Plaguicidas 27-03 -14

Dra. Estela Martin Toxicología Forense
2014 Unidad II
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2 – PLAGUICIDAS (https://www.biol.unlp.edu.ar/toxicologia/seminarios/parte_2/plaguicidas.html)
DEFINICIÓN:
Según la OMS, un pesticida o plaguicida es cualquier sustancia o mezclas de sustancias, de carácter orgánico
o inorgánico, que está destinada a combatir insectos, ácaros, roedores y otras especies indeseables de
plantas y animales que son perjudiciales para el hombre o que interfieren de cualquier otra forma en la
producción, elaboración, almacenamiento, transporte o comercialización de alimentos, producción de
alimentos, productos agrícolas, madera y productos de madera o alimentos para animales, también
aquellos que pueden administrarse a los animales para combatir insectos arácnidos u otras plagas en o
sobre sus cuerpos.
CLASIFICACION: Según la especie a combatir
INSECTICIDAS
MINERALES
Compuestos arsenicales
Compuestos fluorados
Azufre
Derivados del selenio
ORGANICOS DE SINTESIS
Organofosforados
Organoclorados
Carbamatos
A BASE DE ACEITES MINERALES
Aceites antracénicos
Aceites de petróleo
DE ORIGEN VEGETAL
Nicotina
Piretrina
Rotenona
HERBICIDAS
MINERALES
Sales de NH4+
, Ca++
, Cu++
, Fe+++
, Mg++
, K+
, Na+
, en forma de
sulfatos, nitratos, cloruros, cloratos.
ORGANICOS
Fitohormonas
Derivados de la urea
Triazinas y Diazinas
Derivados de los fenil sustituidos y las quinoxalinas
Derivados de la oxiquinoleína
Derivados de las tiadizinas y tiadiazoles
OTROS
Parquat
Diquat
Piclorame
FUNGICIDAS
MINERALES
Sales de cobre
Compuestos arsenicales
Aceites minerales
ORGANOMETALICOS Derivados órganomercuriales
ORGANICOS
Carbamatos y ditiocarbamatos
Derivados del benceno
Amicidas
Benzonitrilos
RODENTICIDAS
Derivados cumarínicos Warfarinas
Inorgánicos Sales de talio
El término plaguicida incluye también los siguientes tipos de sustancias: reguladores del crecimiento de las
plantas, defoliantes, desecantes, agentes para reducir la densidad de la fruta, agentes para evitar la caída

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prematura de la fruta y sustancias aplicadas a los cultivos antes o después de la cosecha, para proteger el
producto contra el deterioro, durante el almacenamiento y transporte.
Desde el punto de vista de la toxicología, es importante señalar que las formulaciones de plaguicidas
además del principio activo incluyen sustancias transportadoras, diluyentes como agua o solventes
orgánicos, aditivos e impurezas, que pueden tener potencial tóxico por si mismas.
El análisis de plaguicidas puede clasificarse en diversas áreas:
-Forense
-Diagnóstico de urgencia
-Control de poblaciones expuestas y no expuestas.
-Contaminación ambiental.
Si el plaguicida fue causa de muerte, estará en alta concentración, al igual que en una intoxicación aguda
grave. En las dos últimas áreas se trabaja con muestras con niveles muy bajos de plaguicidas (menores de
0,1 ppm), se habla de “residuos” de plaguicidas. De todos ellos estudiaremos los insecticidas
organoclorados, organofosforados y carbamatos, por ser los más utilizados actualmente y producir efectos
tóxicos muy característicos.
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS
Estas propiedades son las determinantes de su cinética ambiental. El aire, el agua, el suelo y los alimentos
retienen gran parte de los pesticidas y éstos llegarán a los seres vivos.
Constituye un problema actual su persistencia en el medio ambiente, su concentración y transformación en
organismos vivos.
ORGANOFOSFORADO ORGANOCLORADO
Estabilidad Muy baja elevada
Persistencia baja alta
Efectos bioacumulativo no posee muy grande
Toxicidad aguda alta baja
Solubilidad en agua alta baja
Hidrofobicidad bajo alto
Costo alto bajo
Selectividad alta baja
ETIOLOGIA
Las intoxicaciones accidentales son generalmente de origen profesional, afectando a los obreros que
trabajan en la preparación de los insecticidas o a los peones rurales durante o inmediatamente después de
la aplicación en cultivos.
Las intoxicaciones alimentarias se deben al consumo de alimentos tratados impropiamente con pesticidas.
