Este documento presenta el protocolo para realizar pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias. Se detallan los materiales y procedimientos para realizar pruebas como Agar MacConkey, catalasa, oxidasa, SIM, TSI, citrato y RMVP. Los resultados de estas pruebas permiten identificar bacterias como Escherichia coli y Salmonella.

1. qwertyuiopasdfghjklzxcvbnmq
wertyuiopasdfghjklzxcvbnmqw
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
FACULTAD DE INGENIERÍA
ertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwe
E.A.P. INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
rtyuiopasdfghjklzxcvbnmqwert
yuiopasdfghjklzxcvbnmqwerty
uiopasdfghjklzxcvbnmqwertyui
AISLAMIENTO E
opasdfghjklzxcvbnmqwertyuio
IDENTIFICACIÓN BACTERIANA
pasdfghjklzxcvbnmqwertyuiop
asdfghjklzxcvbnmqwertyuiopa
CURSO:
Laboratorio de Microbiología
sdfghjklzxcvbnmqwertyuiopas
dfghjklzxcvbnmqwertyuiopasg
DOCENTE: Mblgo. Carlos Azañero Díaz
dfghjklzxcvbnmqwertyuiopasd
GRUPO:
¨D¨
fghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfg
ALUMNA: Aburto Rodríguez Ruddy
hjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghj
klzxcvbnmqwertyuiopasdlfghjk
lzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklz
Aislamiento E Identificación Bacteriana
Microbiología
0

2. Aislamiento E Identificación Bacteriana
I.
INTRODUCCIÓN
Las bacterias son capaces de modificar el ambiente que los rodea, captando
sustancias necesarias para su multiplicación y liberando al medio, productos de
desecho, enzimas, exotoxinas, etc. Las interacciones que cada tipo bacteriano
establece con el entorno son propias y características, esta especificidad depende
del genotipo de la bacteria y se expresa en un determinado equipo enzimático.
Por ello, la caracterización de dichas enzimas es una útil herramienta para la
identificación y caracterización bacteriana.
Por lo anterior, el examen y conocimiento de características, no solomorfológicas,
sino bioquímicas o fisiológicas, combinadas todas permiten conocer caracteres
fenotipos útiles para la identificación de los microorganismos, y ponen en
evidencia sus características que ayudan a explicar propiedades ecológicas de los
microorganismos en estudio.
La bacteria de pruebas bioquímicas que se empleara serán las clásicas y general de
identificación, en este caso, para enterobacterias (Gram negativos); sin embargo,
actualmente estos métodos están siendo sustituidos por micropruebas en sistemas
semiautomáticos, que permiten una identificación más
rápida y menos laboriosa
imprescindible en grandes laboratorios (sistema API,etc.). También se emplean
otros métodos no bioquímicos basados en técnicas serológicas o en técnicas
biomoleculares (Hibridación de ácidos nucleicos, PCR, etc.).
II.
OBJETIVO
Aplicar e interpretar algunas de las pruebas bioquímicas de identificación y/o
caracterización bacteriana.
Microbiología
1

3. Aislamiento E Identificación Bacteriana
Aplicar la técnica del agotamiento por estrías para la obtención de cultivos
puros y practicar la técnica de transferencia aséptica.
Conocer y ejercitar el uso de diversos tipos de claves diagnósticos para la
determinación de géneros y especies de microorganismos
III. MATERIALES
Material biológico
Cultivo puro de Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella y Klebsiella
Cultivos
bacterianos
de
la
familia
enterobacteriaceae:
bacilos
Gramnegativas, aislados de placas con Agar MacConkey (1 cultivos Lactosa
positivos y 1 cultivos Lactosa negativos).
Material de Laboratorio
Tubos de ensayo con agar TSI, medio SIM
Tubos de ensayo con Agar citrato de Simmons
Tubos de ensayo con caldo común
Tubos de ensayo con caldo RMVP
Prueba de citocromo oxidasa 1
Reactivo de Kovacs
Rojo de metilo (pH 4)
Hidróxido de potasio 0,1M
Alfa naftol
Microbiología
2

4. Aislamiento E Identificación Bacteriana
IV. PROCEDIMIENTO:
1. Colonias Gram:
Colocar cultivos puros (Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella y
Klebsiella)en un tubos por el método de suspensión bacteriana.
Luego coger una asada y esparcirla en el Agar MacConkey.
Colocar las placas Petri a incubar a 37ºC por 12h.
Observar la agrupación de colonias.
2. Catalasa:
Se coloca una asada de cultivos puros de Staphylococcus y Proteus vulgaris
en cada esquina del portajetos.
Se agrega gotas de agua oxigenada y se mezcla.
Se observa si hay presencia de burbujeo.
Microbiología
3

