Mecanismos genéticos de Resistencia a Virus
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- El documento describe varios mecanismos genéticos de resistencia a enfermedades virales como la mutación Δ32 en el gen CCR5 que confiere resistencia al VIH, y defectos en la glicosilación asociados con resistencia a infecciones virales. - Un estudio encontró que personas con actividad sexual de alto riesgo podían resistir la infección por VIH debido a poseer el genotipo CCR5 Δ32/wt combinado con otros polimorfismos que disminuyen la expresión de CCR5. - Un caso exit
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- 1. MECANISMOS GENÉTICOS DE RESITENCIA A ENFERMEDADES VIRALES QBP. JORGE HERNÁNDEZ BELLO QFB. SERGIO YAIR RODRIGUEZ PRECIADO
- 2. Principios y aplicaciones de la genética directa y la genética Inversa Beutler B., et al. 2007
- 3. Principios y aplicaciones de la genética directa y la genética Inversa Beutler B., et al. 2007
- 4. La aniquilación del receptor de quimiocina CC 5 humano de una protección contra el VIH Beutler B., et al. 2007 Receptor Ly49H CMVC MyD88 TLRs Virus de Herpes
- 5. TLRs y el reconocimiento viral Kurt-Jones, E. A. et al. 2000
- 6. Sensores citoplasmaticos y vía de señalización Beutler B., et al. 2010
- 7. Funciones centrales de las células NK y de las células detríticas En defensa contra MCMV Arase, H., et al. 2012
- 8. Presentación esquemática de las defensas antivirales en Drosophila melanogaster. Dostert, C. et al. 2005 Lee, Y. S. et al. 2005
- 9. Modelo de representación de la regulación de la resistencia antiviral intrínseca a la infección por HSV-1 mediada por la vía de la conjugación de SUMO Boutell C., et al. 2011
- 10. Estructura y función de las proteínas APOBEC Valdimara C., et al. 2013
- 11. Mecanismo de acción de APOBEC3 (A3) y Vif en el Valdimara C., et al. 2013 ciclo de vida del VIH.
- 12. RESISTENCIA A INFECCIONES VIRALES GLICOSILACIÓN • Proteínas Inmunoglobulinas Receptores de virus Proteínas virales RCONH OH Mohammed A et al., 2014. N ENGL J MED 370;17
- 13. GLICOSILACIÓN • Defectos congénitos de la glicosilación (CDG): son trastornos genéticos que afectan el proceso de N-glicosilación. CDG SÍNTESIS (CDG-I) PROCESAMIENTO (CDG-II) CDG-IIb AR • gen MOGS (Glucosidasa 1) • RE (Corte N-Glyc) • Muerte temprana Mohammed A et al., 2014. N ENGL J MED 370;17
- 14. • 2 casos con CDG-IIb que presentaban hipogammaglobulinemia grave, pero no muchas infecciones. Objetivo: Evaluar el sistema inmune y susceptibilidad a infecciones virales Mohammed A et al., 2014. N ENGL J MED 370;17
- 15. Datos de los pacientes • 1: Niño 11 años (1°) • 2: Niña seis años (3°) Pareja no consanguínea Clínica: Rasgos faciales dismórficos, hipotonía generalizada, retraso en el desarrollo global, recurrentes fracturas óseas; hipogammaglobulinemia grave. Paciente 1: Dos infecciones invasoras: 1. Neumonía neumocócica (sin vacunación) a los 9 años. 2. Osteomielitis por S. aureus después de osteosíntesis quirúrgica a la edad de 10 años. Paciente 2: 1. Dos episodios de otitis media (4 y 5 años) 2. Infección del tracto urinario (6 años) Mohammed A et al., 2014. N ENGL J MED 370;17