Las intoxicaciones casuales se deben generalmente a confusiones, manejo imprudente y falta de vigilancia
de los niños.
Las intoxicaciones suicidas y criminales se han hecho más frecuentes debido a su alta toxicidad y fácil
adquisición.
PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS
Son sustancias biodegradables en la naturaleza, sin tendencia a acumularse en las grasas del organismo,
pero con gran actividad neurotóxica que va a producir intoxicaciones agudas de gravedad. Son los
insecticidas, junto con los carbamatos y piretroides, más ampliamente utilizados en la actualidad.

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Sus estructuras químicas derivan de la sustitución por restos orgánicos en el fósforo pentavalente. Pueden
clasificarse como:
a) Derivados de la molécula del ácido fosfórico. Si los dos primeros oxhidrilos se esterifican con radicales
alquílicos se obtienen los alquil-fosfatos o alquil-pirofosfatos (ejemplo: dichlorvos). Si dichos oxhidrilos se
sustituyen por amidas se obtienen las fosforamidas (ejemplos: metamidofós, acefato).
b) Derivados de la molécula del ácido fosforotiónico: De este ácido derivarán a su vez numerosos ésteres
tiofosfóricos (ejemplo: paratión).
c) Derivados del ácido fosforotiolotiónico. (ejemplo: malatión).
d) Derivados del ácido fosforotiólico (ejemplos: malaoxón, demeton-S-metil.).
Mecanismo de acción
Los insecticidas organofosforados actúan combinándose con gran afinidad con las esterasas, inactivándolas
en forma irreversible. Los oxofosforados (enlces P=O) son fuertemente inhibidores, mientras que los
tiofosforados (P=S) no son fuertemente inhibidores y necesitarán de una biotransformación a la forma oxo
para actuar como inhibidores.
La inhibición de las colinesterasas es la que va a derivar en los síntomas y signos de la intoxicación aguda.
El papel fisiológico de la colinesterasa consiste en la hidrólisis de la acetilcolina, mediador químico en la
transmisión del impulso nervioso. Se acumulan así grandes cantidades de acetilcolina en las sinapsis.
Existen dos tipos de colinesterasas: la colinesterasa verdadera, presente en eritrocitos y tejido nervioso y la
pseudocolinesterasa presente en suero o plasma.
Ambas enzimas son inhibidas por los compuestos organofosforados, pero la eritrocitaria es la que mejor
refleja el estado de inhibición de la colinesterasa del sistema nervioso, por lo que se utiliza para evaluar el
estado de intoxicación aguda de un paciente. Por otro lado, la colinesterasa plasmática o
pseudocolinesterasa es la que más tarda en regenerarse, por lo que se utiliza en la evaluación de la
exposición crónica a organofosforados.
Absorción:
Los ésteres fosforados se absorben fácilmente a través de la piel y más rápidamente por vía digestiva. La
absorción respiratoria es casi instantánea.
Muestras
La muestra más utilizada para la determinación de organofosforados y sus metabolitos es orina de 24 hs,
colectada en envase de vidrio y conservada en heladera.

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También, como índice de la intoxicación, puede determinarse la actividad de las colinesterasas sanguíneas:
plamática y eritrocitaria.
La determinación de residuos se realiza, por un lado, en distintos tipos de alimentos, principalmente de
origen vegetal, productos cárneos y aguas de bebida, y por otro lado en muestras ambientales como aguas
superficiales y suelos.
CARBAMATOS
Forman parte de una gran familia de plaguicidas entre los que se hallan herbicidas, fungicidas e insecticidas.
Todos ellos derivan del ácido carbámico:
Se los divide en tres grupos:
1-N-metil carbamatos: uno de los hidrógenos del grupo amino es reemplazado por un grupo metilo
(ejemplos: Aldicarb, Carbaryl, Carbofuran).
2-N,N, dimetil Carbamato: ambos hidrógenos del grupo amino son reemplazados por grupos metilos
(ejemplos: Isolan, Pirolan).
3-N-fenil Carbamatos: un grupo fenilo sustituye a uno de los hidrógenos del grupo amino.
Es equivalente al mecanismo de acción de los organofosforados, uniéndose a las colinesterasas e
inactivándolas. Pero ésta unión es reversible espontáneamente en menos de una hora, de manera que en el
curso de una intoxicación aguda por carbamatos se manifiestan los mismos signos y síntomas de la
intoxicación por organofosforados pero con un curso más rápido hacia la recuperación.
