación a excepción de las cápsulas. En el
microscopio se observa el fondo negro y los
microorganismos con cápsula sin color.

9. Método de la tinta china para cápsula
• 1.-En el centro de un
portaobjetos se coloca una gota
de agua, otra de tinta china y un
poco del cultivo de una cepa
capsulada. Se mezcla
suavemente sin extender.
• 2.-Se coloca un cubreobjetos
sobre la suspensión y se presiona
suavemente evitando que queden
burbujas.
• 3.-Observar inmediatamente al
microscopio.
• 4.-Desechar la preparación en un
recipiente con antiséptico.
• La cápsula se observa como una
gran estructura alrededor de la
célula delimitada por los
pequeños fragmentos de carbón
de la tinta china.

10. TINCIÓN FLAGELOS
• Los flagelos pueden ser teñidos, pero
debido a su diámetro tan pequeño, se
requieren técnicas especiales.

11. • 1. Hacer un círculo en un portaobjetos perfectamente
limpio para lo cual previamente fue sumergido en mezcla
crómica durante 24 horas, lavado posteriormente con agua
destilada, enjuagado con alcohol y secado con un trozo de
tela limpio. Desengrasarlo pasando por una flama varias
veces.
• 2. Colocar dentro del círculo con pipeta Pasteur, una gotita
de la suspensión bacteriana e inclinar el portaobjetos de
uno y otro lado para extender la muestra.
• 3. Fijar la preparación al aire ya que si esta operación se
hace usando la flama del mechero se pueden destruir los
flagelos.

12. • 4. Humedecer la preparación con el Colorante de Leifson y
dejarla en reposo a temperatura ambiente durante 10
minutos en tiempo caluroso o en la incubadora.
• 5. Lavar con agua corriente.
• 6. Secar y observar con objetivo de inmersión.
• INTERPRETACION:
• · Los flagelos se tiñen bien de color rojo en aquellas
bacterias que no presentan flagelos extremadamente
delicados.

13. Otras técnicas de tinción
• Colorante primario. Para-rosa anilina.
• Mordiente. Acido tánico
• Colorante de contraste. Azul de metileno

14. Vibrio cholerae

15. Proteus sp.