- 16. Manosa Gluc Gal N-AcMur N-AcGlc Lisados de proteínas «LB» Expresión de Manosil-oligosacárido glucosidasa (MOGS) y estudios de inmunoglobulinas en 2 hermanos con desórdenes congenitos de la glucosilación tipo b. Proteína de unión a inmunoglobulina (BIP) «chaperona»
- 17. Mohammed A et al., 2014. N ENGL J MED 370;17 • LB • S.Aurus Cowan • Oligonucleótido CpG
- 18. Mohammed A et al., 2014. N ENGL J MED 370;17 Anticuerpos vs infecciones bacterianas
- 19. Mohammed A et al., 2014. N ENGL J MED 370;17 No reactividad para virus
- 21. ELI6 Estudios de susceptibilidad viral Mohammed A et al., 2014. N ENGL J MED 370;17 • Cultivo en mononucleares • qPCR • Sobrenadante • ELISA • Virus de pacientes • Donadores sanos
- 22. MDM: MQ derivados de monocitos HA: Hemaglutinación TCID50: Dosis infecciosa de cultivo de tejidos 50% MDCK: células Madin-Darby de riñón canino CPE: Efecto citopático Mohammed A et al., 2014. N ENGL J MED 370;17 Lisados de fibroblastos primarios transfectados Infectividad Paciente 2 MOGS-VS: Manosil-oligosacárido glucosidasa Péptido-N-glicosidasa F (PNGasaF) Cs: Inhibidor de MOGs Virus
- 23. Estudios de susceptibilidad viral No hubo diferencias Mohammed A et al., 2014. N ENGL J MED 370;17
- 24. Conclusión • Se encontró asociación con una deficiencia de MOGS y un defecto en la N-glicosilación que lleva a resistencia contra infecciones virales. • La glicosilación defectuosa conlleva además a atenuación de los virus al infectar las células de los pacientes con defectos congénitos de la glucosilación.
- 25. CCR5 Y SUCEPTIBILIDAD A HIV Mutación Δ32 en CCR5 (32 ntds) Gero Hütter et al., New England Journal of Medicine. 2009; 360:692-8.
- 26. 93 individuos HIV-1 seronegativos (SE) sanos ≥18 años de edad que reportaron actividad sexual de alto riesgo con parejas infectadas por el HIV-1 Criterios de inclusión • Relaciones sexuales sin protección con una persona infectada con HIV-1 ≥ 6 veces en los últimos 6 meses o un promedio de 2/semana ≥ 4 meses (2 años antes inscripción). Florian H et al., Journal of virology, Sept. 2005. • Criterios de exclusión: • Positivos a HIV CONTROL: 247 individuos HIV-1 seronegativos ≥18 años de informes de actividades sexuales de bajo riesgo para el HIV-1.
- 27. METODOLOGÍA • Genotipificación PCR-FRLP: CCR5 Δ32, CCR5 2459G y CCR2 ORF 64I • Análisis de Citometría de flujo de CCR5 y CXCR4.
- 28. Frecuencias alélicas ORF= Marco de lectura abierto
- 30. Evaluación de la expresión de CCR5 por genotipo
- 31. Correlación entre densidad de CCR5 en superficie de Células T y monocitos
- 32. Sobrenadante de cultivos de fibroblastos infectados de pacientes con bajo riesgo de infección
- 33. Conclusión • Personas que practican conductas sexuales de alto riesgo pueden resistir a la infección debido a que poseen el genotipo CCR5 Δ32/wt mas una combinación con el genotipo -2459 A/G, que se asocia con relativamente débil expresión de CCR5. • Un único alelo Δ32 puede ejercer un efecto protector contra la transmisión viral sólo si se encuentra con el alelo -2459G en la región promotora de CCR5. • A pesar de las evidencia de estos genotipos protectores, la mayoría de los individuos ES no lo porta, por lo que mecanismos adicionales de resistencia, deben ser considerados.