Muestras
Se los encuentra en orina de 24 hs. También se los halla en distintos tipos de alimentos contaminados,
principalmente de origen vegetal.
PLAGUICIDAS ORGANOCLORADOS
Desde el punto de vista estructural, constituyen un grupo de sustancias, muy heterogéneo, teniendo en
común la presencia de estructuras monocíclicas o policíclicas con distinto número de sustituyentes cloro.
Incluyen varios grupos:
a) Grupo de los Ciclodienos: Aldrín y su epóxido, el Dieldrín, Mirex
b) Grupo del DDT (dicloro-difenil-tricloroetano): p-p´-DDT, o-p´-DDT, p-p´-Metoxiclor.
c) Grupo del Hexaclorociclohexano (HCH) y Hexaclorobenceno(HCB): HCH, -HCH, HCB.
d) Grupo de los indenos clorados: hepatacloro, a-Clordano.
e) Grupo de los terpenos clorados: Toxafeno.

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Absorción
Por vía digestiva principalmente; a través de la piel cuando están en solventes lipídicos y a través de la vía
respiratoria por su aplicación en forma de pulverizaciones.
Poseen acción neurotropa, aunque no se conoce bien el mecanismo sobre el sistema nervioso. A largo
plazo, inducen las enzimas microsomales hepáticas. Son inductores en cantidades residuales, del orden de
las que pueden estar acumuladas en el tejido adiposo.
En el hombre, al igual que en el medio ambiente, se degradan lentamente y se pudo determinar que tienen
una gran afinidad por los tejidos grasos. Estas cantidades acumuladas en grasas preocupan, pues por
ejemplo, en el caso de adelgazamiento brusco pasan a la circulación general y producen síntomas de
intoxicación.
Preocupa también, porque pasan en cantidades considerables a la grasa de la leche. Los recién nacidos se
pueden ir contaminando, debido a los residuos de pesticida presentes en su alimento natural.
Muestras
La sangre es la muestra más adecuada para la búsqueda de plaguicidas organoclorados ya que por su gran
liposolubilidad rara vez aparecen en orina. Se colectan 8-10 ml de sangre en tubo de centrífuga
heparinizado.
Jugo gástrico: evitar el agregado de carbón vegetal . Conservar en la heladera.
Distintos tipos de alimentos, principalmente de origen vegetal, productos cárneos y aguas. Los alimentos
son considerados como la principal vía de acceso de los pesticidas organoclorados al organismo (80-90% del
ingreso diario de plaguicidas según Kaphalia, 1985).
INVESTIGACION DE PLAGUICIDAS
CONSIDERACIONES GENERALES
Los plaguicidas deben aislarse de los materiales en los que se encuentran para su investigación. Los
extractos deben someterse a una purificación antes de investigarlos y/o determinarlos cuantitativamente.
La identificación se realiza por CGL o TLC. La CGL permite alcanzar más bajos límites de detección, sobre
todo con detectores específicos para cada clase de pesticida (OC, OP ).
Se distinguen tres pasos fundamentales en su determinación:
1- EXTRACCION del plaguicida de la matriz originaria y traspaso a una fase separable. La mayoría de los
plaguicidas se extraen de las muestras con solventes como el éter de petróleo, acetonitrilo o acetona; o
bien cloroformo o éter etílico en medio neutro o ácido dependiendo del plaguicida y del tipo de muestra.
MUESTRAS que pueden llegar al laboratorio:

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-Biológica: lavado gástrico, sangre, orina , vísceras.
-No biológica: preparados (polvos, emulsiones, etc.), alimentos, agua, aire, suelo.
2- PURIFICACION del plaguicida (eliminación de otras sustancias interferentes).Los métodos de purificación
no son generales para los distintos plaguicidas y algunos no lo son, siquiera para todos los plaguicidas de
una misma familia. En general, los extractos pueden purificarse por partición con solventes y/ o por
cromatografía en columna de florisil, celite, sílica gel, alúmina o carbón activado.
3- DETERMINACION Cualitativa y/o Cuantitativa (TLC y CGL). La identidad de un plaguicida debe confirmarse
por un segundo método. Por ejemplo, si el plaguicida se ha reconocido por CGL podrá efectuarse un TLC;
una CGL empleando un detector selectivo para otro elemento presente en el plaguicida; o bien una CGL con
columnas recubiertas con fase(s) de polaridad diferente a las usadas en el primer análisis; o una CGL
combinada con un espectrómetro de masas.
