PRÁCTICA - ACCIÓN DE AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS SOBRE BACTERIAS - PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA.pdf

______________________________________________________ José González Cabeza
151
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A
INTRODUCCIÓN
Este conjunto de pruebas pretende brindar información al microbiológica para
diagnosticar y tratar enfermedades. La identificación de un microorganismo que ha sido
recuperado de una muestra clínica, a menudo beneficia al paciente; ya que permite y/o
contribuye al diagnóstico definitivo de la enfermedad confusa y ayuda en la selección del
tratamiento antimicrobiano.
Por tanto, los aspectos de mayor información que puede rescatar un clínico son: 1)
Evidenciar la presencia de agentes infecciosos. 2) Selección de un agente antimicrobiano de
máxima eficacia para ser utilizado ante un determinado paciente. 3) Servir de instrumento
epidemiológico, al detectar la resistencia de los microorganismos dentro de un centro
hospitalario y/o en el seno de la comunidad.
Los métodos para determinar sensibilidad y resistencia en las bacterias pueden ser de
tipo:
1. Cuantitativo: Que consisten en determinan la menor concentración de un antibiótico que
inhibe visiblemente el crecimiento de un microorganismo, denominado, Concentración
Mínima Inhibitoria (MIC).
2. Cualitativos: Son aquellos que empleando la difusión de un antibiótico concentrado en un
disco de papel, permiten categorizar a los microorganismos en susceptibles, intermedios o
resistentes, cuando se enfrentan a un agente antimicrobiano específico.
En el presente capítulo se describirán básicamente tres métodos: El método de
macrodilución en caldo, el método clásico puesto a punto por Kirby y Bauer conocido usualmente
como el método "disco-placa" y, el más reciente, el epsilómetro o ε-test, que permite determinar
directamente la concentración mínima inhibitoria.
OBJETIVOS
1. Determinar la susceptibilidad a antibióticos de una bacteria aislada, utilizando para ello el
método de macrodilución en caldo, prueba de susceptibilidad por difusión en disco
(antibiograma).
2. Estimar el MIC para un antibiótico de una bacteria aislada.
3. Conocer el principio básico del ε-test.
1. INDICACIONES PARA EL ESTUDIO DE SUSCEPTIBILIDAD MICROBIANA
Durante la ejecución, no todos los aislamientos deben estudiarse, aún cuando el clínico
haya efectuado la solicitud usual de “Cultivo y Antibiograma”. No deben estudiarse aquellos

Cap. 11. Pruebas de Susceptibilidad Microbiana ________________________________
152
microorganismos cuyo antibiograma se conoce, como estreptococos  y -hemolíticos. De igual
manera, no deben efectuarse pruebas de susceptibilidad para microorganismos que se
consideran contaminantes, o cuando se recuperan tres especies o más (excepto en ciertos casos,
como la infección de una vejiga neurogénica, en la que puede ser necesario establecer una línea
de base de la flora bacteriana presente y el antibiograma de cada especie).
No obstante, los microorganismos tienen susceptibilidad variable a los agentes
antimicrobianos, siendo necesario tener una herramienta que permita determinar la
susceptibilidad del microorganismo causante de la infección. Cada vez son menos los organismos
que tienen susceptibilidad predecible, por lo que debemos hacer el estudio de susceptibilidad en
la mayoría de los microorganismos aislados. Hasta hace unos años atrás, los laboratorios de
microbiología no realizaban estudios de susceptibilidad de S. pneumoniae o S. pyogenes, porque
se consideraban generalmente susceptibles a los antibióticos usados para tratar infecciones
causadas por estos organismos; desafortunadamente, al igual que en el resto del mundo, en
nuestro país han sido aisladas cepas de S. pneumoniae resistentes a penicilina y S. pyogenes
resistentes a eritromicina.
En la indicación primaria para el estudio de susceptibilidad, es determinar el antibiótico
más apropiado, los cuales aparecen descritos de acuerdo a su origen, año de descubrimiento,
espectro de acción y modo de acción en las Tablas 11.1 y 11.2 y, de esta manera poder iniciar la
terapia en un paciente con un proceso infeccioso.
TABLA 11.1. Antibióticos agrupados por familia: Su origen y su espectro de acción (Leclerc, 1981).
Espectro de Acción
Familia Antibiótico Origen Descubierto Cocos
Gram +
Cocos
Gram -
Bacilos
Gram +
Bacilos
Gram -
β- lactamicos
Penicilinas G
M
A
Cefalosporina
Penicilina G
Penicilina V
Meticilina
Oxaciclina
Ampicilina
Carbencilina
Cefalosporina C
Cefalotina
Cefaloridina
Penicillium
notatum y P.
chrysogeum
(Síntesis)
(Síntesis)
Cephalosporium
acremonium
1929
1945
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
Ligosacaridos Estreptomicina
Neomicina
Framicetina
Paromomicina
Kanamicina
Gentamicina
Tobramicina
Streptomyces
griseus
S. fradiae
S. lavendulae
S. rhimosus
S. kanamyceticus
Micromonospora
monopores
S. tenebrarius
1944
1949
1947
1959
1958
1967
+ + + +
Tetraciclina Tetraciclina
Clorotetraciclin
S. texasi
S. aureofaciens
1953
1946 + + + +

