El objetivo del estudio es comprobar el efecto de la eclosión asistida con ácido Tyrode en embriones descongelados. Se estudiaron un total de 1224 parejas sometidas a ciclos de reproducción asistida. Observamos y evaluamos la calidad de los embriones descongelados en relación al número de embriones que sobreviven y el porcentaje de blastómeras lisadas de dichos embriones. Comparamos el porcentaje de embarazos en ciclos de descongelados con y sin eclosión asistida. Aparecen diferencias significativas en el porcentaje de embarazos en el grupo de embriones que han sido sometidos a eclosión asistida (P<0,05), y también observamos una mejor tasa de embarazos en transferencias con embriones de calidad inferior (supervivencia inferior al 60%) cuando son sometidos a eclosión asistida.

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EFECTO DE LA ECLOSIÓN ASISTIDA EN RELACIÓN AL
PORCENTAJE DE GESTACIÓN EN EMBRIONES CRIOPRESERVADOS
Effects of Assisted Hatching on the rates of gestation in cryopreservation embryos.
Mónica Dorado*, Maria Hebles**, Beatriz Migueles*, Mercedes González*; Pascual Sánchez**, Fernando Sánchez**
*Fundación Guadalquivir de Investigación Médica.**Clínica Ginemed, c/Farmacéutico Murillo Herrera, nº 3, 41010, Sevilla, España.
ginemed@ginemed.com
RESUMEN: El objetivo del estudio es comprobar el efecto de la eclosión asistida con ácido Tyrode en embriones
descongelados. Se estudiaron un total de 1224 parejas sometidas a ciclos de reproducción asistida.
Observamos y evaluamos la calidad de los embriones descongelados en relación al número de embriones que
sobreviven y el porcentaje de blastómeras lisadas de dichos embriones. Comparamos el porcentaje de embarazos en
ciclos de descongelados con y sin eclosión asistida. Aparecen diferencias significativas en el porcentaje de
embarazos en el grupo de embriones que han sido sometidos a eclosión asistida (P<0,05), y también observamos
una mejor tasa de embarazos en transferencias con embriones de calidad inferior (supervivencia inferior al 60%)
cuando son sometidos a eclosión asistida.
Palabras clave: eclosión asistida, Tyrode, criopreservación de embriones
SUMMARY: The objetive of this study is to evaluate the impact of embryos assisted hatching with Tyrode’s acid in
thawed embryos. It was studied a total of 1124 couples undergoing infertility treatment. We observed and evaluate
the quality of thawed embryo in relation to the number of that survived, and the rate of blastomeres death. We
compared the rate of pregnancies on thawed embryos cycles with and without assisted hatching. There were some
significant differences between two group, we also detect a better rate pregnancy using assisted hatching when the
survival is badly (surviving rate is less than 60%).
Key words: Assisted hatching, Tyrode, cryopreservation embryos
INTRODUCCIÓN
La baja tasa de implantación del em- mento en el número de embriones ción y embarazo disminuida con res-
brión humano es uno de los factores limi- respecto a un ciclo natural, buscamos pecto a los mismos en fresco (Turcker
tantes para las técnicas de reproducción en parte solucionar el menor poder et al. 1991).