Para el dosaje de plaguicidas se requieren métodos que los separen y detecten cuantitativamente, siendo el
más adecuado la CGL.
A- INVESTIGACIÓN DE PLAGUICIDAS EN FRUTAS Y VERDURAS
1- EXTRACCIÓN: tomar 50 gramos del vegetal elegido y se colocan en un homogeneizador (licuadora) junto
con 100 ml de acetonitrilo y 5 gramos de celite, homogeneizar durante 2 minutos a gran velocidad. Filtrar
por succión con papel de filtro poro medio y medir el volumen obtenido: V1
Transferir la mitad de V1 a una ampolla de decantación de 500 ml, agregar 20 ml de éter de petróleo (EP);
agitar durante 1 o 2 minutos, luego agregar 10 ml de sol. concentrada de ClNa y 100 ml de agua destilada.
Agitar vigorosamente durante 30-45 segundos. Retirar la fase acuosa. Lavar la fase EP con 20 ml de agua
destilada dos veces. Filtrar la fase EP por papel de poro medio que contenga sulfato de sodio anhidro y
medir el volumen obtenido: V2.
Concentrar en plancha calefactora o en Baño de María (con mucho cuidado hasta 2 o 3 ml finales).En el
residuo se identifican OC y OP por TLC y/ o CG (en el residuo purificado).
2-PURIFICACIÓN: (Fase Estacionaria por Vía Húmeda): tomar entre 3 y 5 gramos de florisil activado a 650ºC,
5 Hs. y luego mantenido a 130ºC. Suspender en éter de petróleo. Agregar esa suspensión a la columna
cromatográfica poco a poco, de manera que se forme una lluvia fina de Florisil, homogeneizando con golpes
cuidadosos, hasta obtener una altura de 10 cm. Sobre el Florisil y operando de manera similar, añadir
sulfato de sodio anhidro llegando a una altura total de 12 cm.
Dejar eluir el EP hasta que sólo sobrepase la fase estacionaria Florisil-sulfato de sodio en 2-3 mm. y sembrar
la muestra. Dejar eluir hasta unos pocos mm por encima del sulfato de sodio y comenzar con el agregado
del eluyente elegido (al principio, el agregado se efectúa con pipeta , para no romper la fase estacionaria y
luego se llena el reservorio). Se eluye a una velocidad de flujo de 5mm/ min o menor, con tres fracciones de
solvente de elución de 100 ml cada una.
El primer solvente de elución es éter etílico al 6% en éter de petróleo, el segundo es éter etílico al 15% en
éter de petróleo, y el tercero es éter etílico al 50% en éter de petróleo.
Los plaguicidas se van eluyendo de acuerdo a la relación de polaridades de estos dos solventes:
Fracción del 6%:
Clorados: Aldrin, DDE, DDT, Heptacloro
Fosforados: Ethión
Fracción del 15%:
Clorados: Dieldrin, Endrin
Fosforados: Metilparatión, Diazinón, Paratión
Fracción del 50%:
Fosforados: Malatión
Concentrar cada fracción hasta no más de 2-3 ml. Este será utilizado para sembrar en TLC o inyectar en un
cromatógrafo gaseoso.

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B-INVESTIGACIÓN DE PLAGUICIDAS EN ORINA, SANGRE Y LAVADO GASTRICO
1-EXTRACCION:
Se utilizan las columnas tipo EXTRELUT , rellenas con tierra silícea como soporte inerte.
Si la muestra a sembrar consiste en ORINA, se acidificarán 19 ml de la misma con 1 ml de solución saturada
de ACIDO TARTARICO (pH: 5-6).
Si la muestra es PLASMA o SUERO se realiza una dilución con agua destilada (4 ml de suero o plasma se
llevan a 19,5 ml con agua destilada) y se acidifica con 0,5 ml de solución saturada de ácido tartárico.
Si la muestra es LAVADO GASTRICO, se toman 9,5 del mismo y se llevan a 19 ml con agua destilada (si no se
practica la dilución, el líquido taponaría la columna por su alta densidad) y se acidifica con 1 ml de solución
saturada de ácido tartárico.
Se realiza una primera elución con éter de petróleo (E1). Se cambia el recipiente de recolección y se eluye
ahora con éter etílico obteniéndose un segundo extracto (E2). Ambos extractos se concentran por
evaporación a Baño María.