153
a
Dimetilclorotet
raciclina
Oxitetraciclina
S. aureofaciens
S. rimosus 1950
Cloranfenicol Cloranfenicol
Tianfenicol
S. venezuelae
(Síntesis)
1947 + + + +
Macrolidas Eritromicina
Oleandomicina
Espiramicina
Kitamicina
Lincomicina
S. erythraeus
S. antibioticus
S. ambofaciens
S. kitasaensis
S. lincolnensis
1952
1954
1954
1953
1953
+ + + -
Sinergistina Virgimicina S. virgineae
S. pristinae-spiralis 1962 + + + -
Rifamicina Rifamicina SV
Rifampicina
S. mediterranee
S. mediterranee
1948 +
+
+
+
+
+
-
+
Polipéptidos
básicos
Polimixina
Bacitracina
Tirotricina
Bacillus polymyxa
B. licheniformis
B. brevis
1947
1945
1939
-
+
-
+
-
+
+
-
Antibióticos
aislados
Fucidanina
Novobiocina
Vancomicina
Ristocetina
Fusidium
coccineum
S. spheroides
S. orientalis
Nocardia lurida
1955
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
TABLA N°11.2. Clasificación de los principales antibióticos según su modo de acción.
MODO DE ACCIÓN ANTIBIÓTICOS
Inhibición de síntesis de la pared Penicilina
Bacitracina
Novobiocina
Cicloserina
Vancomicina
Ristocetina
Griseofulvina
Acción sobre la membrana Polipéptidicos básicos:
Polimixinas
Bacitracina
Tirotricina
Replicación del DNA Mitomicina
Acido nalidixico
Transcripción del DNA Actinomicina
Novobiocina
Traducción del RNAm
(síntesis de proteínas)
Inhibición de la síntesis
Anomalías en la lectura del código
Macrolidas
Sinergistina
Lincomicina
Tetraciclina
Cloranfenicol
Aminosidas
Leclerc, 1981.