asistida (Bernabeu et al., 2004). implantatorio de los embriones cultiva-
dos in vitro ( Ernest Hung Yu Ng et al. Una de las causas de la disminu-
La estimulación ovárica en los tra- 2005). Habitualmente se transfieren 2 ó ción de la implantación puede ser de-
tamientos de fecundación in vitro 3 embriones, quedando embriones bida al endurecimiento de la zona pe-
(FIV) pretende conseguir un desarro- para congelar según criterios de cali- lúcida (ZP) ( Gabrielsen et al 2004),
llo folicular múltiple para la obtención dad, como número de blastómeras, producido durante el proceso de con-
de varios óvulos y consecuentemente grado de fragmentación y ausencia de
gelación - descongelación. Otra causa
un número mayor de embriones. Esto multinucleación. Los embriones crio-
puede ser la presencia de blastóme-
permite una mayor selección de em- preservados y posteriormente descon-
gelados tienen una tasa de implanta- ros lisados e intactos en un embrión
briones para transferir. Con este au-

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tras la descongelación, este hecho dio. embriones
puede afectar la viabilidad de los in-
tactos y comprometer el desarrollo Realizamos un estudio compara- Todos los embriones excedentes
embrionario (Belil et al 2002). tivo de las tasas de embarazo e im- fueron crioconservados con Freezen
plantación embrionaria obtenidas en kit 1™ (Vitrolife) en pajuelas de 0,5
Ernest Hung Yu Ng et al. 2005 ciclos de embriones congelados y mL (CryoBio System) en un congela-
han planteado la eficacia de la eclo- descongelados de pacientes que han dor manual Nicool MS21 de Air
sión asistida sobre la implantación sido sometidos a hatching frente a Liquide. El congelador fue programa-
embrionaria, especialmente en em- los que no se les ha realizado hat- do para bajar 2ºC/min desde una
briones que han sufrido congela- ching. temperatura de 25ºC hasta -6,9ºC.
ción-descongelación. Estudios in vi- Tras esperar 8 min a esta temperatu-
tro con embriones humanos han Programación del ciclo inicial de ra se realiza el seeding de forma ma-
mostrado que una abertura en la ZP FIV-ICSI nual. A continuación el congelador
mejora significativamente capacidad está programado para bajar
del blastocisto para eclosionar (De Los ciclos de ICSI seleccionados 0,3ºC/min hasta llegar a -29,9ºC
Vos et al. 2000). fueron realizados en protocolo corto cuando la pajuela es depositada en
tras un mes de reposo ovárico con el nitrógeno líquido a -196ºC y alma-
Dos recientes meta-análisis (Edi- anticonceptivos. Para supresión se cenadas en cantaras adecuadas
Osagie et al. 2003 y Sallam HN et al. utilizó análogos de la GnRH (aGnRH, hasta su utilización.
2003) refieren que el hatching asis- Decapeptyl diario®) comenzando en
tido (AH) incrementa el porcentaje el Día 2º del ciclo menstrual a dosis Preparación para las transferencias
de implantación y embarazos, espe- de 1/2 vial al día. Según los niveles en ciclo de congelados
cialmente en mujeres mayores o con séricos de FSH, LH y estradiol, y en
valores aumentados de FSH. Tao y función de la edad de la paciente, se Tras comprobar por ecografías
Tamis 1997 mostraron un aumento fijan las dosis de estimulación ovárica que el endometrio era delgado, el día
significativo en el porcentaje de em- con hormona folículo estimulante 5º del ciclo se comienza con una
barazos con hatching asistido me- (FSH, Gonal-F®) y Menotropina sustitución de estrógenos en parches
diante acido de tyrode en pacientes (Menopur®). (ESTRADOT®) comenzando con
con pobre pronóstico, en mujeres parches de 50 y aumentando en fun-
mayores de 38 años y embriones de La administración de estos se indi- ción de la respuesta a nivel endome-
mala calidad. Cohen et al. 1999 tam- vidualiza de acuerdo al control ecográ- trial hasta obtener una endometrio
bién documentaron un aumento sig- fico del ciclo. El criterio para la admi- que sea anecógeno, en triple línea y
nificativo en ciclos de donación de nistración de la hormona gonadotró- por encima de 7 mm de espesor en-
óvulos. fica humana (10.000 UI de hCG, tre ambas capas. Durante todo el
Lepori®) es la presencia de la mayo- tiempo de tratamiento con estróge-
El objetivo de este estudio es ría de la cohorte de folículos con 16 nos se suplementa con AAS (AAS-
comparar el efecto del hatching o más mm. de diámetro. La adminis- 100®) y se valora el flujo sanguíneo
asistido en la implantación y des- tración de aGnRH y FSH se suspen- al útero. Los ciclos en los que hay un