5. Aislamiento E Identificación Bacteriana
3. Prueba oxidasa:
Las tiras de papel que contienen parafinilendiamina se humedecen con
cultivos puros de Escherichia coli y Pseudmonas.
4. Identificación bacteriana:
A cada uno de los cultivos de Entereobacterias realizar la prueba de la
Citocromo c oxidasa. Con un asa de siembre de platino o con un palillo de
madera, entender el cultivo sobre la tira de papel reactiva para el
Citocromo c oxidasa. Observar si aparece una coloración azul (posee
citocromo c, prueba positiva). Esta prueba permite diferenciar el grupo
Enterobacteriaceae (carece de citocromo c) de género Pseudmonas (que
posee citocromo c).
A partir de cada cultivo de bacilos Gramnegativas sembrar en los siguientes
medios diferenciales;medio SIM, agar TSI, agar citrato de Simmons, calcio
común y caldo RMVP.
Incubar todos los medios a 37ºC durante 2hrs.
Añadir los reactivos correspondientes a los cultivos según correspondan.
Anotar los cambios de color en las distintas pruebas. Con ayuda de las
figuras y tablas en anexo identificar las bacterias analizadas.
Microbiología
4

6. Aislamiento E Identificación Bacteriana
V.
RESULTADOS:
1. Agar MacConkey:
Suspensiónde Escherichia coli.
Suspensión 1:
Se observa formación de colonias rosadas
y pequeñas dispersas por todo el agar
MacConkey.
Suspensión de Proteus vulgaris.
Suspensión 2:
Se observa formación de colonias muy
finas amarillentas agrupadas y dispersas
por todo el agar MacConkey.
Microbiología
5

7. Aislamiento E Identificación Bacteriana
Suspensión de E. coli y Proteus vulgaris:
Suspensión 1 y 2:
Se observa formación de colonias rosadas
mezcladas con colonias amarillentas que
crecen juntas por todo el agar MacConkey.
Suspensión deSalmonella:
Suspensión 3:
Se observa formación de colonias
circulares finas amarillentas agrupadas y
dispersas por todo el agar MacConkey.
SuspensiónKlebsiella:
Suspensión 4:
Se observa formación de colonias finas
dispersas por todo el agar MacConkey.
Suspensión de Salmonellay Klebsiella:
Suspensión 3 y 4:
Se observa formación de
coloniasdispersas y combinadas por todo
el agar MacConkey.
Microbiología
6

8. Aislamiento E Identificación Bacteriana
2. Catalasa:
1
2
Muestra de Proteus vulgaris (1)y
Staphylococcus (2):
Se producen burbujeo para ambas
muestras ya que ambas bacterias son
aerobios facultativos.
3. Reacción Oxidasa:
2
1
Muestra de Pseudomonas(1)yE. coli (2):
(1): colorea a azul indofenol ya que la
bacteria tiene citocromoxidasa.
(2): no colorea ya que está en estado
reducido.
4. Identificación bacteriana:
Medio SIM:
Muestra de Escherichia coli:
Precipitadoamarillo, la bacteria no puede
degradar el triptófano y formación de gas.
Difuminación de la bacteria hacia los lados,
crecimiento difuso de la bacteria hacia
ambos lados.
Muestra de Salmonella:
Precipitado negro
Medio de cultivo se queda igual.
La bacteria sólo crece en la línea de
inoculación y formación de un ligero gas.
Microbiología
7

9. Aislamiento E Identificación Bacteriana
Agar TSI:
Muestra de Escherichia coli:
Observamos
la fermentación de la
lactosa, ya que cambio de color a amarillo
y hubo rompimiento del agar por la
producción de gas.
Muestra de Salmonella:
Observamos una coloración fucsia-negra,
glucosa fermentada y producción de H2S
Agar Citrato de Simmons:
Muestra de Escherichia coli:
Obtuvouna Reacción negativa, no se observa
crecimiento y medio de color verde.
Muestra de Salmonella:
Se obtuvo una Reacción positiva,
crecimiento y el medio de color turquesa
en pico de flauta.
Microbiología
8