- 34. Trasplante alogénico de células madre en un paciente con VIH y leucemia mieloide aguda, utilizando un trasplante de Células madre CD34+ de sangre periférica de un donante homocigoto para el polimorfismo Δ32 de CCR5 Gero Hütter et al., 2009
- 35. Genotipificación para alelos de CCR5 Fragmentos de PCR; Trasplante de células madre
- 36. Respuesta celular y humoral a HIV-1 INMUNOSPOT «INF-γ» + Mas de 20 spots INMUNOBLOT 1= control HIV + 2= paciente 7 días antes del SCT 3= paciente 625 días después de SCT 4= control negativo Ab Polimerasa y cápside
- 37. CURSO CLÍNICO Y VIREMIA DEL HIV HAART= Terapia antiretroviral; AML: Leucemia Mieloide Aguda Días antes/después de SCT
- 38. ATG=Globulina antitimocito; Cs= ciclosporina; Cx= Quimioterapia; MMF; Micofenolato
- 40. CONCLUSIÓN • Los homocigotos para Δ32 en CCR5 ofrece una resistencia natural a la adquisición del VIH. • El trasplante de células madre alogénicas de un individuo homocigoto para el alelo CCR5 Δ32 es una terapia exitosa para pacientes con VIH. • Los resultados ponen de manifiesto el papel central del receptor CCR5 durante infección VIH-1 y la progresión de la enfermedad.
Notas del editor
- Recientemente, los análisis genéticos directos e inversos han ayudado a conocer cómo el huesped actua ante una infección viral para contrarrestarlo. Teniendio como herramienta principal de investigación la genética inversa es la hipótesis, mientras que la principal herramienta de investigación en genética directa es el fenotipo. En la genetica inversa prueban hipótesis mediante la observación del efecto de la modificación génica dirigida (por lo general knockout). En la genética directa buscan para encontrar el cambio molecular que causa fenotipos, complementandose cada una. Cada uno puede generarse una nueva ronda de mutagénesis para crear nuevos fenotipos, con una nueva serie de experimentos de genes-blancos. En última instancia, ambos enfoques producen nuevas preguntas para la investigación.
- Ambos metodos genéticos pueden producir mutaciones de susceptibilidad y resistencia. El método genético directo proporcionan información sobre el funcionamiento del sistema inmune innato; métodos de genética inversa pueden decirnos cómo la inmunidad podría hacerse aún más fuerte, y puede revelar las necesidades esenciales de los patógenos que no son esenciales para el huesped. Cualquier tipo de mutación potencialmente puede apuntar a la terapéutica orientada al huesped
- Los organismos usan varios mecanismos de defensa contra virus algunas proteinas que usan los mamiferos son: Algunas proteínas que se requieren para sobrevivir a la infección viral se utilizan para combatir muchos otros microorganismos también. Pero el alelo protector más común no ha sido llevado a la fijación en los seres humanos. En los mamíferos, la respuesta a la infección viral se solapa sustancialmente con la respuesta a las bacterias, usando algunos de la misma detección, señalización y mecanismos efectores. En los insectos, hay una mayor dependencia de defensa de células autónomas, y los nuevos avances se debe hacer en la definición de las vías que están involucrados.
