recuento de organismos enterococos
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El documento describe los métodos para el recuento y caracterización de enterococos en alimentos. Incluye una descripción de las características de los enterococos, los medios de cultivo utilizados como S.F. Hajna y Perry y bilis esculina, y los procedimientos para el recuento como la técnica de filtración por membrana y el método del número más probable.
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- 1. Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Laboratorio de Microbiología y toxicología de alimentos Práctica: “ RECUENTO DE ORGANISMOS ENTEROCOCOS”
- 2. - Conocer las características generales de este grupo microbiano. - Describir los fundamentos y la composición de los medios utilizados para el recuento y caracterización de este grupo. - Aplicar la técnica para el recuento de organismos enterococos a partir de alimentos. - Conocer el significado sanitario de la presencia de este grupo microbiano en agua y alimentos.
- 3. • Cocos Gram positivos • En pares o cadenas cortas • Anaerobios facultativos • Fermentan glucosa sin producción de gas • Catalasa negativa • Crecen a 10°C como a 45°C • Crecen en caldo con 6.5% de NaCl y hasta un pH de 9.6 • Toleran hasta un 40% de bilis • Reducen el trifenil tetrazolium (TTC) Streptococcus grupo D de Lancefield En 1984 se realiza su clasificación oficial basada en estudios taxonómicos y de ác. nucleicos. Existen 33 especies.
- 4. La sobrevivencia fuera del intestino es mayor Presentan mayor tiempo de viabilidad en alimentos congelados Son termorresistentes (30 min. 60-65°C) Sobrevivencia durante mas tiempo en medios acuáticos Importancia médica Gastroenteritis Infecciones e vías urinarias Endocarditis Infecciones de piel y tejidos blandos Infecciones intraabdominales
- 5. S.F. Hajna yPerry ( caldo de Estreptococcus faecalis) Medio selectivo para la detección de estreptococos fecales Reactivos g/ L Digerido pancreático de caseína 20.0 Dextrosa 5.0 Fosfato dipotásico 4.0 Fosfato monopotásico 1.5 Azida de sodio 0.5 Cloruro de sodio 5.0 Púrpura de bromocresol 0.032 Reacción positiva: • Turbidez y color amarillo- marrón debido a la fermentación de dextrosa y cambio de color debido al indicador. Reacción negativa: • No hay vire del indicador Enterococcus faecalis ATCC 29212 Crecimiento, reacción ácida (amarillo) Streptococcus bovis ATCC 33317 Crecimiento o ausencia de crecimiento (si hay, ausencia e reacción ácida)
- 6. Azul de metileno azida de sodio Reacción positiva: Enterococcus faecalis Reducción Reacción negativa: Streptococcus pyogenes Sin reducción
- 7. Permite el aislamiento y enumeración de Enterococcus en alimentos, aguas y otros materiales. Ingredientes g/L Peptona 10.0 Extracto de carne 8.0 Glucosa 10.0 Acetato de talio 1.0 Agar 14.0 pH6.05±𝟎. 𝟎𝟓 𝒂 𝟐𝟓°𝑪 Sobre este medio las colonias de Enterococcus crecen de mediano tamaño y muestran una coloración que va de rosada pálido a rosada fuerte.
- 8. Medio selectivo para el aislamiento y recuento de estreptococos fecales (grupo D ) a partir de muestras clínicas. Ingredientes g/L Peptona de caseína 17 Peptona de carne 3 Extracto de levadura 5 Esculina 1 Bilis 10 Cloruro de sodio 5 Citrato de sodio 1 Citrato de hierro y amonio (50/50) 0.5 Azida de sodio 0.2 5 Agar 15 pH 7.1 ±0.2
- 9. Selección de enterococos por filtración de membrana de aguas de consumo humano. Ingredientes g/L Triptona 20 Extracto de levadura 5 Glucosa 2 Fosfato dipotásico 4 Azida de sodio 1.4 TTC 0.1 Agar 12 pH 7.2±0.2 Interpretación: Las colonias rojas, rosas o castañas, elevadas y diminutas se consideran presuntivas de Enterococos. E. coli MKTA 25922. Inhibido Enterococcus faecalis MKTA 29212 Bueno colonias rosas- granates. Se conoce que con el medio agar m-E se obtienen recuentos superiores que por el procedimiento del número más probable.