10. Aislamiento E Identificación Bacteriana
Agar RMPV:
Muestra de Escherichia coli y Salmonella
para VP:
La muestra mantiene su color
amarillento y por lo tanto es una prueba
negativa puesto que el color rojo es
evidencia de acetoína.
Muestra de Escherichia coli y Salmonella
para RM:
La muestra vira a color rojo cereza
evidenciando presencia de acetoína,
prueba positiva.
Caldo común:
Muestra de Escherichia coli:
Observamos que la muestra viró a color
melón y un anillo rosado.
Muestra de Salmonella:
Observamos en la superficie la aparición
de un anillo color amarillo.
Microbiología
9

11. Aislamiento E Identificación Bacteriana
10
VI. DISCUSIÓN:
Agar MacConkey, este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram
negativos de fácil desarrollo, aerobias y anaerobias facultativas. Permite
diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y
alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacterias desarrollan en el
mismo. En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios
para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y
la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los dos agentes que inhiben el
desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentación de la
lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Este produce un viraje del color
del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y las precipitación
de las sales biliares. Los microorganismos no fermentados de lactosa producen
colonias incoloras.
Cuadro 1: fórmula para producir Agar MacConkey.
Cuadro 2: resultados de algunas pruebas de microorganismos cultivados en
Agar MacConkey.
Microbiología

12. Aislamiento E Identificación Bacteriana
11
En la prueba de Catalasa; bacterias anaerobios facultativos son bacterias que
proliferan mediante procesos oxidativos, utilizando oxigeno como aceptor
terminal de electrones, o en anaerobiosis, empleando reacciones de
fermentación para obtener energía. Ej. Streptococcus, E. coli(bacterias utilizadas
en la práctica). La inmediata aparición de burbujas indica la presencia de
catalasa. Las burbujas proceden del O2 generado en la reacción con la catalasa.
En la reacción Oxidasa, las colonias bacterianas que tienen actividad enzimática,
como en este caso, desarrollan un color azul oscuro, esto se debe a la reacción
de la oxidasa que presenta un sistema citocromoxidasa que activa la oxidación
del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o
peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana.El oxígeno actúa por tanto
como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones.un
método en el cual las colonias oxidasa positivas en agar puede detectarse es
sumergiendo la placa en un reactivo, y buscando colonias azuladas o marrones.
La prueba de SIM determina si un organismo es móvil o inmóvil, si es capaz
de liberar ácido sulfhídrico por acción enzimática de los aminoácidos que
contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro y por
último la capacidad de desdoblar el indol de la molécula triptófano, además
que la consistencia del medio permite la observación de la movilidad de
algunas bacterias.
La prueba de TSI determina la capacidad de un organismo de atacar un
hidrato de carbono específico incorporado en un medio de crecimiento
básico, con producción o no de gases, junto con la determinación de posible
Microbiología

13. Aislamiento E Identificación Bacteriana
ácido sulfhídrico. En el agar tres azúcares de Kligler, en las enterobacterias
todas fermentan la glucosa y algunas fermentan la lactosa y sacarosa. El
indicador utilizado es rojo fenol que hace que vire a amarillo en medio ácido
(fermentación). De lo contrario el medio se alcaliniza y el indicador vira al
rojo (se libera NH3 al consumirse las peptonas del medio).Si hay producción
de gas durante la fermentación de cualquiera de los azúcares: Hay formación
de burbujas con quebraduras del fondo del agar. Si se produce sulfuro: Se
observa ennegrecimiento del medio en el fondo o debajo de la superficie del
agar, debido a la formación de FeS.
La fermentación es un proceso metabólicode óxido-reducción que ocurre en
un medio ambiente anaeróbico y en lugar de oxígeno, un sustrato orgánico
sirve como el aceptor final de hidrógeno (electrones). En los sistemas de
prueba bacteriológicos, este proceso se detecta observando cambios en
indicadores de pH a medida que se forman productos ácidos.
La prueba de Citratodetermina si un microorganismo es capaz de utilizar
citrato como única fuente de carbono para el metabolismo y crecimiento,
provocando alcalinidad. Este método es utilizado para determinar habilidad
de las bacterias para producir ácidos estables por fermentación de la glucosa.
La utilización del citrato como única fuente de carbono produce la
alcalinización del medio. Un medio con azul de bromotimol como indicador
de pH. Buscar un color azul intenso (pH alcalino). La utilización de ácido
cítrico, un ácido de seis carbonos que contiene tres grupos ácidos
carboxílicos, se acompaña de una elevación de pH, de tal manera que la
adición al medio de prueba de un colorante específico vira el color cuando se
dan condiciones alcalinas. En la utilización por Salmonella en el agar citrato
de Simmons. El cambio pH provoca un viraje en el color del indicador.
Microbiología
12

