Este documento describe técnicas de identificación de resistencia bacteriana, incluyendo el antibiograma, que utiliza discos impregnados con antibióticos para determinar la sensibilidad de un microorganismo. Explica cómo preparar el inóculo bacteriano, colocar los discos, incubar y medir las zonas de inhibición para interpretar los resultados. También cubre técnicas de dilución como la macrodilución y microdilución para determinar la concentración mínima inhibitoria de un antibiótico.

1. TECNICAS DE
IDENTIFICACIÓN
DE RESISTENCIA
BACTERIANA

2. • Otras tecnicas de identificacion bacteriana
• 7.1. Antibiograma
• 7.1.1. Macrodilucion
• 7.1.1.1. Tecnica, aplicacion e interpretacion
• 7.1.2. Microdilucion
• 7.1.2.1. Tecnica, aplicacion e interpretacionL
• -TECNICA EN AGAR

3. • Sólo sobremicroorganismosasociadosainfecciones
cuandosusensibilidad nose puedapredecir.
• Pertenezca aunaespecie capazdeexhibirresistencia a
losantibióticos.
• Microorganismosqueposeansensibilidadantibiótica
predecibleserecomiendaaplicacióndeterapia
empíricaadecuada.
INDICACIONES

4. • Sedebepartirdeuncultivoprimariocolonias
aisladasdecadatipodemicroorganismoexcepto
paraemergenciassedebeinformarcomo
resultadopreliminarysedeberepetirutilizando
lametodologíaestandarizada.
• No realizarenfloranormalo polimicrobianalos
microorganismosaisladosprobablemente
tenganpocarelaciónconelprocesoinfeccioso.
GENERALIDADES Errores en tratamiento

5. ANTIBIOGRAMA

6. Tiras impregnadas de antibiótico en
concentraciones decrecientes
Halos con discos
E-TEST
DIFUSIÓN EN
AGAR/DISCO
(KIRBY BAUER)
TÉCNICA DE
DIFUSIÓN

7. Esempleadoparadeterminarlasensibilidaddeun agentemicrobianofrenteaunantibiótico.Mediante
discosimpregnadosdeantibióticoenconcentracionesestablecidasycoloniasaisladas.
DIFUSIÓN EN AGAR/DISCO
(KIRBY BAUER)

8. MATERIALES

9. • Selección de colonias apropiadas se recomienda de 3–5
colonias en cultivo aislado y de menos de 24 hrs.
• En ambos métodos, la turbidez de la suspensión debe ser
estandarizada al 0,5 de McFarland (aproximadamente 1,5 X
10 8 CFU/ml)
• Inóculo debe utilizarse dentro de los 15 minutos siguientes
PREPARACIÓN DEL INÓCULO
Suspensión
directa de
colonias
Fase
logarítmica de
crecimiento

10. • Las colonias no deben sobrepasar las 18–24 horas de aislamiento
• Suspenda las colonias en solución salina o caldo (eje. Mueller-
Hinton o soya tríptica)
• Ajuste el inóculo a una turbidez equivalente al estándar 0,5 de
McFarland.
• INDICACIÓNES :
• • Todos los estafilococos • Bacterias fastidiosas que tienen
crecimiento impredecible en caldo: eje., estreptococos
METODO DE SUSPENSIÓN DIRECTA

11. • Organismosquecrecenrápidamenteexcepto
estafilococos
• Se inoculalascoloniasencaldo,incubea
35ºC paralograruncrecimientoenfase
logarítmicaaocurredespuésde2–8horasde
incubación.
• Ajuste laturbidezparaqueseaigualal
estándar 0,5deMcFarland
MÉTODO DE FASE LOGARÍTMICA DE
CRECIMIENTO

12. A¿Quéharíasilasuspensióndeorganismosesdemasiadoturbia?
B ¿Quéharíasilasuspensiónesdemasiadoclaraparalasuspensióndirectadecolonias?
C¿Quéharíasilasuspensiónesdemasiadoclaraparaelmétododefaselogarítmica?
A.Añadamáscaldoosoluciónsalinaparaigualarla
turbideza0,5delestándar deMcFarland.
B. Tome máscoloniasysuspéndalasenel caldo.
C. Reincube lasuspensión.