154
Al no poder ensayarse todos los antibióticos existentes, los laboratorios deben limitar la
prueba de susceptibilidad solo a unos pocos antibióticos. Debe hacerse una selección basada
principalmente en la especie aislada, el tipo y lugar de la infección; por lo general son 15 o
menos y, a este grupo de antibióticos se le denomina “panel”. Habitualmente se eligen dos
paneles de antibióticos, uno contra microorganismos Gram positivos y otro para
microorganismos Gram negativos (Tabla 11.3), aunque también se sugieren paneles para
bacterias anaeróbicas, para Pseudomonas aeruginosa, Staphylococccus aureus y Enterococos.
En la mayoría de los casos, cuando el paciente comienza su enfermedad se indica un
antibiótico de amplio espectro (o una combinación de antibióticos) hasta obtener los resultados
acerca de la identificación del germen causal de la infección. Posteriormente, cuando los
resultados del antibiograma están disponibles, puede indicarse un antibiótico más específico.
TABLA N°11.3. Antibióticos comúnmente empleados en pruebas de susceptibilidad
PANEL ANTIBIOTICO
GRAM POSITIVOS
- Ampicilina.
- Cefazolina uno de éstos
- Cefalotina
- Cloranfenicol
- Clindamicina
- Eritromicina
- Gentamicina
- Meticilina
- Nafcilina uno de éstos
- Oxacilina
- Penicilina
- Trimetroprima – sulfisoxasol
- Tetraciclina
- Vancomicina
GRAM NEGATIVOS
- Amicacina
- Ampicilina
- Carbenicilina
- Cefamandol
- Cefoxicitina
- Cefalotina
- Colistina (ojo y oidos)
- Gentamicina
- Neomicina
- Tetraciclina
- Tobramicina
ORINA
- Amicacina
- Ampicilina
- Cefoxitina
- Cefalotina
- Gentamicina
- Nitrofurantoina
- Tetraciclina
- Ticarcilina
- Tobramicina

155
De otro lado, existen ciertos patrones de susceptibilidad comunes bien establecidos por
el uso habitual; por ende, si se identifica un microorganismo con un patrón de susceptibilidad
diferente de lo usual, puede estar indicado repetir la identificación. Para algunos grupos de
antibióticos, es posible escoger un representante y no ensayarlos todos. La Tabla N°11.4 es sólo
orientadora, y debe actualizarse periódicamente.
TABLA 11.4. Elección de antimicrobianos para el antibiograma.
BACTERIA ANTIBIOTICO CRITERIO
Staphylococcus spp • Penicilina G, oxacilina (isoxazolil-penicilinas)
• Cefalotina
• Gentamicina
• Clindamicina, vancomicina, eritromicina
• Trimetoprím+Sulfametoxazol
• Ofloxacina
• Rifampicina
1
1
1
1
1
2
2
Enterococcus spp • Penicilina G o ampicilina
• Estreptomicina, gentamicina
• Vancomicina
• Nitrofurantoína
1
1
1
3
Enterobacterias • Ampicilina o amoxicilina
• Amoxicilina + ácido clavulánico
• Carbenicilina o ticarcilina, piperacilina o
mezlocilina
• Aztreonam, imipenem, meropenem
• Cefalotina o cefuroxima
• Cefoxitina, ceftriaxona, cefotaxima, ceftazidima y
cefepima
• Fosfomicina, trimetoprím+sulfametoxazol
• Acido nalidíxico, pipemídico, nitrofurantoína
1
1
2
2
1
2
2
3
Pseudomonas spp • Carbenicilina o mezlocilina o ticarcilina
• Azlocilina o piperacilina
• Ciprofloxacina
• Ceftazidima
• Imipenem, meropenem
• Tobramicina, amicacina
• Ticarcilina + ácido clavulánico
• Aztreonam
• Fosfomicina
1
1
1
1
1
1
2
2
2
1: Primera elección, 2: Segunda elección, 3: Sólo para infecciones urinarias.
Respecto a la susceptibilidad del microorganismo frente a los diversos antimicrobianos,
ellos pueden ser clasificados como:
1. Sensible: Decimos que un determinado microorganismo es sensible a un antimicrobiano,
cuando la infección que causa el primero responde al tratamiento con ese fármaco a la
dosis recomendada.