14. Aislamiento E Identificación Bacteriana
La prueba de caldo VP-RM determina la capacidad de algunos organismos de
producir un producto final neutro, la acetoína a partir de la fermentación de
glucosa.La reacción de VP se basa en la detección acetoína como producto
final neutro derivado del metabolismo de la glucosa. Ésta es metabolizada en
ácido pirúvico, intermediario clave en la glucólisis. A partir del ácido pirúvico,
una bacteria puede seguir muchas vías. La producción de acetoína (precursor
de la producción de 2,3-butanediol) que es uno de los ciclos para la
degradación de la glucosa en las bacterias. La formación de acetoína y
butilenglicol es una vía alternativa del metabolismo del ácido pirúvico. Las
bacterias que utilizan esta vía producen solo pequeñas cantidades de ácidos
mixtos que son insuficientes para disminuir el pH del medio de rojo de
metilo, lo bastante como para producir un cambio de color. Por este motivo
muchas de las especies de Enterobacterias son VP positivas, con pocas
excepciones son RM negativas y viceversa.
En la prueba del Caldo Común se da la conversión del triptófano de las
proteínas en indol, la detección del indol se realiza en medio de cultivo con
dimetilaminobenzaldehído. Este método empleado para determinar si la
bacteria a través de Triptofanasas puede degradar el Triptófano a indol,
también para la determinar si hay producción de H2S a partir de aminoácidos
azufrados y por último para determinar si la bacteria es móvil.
Microbiología
13

15. Aislamiento E Identificación Bacteriana
14
VII. CONCLUSIÓN:
Agar MacConkey: Los microorganismos no fermentados de lactosa producen
colonias incoloras. La suspensión de Escherichia coli, Klebsiella evidencian
formación de colonias rosadas;mientras que la suspensión deProteus
vulgaris,Salmonella se observa colonias transparentes, finas, amarillentas,
agrupadas y dispersas por todo el agar, lo cual indica que no se fermentó con la
lactosa.
En la prueba de Catalasa ambas bacterias (Proteus vulgaris y Staphylococcus)
burbujean ya que son aerobios facultativos.
En la reacción Oxidasa, las colonias bacterianas que tienen actividad
enzimática, como en este caso, desarrollan un color azul oscuro; esta reacción
fue positiva para la Pseudomonas, con laE. coliresultó negativo.
Mediante la prueba de SIM los organismos móviles migraron de la línea de
siembra y se difunden en el medio provocando turbulencia, es una reacción
positiva, para nuestro caso se trató de la Escherichia coli; un crecimiento
bacteriano acentuado siguiendo la línea de siembra; es una reacción negativa,
tratándose de la Salmonella.
En la prueba de TSI, con la Escherichia coIise evidenció la fermentación de la
lactosa, crecimiento microbiano y producción de gas, ocasionando la ruptura
del agar; con la Salmonella se observó la variación a color guinda, la
fermentación de glucosa y producción de H2S.
En la prueba del Citrato una prueba positiva está representada por la
aparición de un color turquesa en 12 o 24 horas, lo que indica que el
microorganismo en estudio ha utilizado el citrato contenido en el medio con
la producción de productos alcalinos, reacción ocurrida con la Salmonella y
reacción negativa con la Escherichia coli.
Microbiología

16. Aislamiento E Identificación Bacteriana
La prueba de Caldo VP-RM determina la capacidad de algunos organismos de
producir un producto final neutro, la acetoína a partir de la fermentación de
glucosa. Para la prueba de VParrojó negativo en acetoína; pero para la
prueba de RM es positiva porque hay presencia de acetoína y variación de
color traslucido a rosa.
La prueba de Caldo Comúnes positiva cuando hay presencia de indol, puesto
que hay formación de un anillo rojo cereza en la superficie de la muestra;
reacción positiva para el Escherichiacoli y negativa tratándose de la
Salmonella.
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:
MIDIGAN/ PARKERA/ MARTINKO, Broock – Biología de los Microorganismos,
Editorial Mc Graw Hill,10ma Edición, Impreso en España 1998, Capitulo 5, 6 y
24, Páginas:162, 108, 797-809.
http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/morfologiayestructurabacteriana.pdf
http://es.wikipedia.org/wiki/Incubadora
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap16.htm
Microbiología
15