- Los receptores de tipo Toll (TLRs) que detectan los ácidos nucleicos puede operar en las células no infectadas de muchos tipos para detectar la producción de la infección en otras células. Tras reconocer ARN de doble cadena por TLR3, el ARN monocatenario viral rico GU (ARN de cadena simple) es reconocido por TLR7 en ratones y en seres humanos por TLR8, y el ADN viral o bacteriano no metilado con motivos CpG es reconocido por TLR9 TLR3 está implicada en la presentación cruzada de antígenos de células infectadas por virus a través de la participación de los RNAs derivados de virus - es decir, el ARN de las células infectadas se detecta por una población de células que responden sin necesidad de ser infectadas directamente. TLR7 y TLR9 tienen un papel crucial en el reconocimiento de los virus por las células dendríticas plasmocitoides (PDC). PDC parecen haber evolucionado como células de deteción de virus dependientes de TLR que pueden producir grandes cantidades de IFNs tipo I en respuesta a la infección viral. Esta especialización depende de los altos niveles de expresión del factor 7 constitutivo regulatorio del INF y del tiempo de retención de ligandos TLR9 dentro de la vía endocitica. La señalización procede a través de TIR (Toll / interleucina-1 receptor (IL-1R)) contiene un dominio adaptador de proteína inductora del interferón-β (TRIF) o MyD88, respectivamente. La proteina UNC93B (es una proteína transmembrana que se encuentra predominantemente en el retículo endoplasmático (ER)), se asocia con TLRs endosomales y es requerida para el proceso de señalización. TRIF, a través recluta del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) factor de -asociado 6 (TRAF6) y proteína de interacción del receptor 1 (RIP1), así como la unión TANK-quinasa 1 (TBK1) y IkB inducible (inhibidor de factor nuclear kappa B (NF-kB)) quinasa (Ikki) para activar el factor 3 regulador del interferón (IRF3) y NF-kB. Mientras MyD88 recluta TRAF6 y quinasa asociada IL-1R (IRAK) y activa IRF7 y NF-kB. TLR4 (que no se muestra aqui) también detecta virus, de señalización en respuesta a las proteínas codificadas por el virus específicos a través de MyD88, TRIF y/o TRAM (molécula adaptadora relacionada TRIF). NF-kappa B, IRF7 y IRF3 translocan al núcleo para inducir la transcripción de genes que codifican citoquinas tales como TNF, IL-6 y de tipo I IFNs.
- ARN de doble cadena viral en el citoplasma es detectado por uno de las dos helicasas citoplasmáticas, el gen asociado a la diferenciación de melanoma 5 (MDA5) o el gen del ácido retinoico inducible I (RIG-I). RIG-I también detecta 5'-trifosfato de ARN de cadena sencilla. El promotor estimulador del interferón-β (IFNß) 1 (IPS1) es un centro de objetivo de ambos MDA5 y RIG-I. A través de la union al receptor asociado al factor de necrosis tumoral (TNFR) 3 (TRAF3), IPS1 activa dominio de muerte asociado a FAS (FADD). FADD luego asocia con el pro-caspasa-8 o pro-caspasa-10, lo que resulta en su escisión. Los dominios de muerte efectores (deds) de la caspasa-8 o caspasa-10 activan el factor nuclear-kappa B (NF-kB), pero no el factor regulador de IFN-3 (IRF3). Sin embargo, la interacción entre TRAF3 y la quinasa unida a TANK 1 (TBK1) o la quinasa inducible IkB (inhibidor de NF-kB) quinasa (Ikki) conduce a la activación de IRF3 IRF7. Tripartito-motifcontaining 25 (TRIM25) cataliza ubiquitinación de la lisina-63-enlazada a RIG-I, mejorando notablemente la señalización de RIG-I.
- Citomegalovirus murino (MCMV) infecta a varios tipos de células incluyendo las células epiteliales y las células dendríticas (DCs) convencionales, pero no plasmocitoides (PDC). Las células infectadas expresan la proteína viral m157, que es reconocido por el receptor de activación de las celulas NK Ly49H. Ya sea directamente o no las CD infectadas convencionales detectan los ácidos nucleicos que se producen por MCMV a través de Toll-like receptor 3 (TLR3) y TLR9, lo que lleva a la producción de interferones tipo I (IFN), la interleucina-12 (IL-12) e IL -18. Estas citoquinas inducen señales a través de receptores que se expresan por las células NK, que en el caso de IL-12 y IFN tipo I actua a través del transductor de señal y activador de la transcripción (STAT) de moléculas. El ADN viral también es detectado por el PDC, el principal productor de IFN tipo I. El reconocimiento de m157 y la producción de IFN de tipo I se requieren para desencadenar la activación completa de las células NK. Células NK activadas producen IFN y expulsan gránulos líticos que contienen perforina y granzimas en una hendidura sináptica que se forma entre la célula NK y su célula diana infectada, lisando así la célula diana. IFN contribuye a la activación adicional de DCs convencionales y otras células inmunes. MCMV infección se detecta por lo tanto,por las celulas dentriticas y las celulas NK, y se requiere la cooperación entre los dos tipos de células para la defensa contra la infección temprana. Mutaciones que afectan de detección (por ejemplo, a través de TLR3 y TLR9), señalización (por ejemplo, a través de IFN o IL-12 e IL-18), la función efectora o la homeostasis pueden ser letales en el contexto de la infección.