En el primer extracto (E1), se aislarán los plaguicidas ORGANOCLORADOS. Para sembrarlo en TLC es
necesario resuspender con Hexano.
En el segundo extracto (E2) se hallarán los ORGANOFOSFORADOS y CARBAMATOS. Para sembrarlo en TLC,
es necesario resuspender en una mezcla Tolueno: Propanol (1: 1).
C- INVESTIGACIÓN DE PLAGUICIDAS EN AGUAS
Se colocan 750 ml de agua (muestra) en una ampolla de decantación de 1 litro. Se agrega 25 ml de n-
hexano. Se agita vigorosamente durante 1 minuto. Se separan las fases y se recoge la capa de n-hexano. Se
efectúan 2 extracciones más con n-hexano y se reúnen los extractos. Secar la fase orgánica con sulfato de
sodio anhidro. Filtrar y concentrar a baja temperatura.
Generalmente se hallan trazas de plaguicidas en agua, por eso se parte de un gran volumen de muestra.
D- INVESTIGACIÓN DE PLAGUICIDAS EN VISCERAS. MÉTODO DE FASSI ADAPTADO.
1-EXTRACCION:
En un vaso de precipitados se colocan 50 gr. de papilla de vísceras, bien trituradas, se le agrega ácido
tartárico sólido (como desproteinizante) hasta pH ácido y luego sulfato de sodio anhidro mezclando hasta
consistencia pastosa. La mezcla se seca bajo una corriente de aire caliente (secador de cabello).
El contenido del vaso se transvasa a un erlenmeyer con tapa esmerilada. El material se extrae con éter de
petróleo (punto de ebullición 40-60ºC ) agregándolo hasta cubrir la papilla. Agitar enérgicamente durante
60 segundos, repitiéndose el proceso dos veces más. Dejar en reposo hasta una neta separación de las
fases. Reservar la fracción etérea para la investigación de plaguicidas.
2-PURIFICACION:
El extracto de éter de petróleo se trata con acetonitrilo saturado en éter de petróleo; se dispersa en agua
(200 ml de agua destilada con 10 ml de solución saturada de ClNa); se extrae con 50 ml de éter de petróleo.
Si el extracto está impuro se toma con Celite 545 , mezclando cuidadosamente y eliminando el solvente en
corriente de aire, hasta que no queden partículas aglomeradas.
Se prepara una columna (de 0,8 x 16 cm) taponándola con algodón y colocando en ella la muestra absorbida
en el Celite a través de un embudo y compactando el polvo tanto como sea posible con una varilla.
Se prepara una segunda columna (de 1,4 x 16 cm) con llave, llenándola con éter de petróleo, empujando
con una varilla de vidrio un tapón de algodón hasta el fondo. Posteriormente se agregan 5 g de alúmina y
luego 5 g de Florisil , cubriendo finalmente con una capa de arena de 2 a 2,5 cm de espesor, drenándose el
solvente , hasta que el nivel del mismo alcance la parte inferior de la capa de arena.
Se inserta el extremo inferior de la columna de 0,8 cm en el extremo superior de la columna de 1,4 cm. La
columna pequeña que contiene los plaguicidas se eluye con 3-4 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) aplicando
presión positiva.

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Abriendo la llave de la columna grande se permite la entrada del DMSO en el Florisil, retirándose luego la
columna superior y comenzando la elución con 100 ml de éter de petróleo. Recoger el eluído en un vaso de
precipitado y evaporar suavemente.
DETERMINACION CUALI / CUANTITATIVA DE OC, OP Y CARBAMATOS.
a)-IDENTIFICACIÓN DE ORGANOCLORADOS POR TLC
Se usa esta metodología cuando se sospecha una alta concentración de plaguicida en la muestra. Sembrar la
muestra (el extracto etéreo purificado) y patrones en una placa de sílica G (9 gramos de sílica G: 18 ml de
agua).
Fase Fija: sílica gel G activada a 120ºC durante 2 Hs.
Fase Móvil: n Hexano:Acetona (9:1)
Testigos: DDT, Gamexane
Desarrollar hasta llegar el frente de solvente a 10 cm.
Revelado: Difenilamina al 0.2% en etanol absoluto.
Rociar y exponer a UV entre 20 -60 minutos. Determinar los Rf característicos de las muestras y patrones. Se
detectan concentraciones del orden de los microgramos.
b)-IDENTIFICACIÓN DE ORGANOFOSFORADOS POR TLC
Fase fija: sílica gel G activada a 120ºC durante 2 Hs.