- 11. Es empleado con solución de TTC al 1% en aislamiento y enumeración de estreptococos fecales. Se recomienda utilizar para recuento de estreptococos en agua. Ingredientes g/L Peptona 10 Extracto de levadura 10 Cloruro de sodio 5 Glicerofosfato de sodio 10 Maltosa 20 Lactosa 1 Azida de sodio 0.4 Púrpura de bromocresol 15 Agar 20 Solución de TTC al 1% Los enterococos aparecerán con colonias rojas o rosas. Enterococcus faecalis ATCC 29212 Colonias con centro rojo o rosa Escherichia coli ATCC 25922 crecimiento inhibido
- 13. Agar bilis esculina Medio utilizado para el aislamiento e identificación presuntiva de estreptococos del grupo D. Ingredientes g/L Extracto de carne 3 Peptona de carne 5 Bilis de buey 40 Esculina 1 Citrato férrico 0.5 Agar 15 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Buen crecimiento con hidrolisis de esculina y colonias oscuras. Streptococcus pyogenes ATCC 19615 crecimiento inhibido.
- 14. Medio rico Ingredientes g/L Infusión cerebro de ternera 200 Infusión corazón vacuno 250 Peptona 10 Cloruro de sodio 5 Glucosa 2 Fofasto disódico 2.5 Agar 15 45°C 24 ±2ℎ𝑟𝑠
- 16. En general la preparación de la suspensión inicial requiere 25g de la muestra en 225mL del medio de pre-enriquecimiento, para obtener una dilución 1:10.
- 17. Se describen 3 técnicas para cuantificar y estimar la presencia de enterococos en agua para consumo humano, agua envasada y hielo, agua de uso recreativo (dulce y salobre). 1) Técnica de filtración por membrana 2) Técnica del NMP 3) Técnica del sustrato cromogénico definido. La técnica de NMP es un método de estimación probabilística de la densidad bacteriana presente en una muestra basada en la dilución de la misma y sembrada en réplicas de tubos con caldo selectivo (caldo azida dextrosa), en los cuales en un periodo de incubación de 24h- 48h a 35°C, se observa la presencia de turbiedad en cada tubo. La prueba confirmativa consiste en sembrar cada tubo positivo, en un medio selectivo para enterococos de Pfizer.
Notas del editor
- Muchas bacterias aerobias y anaerobias facultativas obtienen energía mediante el metabolismo respiratorio característico de las enzimas llamadas citocromos. La azida sódica actúa inhibiendo la transferencia de hidrógeno a través del sistema citocromo, bloquea el hierro de la molécula de citocromo en el estado férrico, e impide así la transferencia final del electrón al oxígeno molecular.5 Aquellos Streptococcus que carecen de la enzima citocromo, son capaces de desarrollarse en medios selectivos para Enterococcus que contienen azida sódica y forman ácidos por fermentación de la glucosa del medio, que provoca la aparición de un color amarillo visible.10 Además, se emplean otros ingredientes como inhibidores dentro de los que se encuentran el Tween 80, carbonatos, citratos y sales biliares.