13. • Retire el contenedor de discos del congelador, atemperar
(humedad alterar concentración)
• Atemperar Agar MH y checar profundidad (adecuada
4mm)
• Agite la suspensión del organismo ,sumerja un hisopo
de algodón estéril. Remueva el exceso de líquido del
hisopo presionándolo contra la pared del tubo.
• Empezando en la parte superior de la placa MHA
inocule la superficie con el hisopo. Cubra toda la placa
frotando de ida y vuelta de un borde al otro. Rote la
placa aproximadamente 60º y repita 3 veces ,
distribuyendo homogéneamente.
INOCULACIÓN DE LA PLACA 60°-40°

14. • Incube la placa dentro de los 15 minutos siguientes después de haber
estandarizado el inóculo.
• Coloque los discos con dispensador de multicanal , hasta 10 en placa de
150mm o 5 en una de 100mm
• Presione cada disco firmemente para asegurar el contacto completo con
la superficie de agar
COLOCACIÓN DE ANTIMICROBIANOS

15. • Nousediscosdespués desufechade
caducidad.
• UseproductosaprobadosporlaFDA.
• Usediscosconel contenidoespecificadoenlos
estándares deNCCLS.
• Noreubiqueundiscounavezqueéste ha
tocadolasuperficiedelagar.
Puntos que hay que recordar sobre los discos de
antimicrobianos

16. • Invierta las placas e incúbelas .
• Para las bacterias no fastidiosas, incube (en aire ambiente) a 35°C por 16–18 horas.
• Para la prueba de difusión por disco de bacterias fastidiosas, use las condiciones de incubación
recomendadas por el NCCLS, como se muestra en el siguiente cuadro
Cómo Incubar la Placa

17. • Verificar que el crecimiento sea uniforme y confluente
de tal modo que pueda identificar zonas sin crecimiento
bacteriano.
INTERPRETACIÓN

18. • Medir las zonas de inhibición desde la parte posterior
de la placa usando luz reflejada
• Sostenga la placa unos pocos centímetros sobre una
superficie de color negro que no refleje la luz.
• Mida redondeando al milímetro más cercano con una
regla o un calibrador.
• La luz reflejada es usada para enterobacterias, otros
bacilos gram negativos, estafilococos y enterococos
(excepto para oxacilina y vancomicina).
• Para Agar sangre retire la tapa y mida las zonas desde la
parte superior de la placa.
• Use luz transmitida en: •Estafilococos con oxacilina
•Enterococos con vancomicina

19. • Doble zona: Mida la zona más interna.
• Colonias dentro de la zona: Esto puede deberse ya sea a un cultivo mixto o una
subpoblación resistente de la bacteria analizada
Zonas inusuales.
Mida el punto en el cual se puede ver una demarcación
obvia entre crecimiento y ausencia de crecimiento.
Evite esforzarse para ver las colonias más diminutas.

21. • Mida la zona que es obvia. Ignore el brote aún si este cubre la zona de inhibición.
Proteus mirabilis

22. • Tambiénsulfonamidas/trimetoprimasolo
• Podríanserdifíciles deleerporqueesteagentepodríano
inhibirelcrecimientodelasbacteriashastaquelasbacterias
hayanpasadoporvariasgeneraciones decrecimiento.Se
podríaobservarunligerocrecimientoopacodentrodelazona.
• Midalazonaenelpunto enquehayaunareducción
del80%enelcrecimiento.
Trimetoprima-Sulfamethoxazole (SXT)

23. • Aproximadamente de 24-48hrs
Reporte

24. PRUEBAS DE
SENSIBILIDAD
MICROBIANA POR
DILUCIÓN
• MACRODILUCION
• MICRODILUCION

25. TÉCNICAS DE
DILUCIÓN
DILUCION EN CALDO
MEDIO LIQUIDO
DILUCIÓN EN AGAR
MEDIO SOLIDO
MEDIO MUELLER
HINTON
CMI; Concentración mínima
inhibitoria , es la mínima cantidad
de antibiótico capaz de inhibir el
crecimiento bacteriano en
condiciones estandarizadas