Fase Móvil: n Hexano:Acetona (8:2)
Testigos: Paratión, Malatión
Revelado 1: Cloruro de paladio al 0.5% en HCl al 10%
Rociar y calentar a 80º C durante 20 minutos. Aparecen manchas pardas para fosforados. Determinar los Rf
y caracterizar las manchas halladas en función de los patrones.
Revelado 2: Inhibidor de la Colinesterasa. Una vez corrida la placa , se la expone a vapores de bromo dentro
de una cuba. El bromo oxidará el azufre de la molécula de OP a oxígeno.
En hígado también ocurre una oxidación del plaguicida por oxidasas microsomales hepáticas, aumentando
su potencial tóxico.
Luego de exponer la placa al aire para evaporar el exceso de bromo que interfiere en el resto de la reacción,
se hace una aspersión con la enzima Colinesterasa y se lleva a estufa a 37ºC durante 30 minutos. La enzima
se obtiene a partir de un homogenato de hígado (lugar donde se sintetiza) o bien puede utilizarse suero o
plasma fresco.
Luego de hacer la aspersión, la enzima será inhibida en los sitios donde se encuentra el plaguicida. Para
evidenciarlo se pulveriza con acetato de
alfa naftilo/ Fast Blue. El acetato de alfa
naftilo es sustrato de la enzima y liberará naftol.
Luego el naftol se copula con el Fast Blue dando
color lila donde la enzima es activa.

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Donde la enzima es inhibida por el plaguicida no se produce la reacción , quedando blanco. La placa se verá
lila con manchas blancas.
Sensibilidad: 0,1 a 1 ng.
Interferencias: fenotiazinas, cocaína dan positiva la reacción. Cuando da negativa se puede descartar la
presencia de OP; si da positiva debe confirmarse con otros revelados.
c)-IDENTIFICACION SIMULTANEA DE OP, OC Y CARBAMATOS POT TLC
Fase fija: sílica gel G activada.
Fase Móvil: Ciclohexano:Hexano:Cloroformo:Acetona (4:4:1:1).
Testigos:
OCl: Heptacloro y Lindane
OF : Parathion y Malathion
Carbamatos: Furadan y Carbaryl.
Revelado: se lleva a cabo un revelado secuencial que consiste en:
1-Difenilamina alcohólica. Rociar y colocar la placa al sol durante 30 minutos. Los pesticidas organoclorados
aprecerán de color gris verdoso.
2-KOH al 10% en agua. Calentar suavemente.
3-Tetrafluorborato de nitrobencenodiazonio en etanol con gotas de etilenglicol o propilenglicol. Los
carbamatos aparecen azules o rosas.
4-Cloruro de Paladio 0,5% en HCl al 10%. Los organofosforados aparecen de color naranja.
REACTIVOS REVELADORES
Difenilamina al 0,2% en Etanol: 0,2 gr de Difenilamina en 100 ml de Etanol. PREPARAR EN EL MOMENTO.
Cloruro de Paladio al 0,5% en
ClH al 10%:
0,5 gr de Cloruro de paladio se disuelven en 100 ml de ClH al 10 %.
Hidróxido de Potasio al 10%: 10 gr de K(OH) en 100 ml de agua.
Tetrafluoroborato de 4-
nitrobencenodiazonio:
se disuelven 25 mg de este reactivo en etanol:etilenglicol (9:1). Se conoce
comercialmente como Fast red.
d)-IDENTIFICACIÓN de OC y OP en CGL
En la cromatografía gas - líquida la muestra se distribuye entre dos fases: una fija y una móvil. A través de la
fase fija (líquida), adsorbida sobre un soporte inerte, circula la fase móvil (gas) transportando la muestra
vaporizada.
Las moléculas de la muestra tardarán cierto tiempo en recorrer la columna según su polaridad con respecto
a la fase fija.
Cuando circula el gas portador, se registrará una línea de base. Cuando se inyecta la muestra y se detecta,
aparecerá un pico.
Del cromatograma se obtendrá la siguiente información:
-Tiempo de retención: es el tiempo que tarda en aparecer el pico, desde la inyección hasta la altura máxima
del mismo.
-Área del pico: es proporcional a la concentración de la muestra.
Para identificar una sustancia se debe pasar la muestra por distintas columnas, de diferente polaridad. Si en
todas coincide el tiempo de retención de la muestra con el testigo, decimos que se trata de esa sustancia.