arrollo de los embriones que han de le día de la administración de la SOPQ la paciente se encuentra en
sido sometidos a procesos de con- hCG. tratamiento con Metformina
gelación - descongelación. (Diamben 850®) con una o dos pas-
Las punciones se realizaron a las tillas al día en función de tolerancia y
MATERIAL Y MÉTODOS 36 horas de la administración de la de forma continua. En el caso de que
hCG por vía vaginal ecoguiada. La en el Doppler que se hace de rutina
Selección de pacientes microinyección se llevó a cabo entre en la arteria uterina el flujo sea dis-
las 3 y 6 horas de la captación ovoci- continuo se añade un tratamiento
Se realizó un estudio observacio- taria. La fecundación se evaluó a las con Pentoxifilina (HEMOVAS 400®)
nal retrospectivo que incluye 1224 16-20 horas y la selección de em-
ciclos de transferencia de embrio- briones a transferir a las 42-44 horas Cuando el endometrio está listo
nes descongelados procedentes de (día 2) o las 66-68 horas (día 3) ca- (mayor de 7 mm en triple línea y
ciclos de ICSI y que fueron conge- talogando los embriones según el anecógeno), se prepara para la
lados en día +1 y/o día +2 en un úni- número de blastómeras, simetría de transferencia de los embriones: se
co centro. Todas las parejas con em- tamaño y la cantidad de fragmentos administran por vía vaginal dos com-
briones congelados fueron informa- citoplásmicos. primidos de progesterona
das para poder participar en el estu- Procedimiento de congelación de (Utrogestan 200mg®) cada 12 horas

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con un total de 800 mg al día. Se co- Procedimiento de AH de Chi-cuadrado.
mienzan a administrar 3 días antes
de la transferencia. El tratamiento Los embriones que iban a ser RESULTADOS
con estradiol y progesterona se man- transferidos fueron colocados en mi-
tiene igual hasta el día de la _-hCG crogotas de 25 µm de Oocyte Wash Los datos del presente trabajo
(dos semanas) y si ésta es positiva se Buffer (Cook) de forma individual fueron obtenidos en el periodo
mantiene hasta la semana 12 de em- bajo aceite mineral de Cook® . Para comprendido entre Abril del 2003 y
barazo. llevar a cabo el procedimiento se uti- Abril 2006. Durante este tiempo se
lizó una placa Falcon 1006 (Becton realizaron un total de 1224 ciclos
Todas las pacientes se suplemen- Dickinson, Dinamarca). de descongelación, de los cuales a
tan con ácido fólico a partir de la 590 ciclos se les practicó el hat-
transferencia de los embriones. La pipeta Holding (20 µm) y la de ching asistido (grupo estudio) y a
hatching (9-10 µm) eran proporcio- 634 ciclos no les fue practicado (gru-
Procedimiento de descongelación nadas por Humagen. El control de sali- po control). Debido al proceso de
da del ácido de Tyrode (Medi-Cult) ha- descongelación 61 ciclos fueron ex-
Se procede a la extracción de las cia la zona pelúcida era llevado a cabo cluidos por la no supervivencia de los
pajuelas de congelación y se elimina con un microinyector (Narishige, embriones entre ambos grupos.
el exceso de nitrógeno de la pajuela. Dinamarca).
Se deja unos 30 segundos a tempe- Nosotros comparamos 1726 em-
ratura ambiente y se pasa al baño térmi- Para la realización del hatching briones a los que se les realizó AH
co a 30ºC otros 30 segundos. Después, se realizó un orificio de 30 µm de en 590 transferencias con el grupo
pasamos los embriones por cada uno de diámetro. Una vez efectuado, el control de 1862 embriones en 634
los medios secuenciales de Thaw-kit embrión se llevó al otro lado de la transferencias a los que no se les re-
1™ (Vitrolife) preparados en placas gota para liberarlo del ácido. A con- alizó. Los embriones no fueron da-
Nunc™ para eliminar el crioprotector. tinuación fue pasado a la placa de ñados durante el procedimiento. La
doble pocillo (Falcon 353037) en edad de las mujeres en el momen-
Una vez terminado el proceso de medio Blastocyst (Cook) para la to de la aspiración de los ovocitos
descongelación se pasan los embrio- posterior transferencia. Se utiliza- fue similar (33,32 frente a 33,17
nes a la placa de cultivo hasta el mo- ron 2 microinyectores Narishige en años). No existen diferencias en el
mento de la transferencia. una placa calefactora a 37ºC en un número previo de ciclos, respuesta
microscopio de contraste de fase ovárica y número de ciclos de des-
El protocolo de descongelación Nikon con óptica de Hoffman. congelados.