- ARN de doble cadena (dsRNA) a partir de intermedios de replicación es reconocido por Dicer-2 en las células infectadas por virus (una célula de grasa corporal, la grasa corporal en la mosca es el equivalente en mamiferos al higado y el tejido adiposo blanco), que los procesa en pequeños RNAs de interferencia (siRNAs). La proteína de unión al ARN R2D2 ayuda a liberar una hebra de los siRNA dúplex (la cadena pasajera) e incorpora la otra hebra (la cadena guía) en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). El siRNA guía al RISC hacia las moléculas de ARN que contienen secuencias complementarias, que se degradan por la enzima de corte argonaute 2 (AGO2). Además de este sistema intrínseco de defensa del huésped, que se dirige a moléculas de ARN virales con alta especificidad, la infección por el virus de Drosophila C (DCV) conduce a la inducción de la transducción de la via de señalización JAK-STAT en las células no infectadas . Esta inducción es mediada por el receptor gp130 ligado a domeless, lo que sugiere que la infección viral provoca la síntesis de citocinas de la familia desapareada. Siguiendo la unión del ligando a domeless, se activa la quinasa JAK sólo en D. melanogaster, que está codificada por el gen de la hopscotch. Esto conduce a la fosforilación de la tirosina y la activación del factor de transcripción de D. melanogaster Stat92E. Los dímeros Stat92E translocan al núcleo y activar la transcripción de genes.
- Durante las etapas iniciales de la infección por HSV-1 (virus del herpes simple tipo 1) el genoma viral entrar en el núcleo de las células infectadas. Los cuerpos nucleares (ND10) incluyendo LMP, Sp100, hDaxx y ATRX son reclutados estos están estrechamente relacionados con genomas entrantes de HSV-1. Este reclutamiento depende de la vía de la conjugación de proteina SUMO (sumoilacion) y SIMs dentro de PML, Sp100 y hDaxx. Durante la infección wt HSV-1, la actividad Stubl ligada a ubiquitin ligasa viral (ICP0) promueve la degradación preferencial de proteínas conjugadas con SUMO que conducen a la dispersión de los factores de restricción y el inicio eficaz de la replicación viral. En ausencia de ICP0, proteínas conjugadass con SUMO específicas median la represión transcripcional de la expresión génica viral que lleva a la creación de la quiescencia viral y la latencia.