- El azul de metileno actua como sustrato artificial( indicador de oxido reducción) ya que puede sustituir al aceptor natural de electrones de la cadena de transporte de elctrones donde actuan como reductores del citocromo c del sistema del citocromo oxidasa. La azida de sodio es el inhibidor contenido en la mayoría de estas composiciones. Es un potente bacteriostático, inhibe la transferencia de hidrógeno a través del sistema citocromo e impide la transferencia final del electrón al oxígeno molecular, lo que conduce a la asfixia de las células afectadas
- Proteína peptona y extracto de carne de vacuno sirve como una fuente de nitrógeno y vitaminas. La glucosa sirve como una fuente de carbohidratos. los Medio incorpora acetato de talio como agente inhibidor selectivo (1). El mecanismo de acción del acetato de talio (I) sobre las células microbianas no se ha descrito con exactitud, aunque se conoce que tiene acción bactericida. Debido a su lenta tasa de eliminación, el talio tiende a acumularse en diferentes componentes orgánicos dentro de la célula y como sus propiedades químicas son similares a las del potasio puede competir con él y reemplazarlo, de manera que modifica la activación enzimática de la ATPasa de Na+ /K+ , la piruvato quinasa, la fructosa-1-6-bisfosfatasa y otras proteínas que son dependientes de iones metálicos. Esta sustitución posibilita que el talio se mueva a través del sistema de membrana y se acumule en la célula. El talio provoca la despolarización de la membrana celular y altera la fosforilación oxidativa en diferentes tipos de células. Una vez dentro de la célula, también puede interferir con la estabilidad de los ribosomas y la síntesis de proteínas. Además se han descrito otros mecanismos de toxicidad del talio que incluyen su interferencia con los sitios activos de varias enzimas y su interacción con los grupos amino-sulfhidrilo
- La bilis inhibe el crecimiento de la mayoría de los cocos gram positivos distintos de las especies de streptococos y a una concentracion de 20% inhibe las bacterias anaerobias distintas del grupo b. fragilis asi como la mayoría de los anaerobios faculttivos. La azida de sodio inhibe el crecimiento de las bacterias gram negativas, inhibe los citocromos bacterianos y reduce la actividad de la catalasa. Permite el desarrollo de cocos gram positivos. Dos peptonas suministran losn utrientes , los estreptococos de l grupo d (incluidos los enterococos hidrolizan la esculina para formar esculetina y glucos. La esculetina reacciona con una sal ferrica para formar un complejo marrron oscuro o negro, se incluye el citrato férrico como indicador que reacciona con la esculetina para producr un complejo de marron a negro
- El color rojizo es menos intenso cuanto mas viejo es el medio. Deben confirmarse resembrándolas en agar bilis esculina azida donde crecen con halo tostado-negro, también es diferencial la prueba rapidad del PYR Además, se ha reportado que este medio es superior en el aislamiento, selectividad y enumeración de Enterococcus encontrados en aguas altamente contaminadas.19 Con la adición de carbonato de sodio (0,2 %) y Tween 80 (0,05 %) al agar m-E, se obtienen mejores resultados que con otros medios en la búsqueda directa de Enterococcus.20 El agar Slanetz-Bartley es una modificación del agar m-E, basada en la inclusión del cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio en la formulación, la cual resulta ser superior al anterior en cuanto a la enumeración de Enterococcus.21
- El uso de sales de tetrazolium provee de métodos alternos indirectos para medir actividad respiratoria asociada a una cadena de transporte de electrones. La reducción de una sal de tetrazolium causa la formación de un precipitado insoluble de coloración intensa, conocido con el nombre de formazán. son utilizadas frecuentemente para medir actividad respiratoria asociada a cadenas de transporte de electrones, dada la rapidez con que son reducidas por la mayoría de los sistemas de deshidrogenasas. Estas sales, al reducirse, se precipitan formando un complejo insoluble en agua de color rojo intenso. Podemos extraer el precipitado usando alcoholes La concentración de formazan extraída puede ser determinada por espectrofotometría. El uso de estas sales nos permite estimar la actividad respiratoria ligada a cadenas de tansporte de electrones que operan bajo condiciones aeróbicas (respiración aeróbica) y anaeróbicas (respiración anaeróbica).
- La peptona proporciona una fuente de nitrógeno, aminoácidos y carbón. El extracto de levadura es una fuente de oligoelementos, vitaminas y aminoácidos. Maltosa y lactosa son carbohidratos fermentables Y fuentes de carbono. La azida sódica es un agente selectivo. Bromcresol Púrpura es un colorante indicador.
- Los estreptococos del grupo D crecen rápidamente en el agar bilis esculina e hidrolizan la esculina, que en presencia de iones hierro forman un compuesto de color verde oliva hasta negro. Las sales biliares presentes inhiben el desarrollo de la flora acompañante.
- Es un medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado desarrollo microbiano. La infusión de cerebro de ternera, la infusión de corazón vacuno y la peptona, son la fuente de carbono, nitrógeno, y vitaminas. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el fosfato disódico otorga capacidad buffer. El agar es el agente solidificante.