se lleva a cabo en función del día en
que se congelaron los embriones: Si Análisis estadístico La media de embriones transfe-
la congelación se hizo en pronúcleos ridos en el grupo estudio y grupo
la descongelación se realiza dos días La comparación estadística fue control fue de 2,92 y 2,93 respecti-
antes de la transferencia y si fue reali- llevada a cabo mediante el test de vamente.
zada en día +2, el día de antes de la Student, test de Chi-Cuadrado y
test de ANOVA. Consideramos que Consideramos embarazo cuan-
descongelación.
do se observa en la ecografía latido
existen diferencias significativas
fetal. Como muestra la tabla I exis-
Una vez descongelados se verifi- cuando se obtienen valores
ten diferencias significativas entre
ca la calidad de los embriones y de P<0,05.
ambos grupos en el porcentaje de
acuerdo con el protocolo se realiza embarazo global 116 (19,66 %) fren-
hatching asistido. La edad media de las pacientes
te a 101 (15,93 %). La tabla II com-
entre el grupo control (grupo al que
para el porcentaje de embarazos en
La transferencia se realiza aproxi- no se realizó el AH) y el grupo estu- relación a la tasa de supervivencia de
madamente una hora después de dio (grupo con AH) fue comparada la cohorte de embriones descongela-
haber realizado el hatching. El nú- utilizando el test de Student. dos.
mero de embriones transferidos va-
ría de 1 a 3 en función de la calidad. El embarazo clínico fue definido En esta tabla también observamos
Todas las transferencias fueron reali- por la presencia de 1 o más sacos un mayor porcentaje de embarazos
zadas con medio G2™ version 3 de de gestación. Para analizar la tasa cuando realizamos hatching en embrio-
Vitrolife y catéter de Gynetics®.
de embarazo entre ambos grupos nes que tienen una tasa de superviven-
se utilizó el test de ANOVA y el test cia menor del 60%, en concreto 20

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Tabla I: Comparación de ciclos con y sin hatching

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(15,38%) frente a 8 (6,35%). es aconsejables la realización del AH, zen embryo transfers of donor oocyte.
pues observamos una diferencia significa- Ferti. Steril 1999; 72:(Suppl 1), S5.
DISCUSION tiva entre ambos grupos, favorables al gru-
po al que se le practicó el AH. De Vos A, Van Steirteghem A. Zona har-
La transferencia de embriones que dening, zona drilling and assisted hat-
han sufrido un proceso de congelación- En conclusión, el AH con ácido de ching: new achievements in assisted
descongelación arroja una tasa de em- Tyrode mejora considerablemente en reproduction. Cells Tissues Organs
barazo menor que con la transferencia embriones descongelados en transferen- 2000; 166:220-227.
de embriones en fresco, incluso tratán- cias en las que no todos los embriones
dose de embriones de igual calidad son de buena calidad. Hemos paliado la Edi-Osagie E, Hooper L, Seif MW. The
(Gabrielsen et al., 2004). mala calidad embrionaria con la aplica- impact of assisted hatching on live
ción del AH consiguiendo las mismas ta- birth rates and outcomes of assisted
Como se ha comentado anteriormen- sas de embarazo que embriones de bue- conception: a systematic review.
te, esto puede ser debido, entre otras na calidad. Human Reprod 2003; 18:1828-35.
causas a una degeneración de blastóme-
ras y a un endurecimiento de la zona pe- En descongelaciones en las que la Gabrielsen A, Agerholm I, Toft B, et al.
lúcida. tasa de supervivencia es menor del 60% Assisted hatching improves implantation
también es recomendada su aplicación rates on cryopreserved-thawed embryos.