26. Dilución en
caldo
MACRODILUCIONES
Volumen final 2ml
MIC (CONCENTRACION
MINIMA MICRODILUCIONES
Volumen final 100µcl
Dilución en caldo

27. • GOLD STANDART para microorganismos no caprichosos
• Mide cuantitativamente la actividad "in vitro" de un antimicrobiano frente a un cultivo bacteriano, a
los cuales se les agrega el antibiótico en distintas concentraciones
• se inoculan cada uno de los tubos o placas con una suspensión estandarizada del microorganismo en
estudio. después de incubar “overnight” a 35 ± 2ºC y se determina la concentración inhibitoria
mínima
• Diseñadas para bacterias aeróbicas o facultativas de fácil desarrollo después de incubación overnight
en medio M. Hinton sin suplementos
GENERALIDADES

28. • Sólo sobremicroorganismosasociadosainfeccionescuando su
sensibilidadnosepuedapredecirapartirdesuidentificación
• OrientaalclínicosobrequeCONCENTRACIÓNDEANTIBIÓTICOnecesita
alcanzarenelsitiodeinfecciónparainhibirelmicroorganismo
infectante.
• LaCIM,sinembargo,norepresentaunvalorabsoluto.
• Laspruebasdesensibilidadtambiénsonimportantesenestudiosde
epidemiogíadelaresistenciaynuevosagentesantimicrobianos
INDICACIONES

31. Grupo Características
A Seconsideranapropiados para ensayareinformarenlaspruebasderutina
B Deimportancia para infeccioneshospitalarias, sedeberánincluirenelpanelprimario, enresistenciasalgrupo A,
cuandoelfocode infecciónlojustifique, eninfeccionespolimicrobianas.Omúltiplessitios delorganismo ,alergia,
intolerancia.
C Agentesantimicrobianos alternativos osuplementarios, eninstitucionesdondeseaíslencepas
endémicas/epidémicasresistentesavarias delasdrogasprimarias, inusuales.
U Suuso selimitaalasinfeccionesdeltracto urinario
O Antibióticos queposeenindicaciónclínicapara ungrupo deorganismos determinado,peroengeneralnoson
candidatos para laspruebasderutina
Inv Agentesqueestánbajo investigación yaúnnohansido aprobados porlaFDA.
ESPECIAL Cadalaboratorio deberíaelegirlosagenteslistados
Elección de antibiótico: CLASIFICACIÓN

32. • Seleccióndelosagentesantimicrobianosapropiadospara
lapruebadedifusión,esunadecisióndecadalaboratorio
clínico
• EndocumentoM100, enumeranlosagentesdeeficacia
clínicaprobadaparaeltratamientodeinfecciones
producidaspordistintostiposdemicroorganismos.
(resultadosaceptablesenlaspruebasinvitro)
ELECCIÓN DEL ANTIBIOTICO

35. • Recomendaciones de los antibióticos a ensayar e
informar frente a cada grupo de microorganismos
considerados apropiados en la actualidad
• Se podrán incluir o retirar antibióticos de esta lista
de drogas a ensayar e informar de acuerdo a
necesidades particulares.
• Todos los antibióticos deberán ser referidos por su
nombre genérico

36. Calculo de potencia

37. • Metodología más común utiliza diluciones seriadas al medio
• Existen otras metodologías aunque pueden ser igualmente útiles en la clínica. a veces son más difíciles
de controlar
• Redondear el valor a la próxima superior dilución al medio del esquema normal (por Ej. Una CIM de
6 µg/ml se debe redondear a 8 µg/ml y luego interpretar).
METODOLOGIA

38. Demostró ser el mejor ;
• Muestra buena reproducibilidad de los resultados de sensibilidad entre distintos lotes.
• Tiene baja cantidad de inhibidores para sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclinas.
• Permite buen crecimiento de la mayoría de los patógenos.
• Se tiene gran cantidad de datos y experiencia sobre pruebas de sensibilidad realizadas con este medio.
Agar Mueller Hinton
Los suplementos requeridos por estos microorganismos se describen mas adelante en este documento :
• Agar MH con 5 % de sangre de carnero fresca.
• Agar MH con 5 % de sangre de carnero no fresca (> 2 semanas) para H. pylori
• HTM: Haemophilus Test Medium.
• Agar GC + 1 % de suplemento de crecimiento