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Se utilizan tres tipos de columnas:
OV17 Fenil silicona
QF1 -DC2000 Trifloruro propil Metil silicona
DC2000 Metil silicona
El flujo a través de la columna debe ser constante y es necesario regularlo de modo que permita el
intercambio y se reproduzca el tiempo de retención.
La cámara inyectora se encuentra a elevada temperatura, en ella se siembra la muestra, la cual es
vaporizada y arrastrada por el gas carrier.
Ventajas: alta resolución y gran sensibilidad. Detecta trazas.
Desventajas: es necesario la purificación previa de la muestra, para poder inyectarla. Además la muestra
debe ser de bajo punto de ebullición para que se volatilice.
Conviene usar detectores que respondan a un número limitado de elementos o estructuras de modo de
separar más eficazmente el plaguicida contaminante de las interferencias presentes en la muestra.
Para determinar OC se utiliza detector de captura de electrones. A medida que el gas portador (Nitrógeno)
fluye a través del detector, una lámina de N radiactivo ioniza las moléculas del gas y genera electrones.
Estos se desplazan hacia el ánodo lo cual produce una corriente de fondo que se visualiza como la línea de
base en el cromatograma. Si se inyecta una muestra con moléculas que tengan átomos electronegativos,
disminuye la señal eléctrica y en el cromatograma se ve un pico. Se detectan microgramos y hasta
nanogramos de OC.
Generalmente se utiliza una columna capilar de polaridad intermedia con polifenil metil siloxano como
relleno. Temperatura del detector: 300ºC. Gas portador: Nitrógeno (caudal: 10 ml/ min.). Programa de
temperatura: Temperatura inicial de 190ºC durante 1 minuto. Temperatura final de 250ºC durante 6
minutos. La variación de temperatura es de 1º/ min entre ambas.
Para los OP se utiliza un detector fotométrico de llama. Este detector consiste en una pequeña llama de
hidrógeno quemándose en un exceso de aire y rodeada por un campo electrostático. El efluente de la
columna (con Nitrógeno como gas portador) entra a la base del mechero y se mezcla con el Hidrógeno.
Los compuestos orgánicos al salir de la columna se ionizan y los electrones libres son colectados en un
electrodo cargado positivamente aumentando de esta manera la corriente que circula por él, la cual es
amplificada y registrada. Este detector responde sólo a átomos de Carbono que sean oxidables. Posee una
sensibilidad del orden de los nanogramos. Para la determinación se inyecta entre 0.5-2 microlitros de
muestra.
INHIBICION de COLINESTERASA - (Como recurso de identificación de la intoxicación con plaguicidas
organofosforados y carbamatos ).
Debido a que resulta difícil encontrar algún plaguicida organofosforado en suero u orina o sus metabolitos,
se recurre a determinaciones en suero, plasma o sangre entera que son muy rápidas y pueden dar indicio de
la gravedad de la intoxicación.
Para la identificación rápida de colinesterasa, existen técnicas de ejecución simple, basadas algunas de ellas,
en el empleo de papeles reactivos. El denominado Mercktest, se recomienda para determinar la actividad
de la enzima en suero o plasma, no sólo es útil en casos de exposición o de intoxicación con inhibidores de
colinesterasa, sino también en diversos estados patológicos (lesiones hepáticas) o para evaluar la acción de
ciertos medicamentos sobre el sistema enzimático.
Método pHmétrico de Michel (para acetilcolinesterasa eritrocitaria).
FUNDAMENTO: La acetilcolinesterasa provoca la hidrólisis de la acetilcolina en colina y ácido acético. Este
método estima la actividad de la enzima, midiendo el cambio de pH a través del empleo de un electrodo de
vidrio.
Otros métodos como el de W. Caraway, registra el cambio de pH usando un indicador colorimétrico.

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MUESTRA: Se trabaja con sangre heparinizada, aproximadamente 8 ml de sangre, obtenida por
venopunción (evitar la hemólisis), transferirla a un tubo heparinizado (con una gota de heparina), tapar y
agitar cuidadosamente por inversión.
Es conveniente separar el plasma de las células lo más pronto posible, cuando esto no se pueda llevar a
cabo, se debe refrigerar la muestra a 4ºC durante 2-3 horas (no es conveniente por más tiempo).
Procedimiento para la determinación de acetilcolinesterasa eritrocitaria
REACTIVOS
Solución tampón para glóbulos rojos: Barbital sódico 0,2 N (4,1236 gr), fosfato de potasio diacido, 0,004 N
(0,5444 gr) y cloruro de potasio 0,6 N (44,736 gr).