Turcker et al. (1991) explicaron que ya que mejora significativamente la tasa A randomized prospective study. Hum
la reducción de implantación en ciclos de de embarazo. Reprod 2004; 19:2258-62.
FIV-ET puede ser debido al endureci-
miento de la zona pelúcida. Para embrio- Cuando la transferencia se lleva a Ng EHY, Naveed F, Lau EYL, Yeung
nes tanto frescos como descongelados el cabo con embriones de buena calidad WSB, et al. A randomized double-
cultivo in vitro puede llevar a un endure- no se observa un incremento en la tasa blind controlled study of the efficacy of
cimiento de la zona pelúcida (Cohen et de embarazo, por lo tanto no está justifi- laser-assisted hatching on implanta-
al., 1990) cada su realización por rutina. La reali- tion and pregnancy rates of frozen-
zación del AH selectivo mejora la tasa de thawed embryo transfer at the cleava-
En nuestro estudio hemos observado gestación respecto a realizarla a todos ge stage. Hum Reprod 2005; 20:979-
que con la transferencia de 2 embriones los embriones. 85.
de calidad a los que se les practicó el hat-
ching obtenemos tasas de embarazo BIBLIOGRAFÍA Sallam HN, Sadek SS, Agameya AF.
equiparables a la transferencia de 3 em- Assisted hatching- a meta-analysis of
briones de calidad; por tanto, podríamos Al-Nuaim LA, Jenkins JM. Assisted hat- randomized controlled trials. J Assist
disminuir el número de embriones a ching in assisted reproduction. Br J Reprod Genet 2003; 20:332-42.
transferir, bajando así la probabilidad de Obstet. Gynaecol. 2002; 109:856-62.
embarazo múltiple. Tao J, Tamis R. Application of assisted
Belil I, Vanrell I, Castelló C, et al. ¿Puede la hatching for 2-day-old frozen-thawed
La tasa global de embarazo entre am- eclosión asistida incrementar el rendi- embryo transfer in a poor-prognosis
bos grupos muestra diferencias significa- miento del ciclo de criotransferencia? population. J Assist Reprod Genet
tivas cuando realizamos el AH. Comunicación oral XXIV Congreso 1997; 14,128-30.
Observamos que hay una tendencia a Nacional SEF 2002; 257.
una tasa de embarazo mayor tras la Turcker MJ, Cohen J, Massey JB, Mayer,
transferencia de embriones a los que se Bernabeu R, Brotons A, Mendiola J, et Wiker S, Wright G. Partial zona dissec-
les practicó el AH cuando no todos los al. Estado actual del conocimiento de tion of zona pellucida of frozen thawed
embriones son de buena calidad, con lo la implantación embrionaria humana. human embryo may enhance blas-
cual estaría justificada su realización. RIF 2004; 21:167-73. tocyt hatching, implantation, and
pregnancy rate. Am J Obstet Gynecol
Gabrielsen et al. (2004) obtienen Cohen J, Elsner C, Kort H, et al. 1991; 165,341-45.
unos resultados que apoyan nuestro es- Impairment of the hatching process
tudio. A pesar de ello, Al-Nuaim y Jenkins following IVF in the human and impro-
(2002) concluyeron que es inapropiada vement of implantation by assisting hat-
la realización por rutina por no existir evi- ching using micromanuipulation.
dencias del beneficio en embriones de Human Reprod 1990; 5:7-13.
buena calidad.
Cohen MA, Lindheim SR, Sauer MV.
Cuando la tasa de supervivencia de los Assisted hatching causes beneficial af-
embriones descongelados es baja (<60%) fects on the outcome of subsequent fro-