39. • Ejemplo Meropenem trihidratado
• Pureza 99%
• Contenido de agua 12.1%
• Fracción activa 100%
• Potencia calculada de acuerdo a los datos obtenidos
• Potencia =(Pureza)(Fracción activa) (1-conenido de agua)
• Potencia (998)(1.0)(1-0.121)
• Potencia 877
Preparación del Stock

40. REPLICADORES

41. • Macrodilucion1ml
• 2tubos extra1control(solocaldo)yotro controldeesterilidad
• Inoculoseajustaraa0.5delaescaladeMcFarlandenunnefelómetro oespectrofotómetro,aisladono
microbianonomayora24hrs contiene,paralamayoríadelasespecies,aproximadamente1-2108
UFC/ml.
• Diluido1:50concargade1x10ala6UFC/mL
• 1mililitrodeesteacadatubo conlasdilucionescorrespondientes yelcontrol sininoculo
MACRODILUCION

43. • Estemétodosedenominamicrodiluciónporqueinvolucrapequeños
volúmenesdecaldo
• SEREALIZAAJUSTEDEINOCULO
• DILUCION1:20
• CARGABACTERIANA5X10ALA6UFC/ML+10MICROLITROSDEINOCULO
DILUIDOdebehacersedentrodelos15minutosdepreparadalamisma
• Lapruebaserealizaenpolicubetasdeplásticoestériles defondocónicoo
redondo,cadapocillodebecontener0,1mldecaldo
MICRODILUCIÓN

44. • Las concentraciones a ensayar para un determinado antibiótico, en general, deberían determinarse de
acuerdo a los puntos de corte que se enumeran en la Tabla M-100
• pero el número de concentraciones deberá ser elegido por quien realiza la prueba
Concentraciones de antibiótico
En algunos casos especiales puede ser necesario ensayar concentraciones inusuales (por Ej. para evaluar el efecto sinérgico entre
aminoglucósidos y penicilinas o glicopéptidos frente a enterococo puede ser necesario ensayar altas concentraciones de gentamicina
y estreptomicina

45. Cantidad de polvo antimicrobiano

46. • Mayoríadelosmicroorganismosesde16a20hs,tantoparalatécnicade
macrocomodemicrodiluciónylatemperaturaes35±2°C
• FASIDIOSASVERCONSIDERACIONDESDECLSI
• Eltiempodeincubaciónpuedediferir paramicroorganismosfastidiosos
,sedebeseguirlasinstruccionesespecíficas
• CERRARPLACASCONFILMPARAEVITARSECADO
INCUBACION Y LECTURA

47. • Valor de CIM o el halo de inhibición utilizados para indicar sensible, intermedio y resistente
• La CIM real puede estar entre la menor concentración de antibiótico que inhibe al microorganismo y
la siguiente donde se observa desarrollo del mismo. Si por ejemplo, fueran probadas diluciones al
medio y se determina una CIM de 16 µg/ml, el verdadero valor podría estar entre 16 y 8 µg/ml
INTERPRETACIÓN

48. • A pesar de realizar las pruebas de dilución bajo condiciones
cuidadosamente controladas, no siempre se obtienen los
mismos resultados
• Reproducibilidad; +/- 1
• Redondear el valor a la dilución superior PROXIMA (por Ej.
Una CIM de 6 µg/ml se debe redondear a 8 µg/ml y luego
interpretar).
• El valor debe ser acompañado por su correspondiente
interpretación (por Ej. SENSIBLE, INTERMEDIO o
RESISTENTE