- La familia de proteínas APOBEC comprende un grupo de citidina deaminases que son capaces de modificar secuencias de ADN y/o ARN. En los seres humanos, la familia comprende once miembros con funciones distintas: APOBEC1, cuyos genes se encuentran en el cromosoma 12; APOBEC2, cuyo gen está en el cromosoma 6; 7 genes APOBEC3, ubicado en el cromosoma 22; y APOBEC4, cuyo gen está localizado en el cromosoma 1. Los miembros de esta familia se distinguen por la presencia de uno o dos dominios catalíticos que contienen un motivo de unión de zinc, caracterizado por secuencias de aminoácido conservadas. El desaminación mediada por estos enzimas consiste en la eliminación hidrolítica del grupo amino en la posición C4 de un citidina (C) o desoxicitidina (dC), generando un uridina (U ) o desoxiuridina (dU)
- Se muestra una célula de producción de virus en ausencia (izquierda) o en presencia (derecha) de una proteína Vif (factor de infectividad viralfuncional: 1.- En presencia de Vif (rectángulo naranja), A3 (azul elipse) está dirigido principalmente a la degradación proteasomal; 2.- Vif también puede bloquear la traducción de ARNm A3 y prevenir embalaje de A3 en el virión de una manera independiente a la degradacion. En ausencia de Vif, las moleculas A3 se empaquetan en partículas de virus entrantes. Después infectan otras células, A3 ejerce su actividad antiviral de múltiples maneras: 1.- A3 puede interferir con la transcripción inversa de una manera independiente de desaminación. 2.- A3 también puede interferir con la integración proviral a través de la formación de extremos de ADN viral anormales. 3.- En el proceso de hipermutación, A3 desamina principalmente residuos dC en la cadena negativa del ADN viral complementaria, originando dU, que sirve como plantilla para la incorporación de dA en la cadena positiva. Si son capaces de integrar el DNA, los pro virus hipermutado son normalmente gran parte defectuosos (3). 4.- El ADN viral que contiene múltiples dU también puede ser degradado antes de la integración
- Conformación, plegamiento, solubilidad, vida media, antigenicidad
- Los pacientes no presentaban complicaciones después de las vacunaciones de rutina, incluyendo las vacunas de virus vivos. El paciente 1 ha asistido a un programa de educación especial desde la guardería y, por tanto, ha sido presuntamente expuestos a las enfermedades infecciosas. Paciente 2 está educado en casa debido a un fenotipo neurológico más grave.
- A) Expresión MOGS en los pacientes con CDG-IIb. Lisados de proteínas a partir de células B de pacientes y controles tranformadas con Epstein-Barr y se hibridaron con anticuerpos contra MOGS y alfa-glucosidasa 2 (αGCS2). B) Perfil de N-glicanoS de IgG purificada a partir del paciente 2 con CDG-IIb (rojo) y un control sano (negro), evaluado por espectrometría de masas. El paciente había aumentado glicanos ricos en manosa (masa-carga 2600.1) y la disminución de glicanos normales (2605,3). C) C) Las inmunotransferencias muestran el nivel de expresión de la proteína de unión de inmunoglobulina (BIP), una chaperona molecular en el retículo endoplásmico que está regulada durante estrés del retículo endoplásmico, en las células B transformadas con EBV de un control sano y de paciente 2, que se trataron con dosis crecientes de tunicamicina (un inductor de la respuesta a proteínas mal plegadas través de la inhibición competitiva de N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa) y MG-132 (un inductor de la degradación del retículo endoplasmático asociada a través de la inhibición del proteasoma) durante 16 horas. Sulfóxido de dimetilo (DMSO) disolvente se utiliza en la reconstitución de tunicamicina y MG-132 y se añadió a las células en cantidades ajustadas como un control negativo para el estrés. β-actina se utilizó como control de carga. Se muestran los resultados representativos de múltiples experimentos.
- D) Muestra la producción in vitro y secreción de inmunoglobulina, evaluado con el uso de células secretoras de anticuerpos (ASC) diferenciadas a partir de las células B del Paciente 1 Paciente 2, y un control sano. Células mononucleares de sangre periférica fueron estimuladas con aureus Cowan (SAC) y Staphylococcus partículas que contienen CpG, oligonucleótidos y frecuencias ASC fueron evaluados por medio de un ensayo inmunoenzimático ELISPOT. Excepto por IgA ASC en el paciente 1, las frecuencias ASC en los pacientes fueron similares a aquellos en el control sano (gráfico de la izquierda). IgG producida por ASC se recogió y se almacenó a -20 ° C. Las muestras se descongelaron y se mantienen durante la noche a 4 °C o temperatura ambiente antes de la evaluación de los niveles de IgG (a la derecha el gráfico). T barras representan desviaciones estándar. Se muestran los resultados representativos de múltiples experimentos. Panel E muestra la estabilidad in vivo IgG y la vida media en ratones Rag1-knockout inyectaron por vía subcutánea con el plasma de los pacientes o los controles sanos. El plasma se había normalizado a contener cantidades iguales de IgG (1 mg o 2,5 mg). Los niveles de IgG humana en los ratones fueron monitoreados y analizados con el uso de un análisis de dos vías de varianza con medidas repetidas y corrección para comparaciones múltiples (t-test de Bonferroni) secuencialmente. I Las barras representan errores estándar. Se muestran los resultados representativos de múltiples experimentos.