Disolver los reactivos en 950 ml de agua.
Ajustar el pH: 8,10 exactamente a 25º C, con ClH 0,1 N ( se requieren alrededor de 28 ml).
Agregar gotas de tolueno y guardar en refrigerador. Deberá comprobarse el pH y la capacidad de la solución
tampón cada vez que se va a usar ya que estos valores tienden a variar con el tiempo.
NOTA: dietilbarbiturato de sodio= Barbital sodico= Veronal sodico.
Ioduro de acetilcolina: Disolver 3,004 gr de Ioduro de acetilcolina en agua y llevar a 100 ml. Agregar gotas de
tolueno y guardar en heladera.
Si la muestra fue refrigerada esperar a que alcance la temperatura ambiente.
Saponina al 0,01%: Disolver 10 mg de saponina en agua y llevar a 100 ml.
Heparina: 10000 U/ml.
Transferir 0.04 ml exactos de glóbulos rojos sedimentados a un matraz de 5 ml conteniendo 2 ml de
saponina al 0.01 %, enjuagando la pipeta con la mezcla de saponina y glóbulos rojos, hasta que todas las
células se desprendan de la pipeta.
Mezclar mediante vortex. Una vez preparadas las muestras, añadir a cada tubo 2 ml de solución tampón
(para eritrocitos), esperar l0 min.
Determinar el pH de la solución hasta 0.01 de unidad y anotarlo como pH1, (si la lectura es < 7.97 desechar
la prueba y comenzar otro ensayo con una solución tampón recién preparada).
Añadir 0.4 ml de sol. 0.1 M de yoduro de acetil colina para eritrocitos, mezclar con vortex y anotar como T1
el momento en que se añadió el yoduro, dejar reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente, cumplido
este tiempo determinar el pH de la mezcla, se tomará como pH2 y el momento que se mide como T2
CALCULO: El pH/hora se determina siguiendo el siguiente esquema:
(pH1 - pH2 -b) x ƒ
pH/hora=
treccion
b: corrección para la hidrólisis no enzimática (ver tabla)
ƒ: corrección para la variación de pH/hora con el pH.
treccion : T2-T1, expresado en horas.
Los factores de corrección para la hidrólisis no enzimática, no son lineales con respecto al tiempo.
Valor de referencia: La cifra promedio de la actividad de la colinesterasa en un grupo de individuos
normales de acuerdo a Michel, es de Delta de pH/hora: 0.75 para GR.
Factores de corrección que se emplean en el cálculo:
pH b f
7.90 0.03 0.94
7.20 0.00 1.00
7.10 0.00 1.00
7.00 0.00 1.00
6.90 0.00 0.99
6.80 0.00 0.98

2014 Unidad II
12
6.70 0.00 0.97
6.60 0.00 0.97
pH b f
6.50 0.00 0.97
7.30 0.00 1.00
7.80 0.02 0.95
7.70 0.01 0.96
7.60 0.00 0.97
7.50 0.00 0.98
7.40 0.00 0.99
Procedimiento para la determinación de colinesterasa plasmática
La Colinesterasa sérica o plasmática (Pseudocolinesterasa o Butirilcolina esterasa) cataliza la reacción de
hidrólisis de los ésteres de la colina, tal como la S-butirilcolina, con máxima actividad a pH 7,7. La tiocolina
liberada reacciona con el ácido 5,5’-ditiobis-2- nitrobenzoico (DTNB) produciendo un compuesto amarillo de
acuerdo al siguiente esquema de reacción.
Butirilcolina + agua
Colinesterasa
Tiocolina + Butirato
Tiocolina + DNTB 2-nitro-5-mercaptobenzoato.
La velocidad de aparición de color es directamente proporcional a la actividad enzimática y se mide a 405
nm.
Criterios para determinación del grado y tipo de intoxicación.
Colinesterasa Sérica Colinesterasa Eritrocitaria Indica
Normal o poco
descendida
>o.75 pH/h normal o poco descendida (0.75-
0.60)
-No intoxicación.
-Leve intox
-Intoxicación a carbamatos
discretamente descendida (0.60-0.50)
-Intoxicación moderada o a
dosis repetidas
Muy descendida muy descendida (0.50-0.25) -Intoxicación grave (aguda)
http://www.biol.unlp.edu.ar/toxicologia/seminarios/guiasem.html

Plaguicidas 27-03 -14

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