49. • LECTURAVISUAL ENDONDENOSE OBSERVETURBIDEZ SETOMARA COMOMINIMAINHIBITORIA
• Sepuedeutilizarundispositivolectorquepuedadiscernirentredesarrolloyausenciadelmismo
• Debecompararsecadatuboconcontroldecrecimientooturbidezneta.
• CuandoenunapruebademicrodiluciónseobtieneunPOCILLOSALTEADO, sedebeleerlaCIMMÁS
ALTA.Siaparecieramásdeunpocillosalteadoconalgunadroga,estaNOSE DEBERÍAINFORMAR
• Parabacilosgram(-) lasCIMsobtenidasporelmicrométodotiendenaserlasmismasóunadilución
menoralasobtenidasporelmacrométodo.
LECTURA

50. Interpretación
Control de
crecimiento
Control de esterilidad

51. PARA DETERMINAR SI ES UN AISLADO SENSIBLE O RESISTENTE DEPENDE DE :
• La guía internacional empleada (CLSI o EUCAST)
• El grupo microbiano que se pruebe
• El antibiótico usado
Por ejemplo , si se analiza resistencia a ciprofloxacino en Salmonella ; según CLSI se observa:
Se considera :
SENSIBLE; si mi CIM fue menor a 0.6
INTERMEDIO; CIM 0.12-0.5
RESISTENTE; CIM Mayor a 1

53. • .Losresultadosobtenidosconunadrogaenparticularpertenecienteaunafamiliade
antibióticossiguelaREGLAJERÁRQUICADEACTIVIDAD(Ej.:unacefalosporinadetercera
generaciónesmásactivaqueunadeprimeradesegunda frenteaenterobacterias).
• Frentearesultadosinusualessedebeverificar:
a) Resultados previosdelpaciente(Ej.:tuvoelpacienteunaislamientoanteriorconelmismo
perfilinusualderesistencia?
b) Resultados previosdelcontroldecalidad(Hayunatendenciasimilarconelcontrolde
calidadreciente?).
c) Problemasconlosinsumos,procesosoequipos
PUNTOS A CONSIDERAR

54. • H. influenzae yH.parainfluenzae, usandoHTM(solo diluciónencaldo);
• N. gonorrhoeae, usandoGCagarbase medo;
• Streptococci, usandoCAMHB suplementado consangrelisadade caballo(LHB);
• N. meningitidis,usandoCAMHB suplementado consangrelisadade caballo
(LHB)oMHAconsangreovina.
MICROORGANISMOS CON EXIGENCIAS
NUTRICIONALES ESPECIALES

55. EN AGAR
VIABILIDAD (AGARSINANTIBIÓTICO)Y
ALASDISTINTASCONCENTRACIONES
DELANTIBIÓTICOCOMENZANDOPOR
LADEMENORCONCENTRACIÓN.EL
AGENTEANTIMICROBIANOES
INCORPORADOENELMEDIOAGAR
MUELLER-HINTON
CONTROLDELOSINÓCULOSPUEDEN
SERAPLICADOSRÁPIDAY
SIMULTÁNEAMENTEALASSUPERFI
CIESDEAGARUTILIZANDOUN
APARATODEREPLICACIÓNDEL
INÓCULO(REPLICADORES
TRANSFIERENDE32A36INÓCULOSA
CADAPLACA).
LUEGOSEDEBENINCUBAR
INVERTIDASA35±2ºCPOR
ELTÉRMINO16-20HS.
REGISTRARÁCOMOELVALORDELA
MENORDILUCIÓNQUEINHIBE
COMPLETAMENTEELDESARROLLO
BACTERIANO.
LACIMSE SUSDESVENTAJASINCLUYENELTRABAJOREQUERIDO
PARAPREPARARLASPLACASDEDILUCIÓNENAGARYSU
RELATIVAMENTECORTOTIEMPODEALMACENAMIENTO.
GENERALMENTELASPRUEBASDEDILUCIÓNENAGARNOSE
REALIZANENLABORATORIOSCLÍNICOSDERUTINAPEROPUEDEN
SERIDEALESPARALABORATORIOSREGIONALESDEREFERENCIAO
LABORATORIOSDEINVESTIGACIÓNQUEDEBENANALIZARUN GRAN
NÚMERODECEPAS.

56. GRACIAS