- Figura 2 (página siguiente). Los estudios de susceptibilidad viral en los pacientes. El panel A muestra el virus de inmunodeficiencia (VIH) infección experimentos humanos. El gráfico de la izquierda muestra la entrada de cuatro VIH en cepas activados, células CD8-agotado mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de un control sano y desde los dos pacientes con CDG-IIb. Las células diana se incubaron con las diferentes cepas del VIH durante 2 horas a 37 ° C. después extenso lavado, las células se lisaron, y un tiempo real de la polimerasa reacción en cadena de (PCR) específica para el ADN del VIH se realizó. T barras representan desviaciones estándar. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. ND no denota hecho. El gráfico central muestra el nivel de la replicación del VIH en las mismas condiciones que las utilizadas para evaluar la entrada viral. Las células infectadas se mantuvieron a 37 ° C, los sobrenadantes de cultivo se recogieron, y el p24 del VIH nivel de proteína se determinó por medio de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Los datos mostrados representan la nivel de replicación viral en el día 3 o el día 4 después de la infección. Los datos son representativos de cuatro experimentos independientes. El gráfico de la derecha muestra la entrada viral de la cepa ELI6, recuperado en el día 4 de cada cultivo de células realizado para la evaluación p24 de VIH. Las células diana a partir de dos donantes sanos se prepararon mediante la activación de sus PBMC durante 2 días, seguido por purificación de sus células T CD4 +. La cantidad de virus de cada una de las tres fuentes que se incubó con células diana se normalizaron de acuerdo con el nivel de p24 medida por ELISA en el sobrenadante del cultivo. A tiempo real Se realizó la PCR específica para el ensayo de ADN del VIH. T barras representan desviaciones estándar.
- En el panel B, el inmunoblot superior muestra lisados de fibroblastos primarios de los pacientes y controles, que fueron transfectadas con un VIH glicoproteína 140 (gp140) -coding vector con o sin una no mutante manosilo-oligosacáridos glucosidasa V5-etiquetados (MOGS)-expresión vector. Como era de esperar sobre la base de su recorte defecto N-glicano, la gp140 viral sintetizado en las células de los pacientes tenía un peso molecular más alto que el sintetizado en las células de control. Cuando las células de los pacientes fueron transfectadas con el vector MOGS-V5 no mutante, el peso molecular gp140 volvió al peso molecular de control. Las diferencias en el peso molecular dependían del patrón de N-glicosilación, tal como se revela después de la eliminación de N-glicanos por medio de péptido-N-glicosidasa F (PNGasaF) la digestión. El inmunoblot parte inferior muestra el mismo patrón de glicosilación distintivo VIH gp140 detectado en las células de los controles y los de los pacientes, pero en este caso, el patrón de glicosilación gp140 detectado en las células de control se indujo en el patrón de los pacientes por el inhibidor de castanospermina MOGS (CS). VIH-Ig denota anticuerpo policlonal de conejo anti-humana VIH, y V5 ab anticuerpo monoclonal de ratón anti-V5. El gráfico muestra la infectividad del VIH producido en fibroblastos de paciente 2, que fue mayor después de la co-transfección de fibroblastos con MOGS no mutantes que con vector de expresión vacío. RLU denota unidades relativas de luz. T barras representan desviaciones estándar. El valor P se basa en un análisis de dos vías de varianza con medidas repetidas. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. En el Panel C, el gráfico superior muestra los títulos virales después de la infección de las células del paciente 1, el paciente 2, y un control sano con el virus que causó la gripe de 2009 A (H1N1). Los títulos virales fueron evaluados sobre la base de la hemaglutinación (HA) y la dosis infecciosa de cultivo de tejidos 50% (DICT50) del virus producido por los macrófagos derivados de monocitos (MDM) de los pacientes y el control sano (tres culturas por persona). No se aisló ningún virus de cualquiera de las culturas MDM de paciente 2. Sólo una de las culturas del paciente 1 replicado el virus, pero el título era de 1,5 log menor que en las células control. El gráfico inferior muestra los títulos de HA y la evidencia de un efecto citopático (CPE) en células Madin-Darby de riñón canino (MDCK) que fueron infectados con cantidades equivalentes de virus de la gripe producida por culturas MDM del paciente 1 y un control. Sólo uno de los tres cultivos incubados con el virus de paciente 1 tenía un título positivo para HA y CPE mínima (+/-). CPE y HA títulos fueron negativas (Neg) en los otros dos culturas. Las tres cultivos MDCK que fueron infectados con el virus que fue producida por las células de control mostraron CPE marcada (+++) y HA títulos positivos.
- El panel D muestra los resultados de un experimento de infección secundaria en la que el adenovirus tipo 5 (AdV5) produce a partir de fibroblastos obtenidos de pacientes y controles durante los experimentos de infección primaria se normalizó para infectar fibroblastos de control. Las células se lisaron, y el virus se midió por triplicado por medio de un ensayo de PCR cuantitativa. T barras representan desviaciones estándar. Panel E muestra los resultados de un experimento de infección secundaria en la que poliovirus 1 (PV1, cepa Mahoney) producido a partir de fibroblastos obtenidos de pacientes y controles durante los experimentos de infección primaria se normalizó para infectar células HeLa. El CPE se evaluó 72 horas después de la inoculación, y los títulos se calcularon con el uso del método de Reed y Muench. T barras representan errores estándar. Panel F muestra los resultados de un experimento de infección secundaria en el que se normalizó virus vaccinia (VV) producido a partir de líneas de células B EBVtransformed obtenidos de los pacientes y un control durante los experimentos de infección primaria de control para infectar líneas transformadas con EBV de células B. Las células se lisaron, y diluciones en serie de los lisados celulares se ensayaron para determinar su capacidad de infectar a las células B de un donante sano. MO
- Ochenta y ocho ES eran caucásicos (95%), 3 ES eran hispanos, 1 ES era afroamericana, y 1 ES fue indios americanos / nativos de Alaska. Ochenta y un ES eran varones (87%), y de estos, 76 (82% de todos) ES fueron los hombres que tienen sexo con hombres (HSH); 12 ES eran mujeres (13%). Once hombres y una mujer también reconocieron la inyección de drogas, ya sea en la selección o durante el seguimiento
- Association between CCR5 ORF plus −2459 genotype combinations and CCR5 expression. Stored peripheral blood CD4+ T cells and CD14+ monocytes from 163 individuals were blinded and analyzed by FACS for the mean number of CCR5 surface receptors per CCR5+cell and the percentage of CCR5-expressing cells. CCR5 genotypes were determined by restriction fragment length polymorphism analysis. Stratification of CCR5 densities and percentages by CCR5 ORF plus −2459 genotype combinations was performed after completion of all FACS analyses. Horizontal bars represent population medians. P values were determined by Mann-Whitney test. wt, wild type.
- Correlation between T-helper cell and monocyte surface CCR5 densities. Peripheral blood CD4+ T cells and CD14+ monocytes from 163 individuals were analyzed by FACS for the mean number of CCR5 surface receptors per CCR5+ cell. Line fit was done by linear regression.r, Spearman correlation coefficient.