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2. Intermedio: Corresponde a dos situaciones:
a) Incluyen aquellas cepas "moderadamente sensibles" a un antibiótico, que puede
aplicarse en dosis altas dada su baja toxicidad o porque puede concentrarse en el
sitio de la infección.
b) Cepas moderadamente sensibles a un antibiótico muy tóxico que no puede aplicarse
en dosis elevadas. En este caso, esta categoría es una zona de transición de lo
sensible a lo resistente (sensibilidad intermedia).
3. Resistente: Indica que no es probable que el microorganismo responda a un
antimicrobiano determinado con independencia de la dosis y la localización de la
infección.
2. PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD POR MACRODILUCION EN CALDO
Esta fue la primera prueba de susceptibilidad desarrollada y consiste en un método de
referencia. El principio se fundamenta en preparar diluciones seriadas del antimicrobiano en
caldo nutritivo o agar; después de la cual se le agrega la suspensión bacteriana tal como se
muestra en la Figura N°11.1.
En dicha figura se observa ocho tubos de prueba, a cada tubo se va agregado una
cantidad de antimicrobiano diluidos en serie. Posteriormente se inocula una suspensión
calibrada del microorganismo en estudio y se incuba a 37°C durante 18–24 h. Al término de este
tiempo, observamos que los tres tubos de la izquierda están claros, mientras que los cinco de la
derecha están turbios, lo que nos indica crecimiento bacteriano.
El punto de ruptura de la inhibición está entre el tubo 3 y 4 (o entre los 4 g/ml y 2
g/ml de antibiótico) en la cual se hallará la MIC, expresada en g/ml que impide el crecimiento
bacteriano in vivo. Para la figura señalada, la MIC se encuentra en alguna concentración entre 4
g/ml y 2 g/ml; por convención la MIC se interpreta, como la concentración de antibiótico
contenida en el primer tubo de la serie que inhibe el crecimiento visible; por lo tanto, para el
ejemplo la MIC es 4g/ml.
A partir de este dato, puede determinarse si es posible tratar una infección causada por
ese microorganismo con ese antimicrobiano. Si la MIC es menor que la concentración de
antimicrobiano que se alcanza en los tejidos de cuerpo humano, el tratamiento puede tener
éxito, y el microorganismo se considera sensible; en caso contrario, fracasará y el
microorganismo se considera resistente.
Otro ejemplo similar lo mostramos en la siguiente figura (Fig. N°11.2), con el detalle que
la MIC no implica necesariamente la inviabilidad de los microorganismos, demostrándose ello a
través de la siembra en agar nutritivo que al cabo de 24 h puede conducir a la aparición de
colonias. Otro concepto que se puede introducir a partir de esta figura es el de “Concentración
Minima Bactericida” (MBC); en la cual, concentraciones mayores de antibiótico ya conducen a la
muerte microbiana, la cual se demuestra por la ausencia de colonias en agar nutritivo, siendo
para el ejemplo la MBC de 32 g/ml.

157
FIGURA 11.1. Serie de tubos de ensayo en la estimación del MIC
FIGURA N°11.2. Otro ejemplo de una serie de tubos de ensayo en la estimación de la
MIC. Asimismo, se muestra el crecimiento en placa, con el objeto de estimar la
Concentración Mínima Bactericida (MBC).
GROWTH
GROWTH
CONTROL
CONTROL
0.25
0.25 0.5
0.5 1
1 2
2 4
4 8
8 16
16 32
32 64
64 128
128
ANTIMICROBIAL CONCENTRATION
ANTIMICROBIAL CONCENTRATION µ
µg/ml
g/ml
ADD 10
ADD 105
5 BACTERIA TO EACH TUBE
BACTERIA TO EACH TUBE
4
4 8
8 16
16 32
32 64
64 128
128
* * *
** *
* *
* * *
** *
* *
* * *
* *
* *
* * *
* *
MBC = 16
MBC = 16 µ
µg/ml
g/ml

158
3. PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD POR DIFUSIÓN EN DISCO (ANTIBIOGRAMA)
El principio de esta prueba se esquematiza en la Figura N°11.3, donde un disco de papel
filtro impregnado con antibiótico, se pone en contacto con la superficie del agar, el agua es
absorbida por el disco y el antibiótico difunde al medio que lo rodea. El promedio de extracción
del antibiótico del disco es mayor que su difusión hacia el medio, de modo que la concentración
inmediatamente adyacente al disco puede exceder a la del disco mismo; sin embargo, a medida
que aumenta la distancia al disco, se produce una reducción logarítmica de la concentración del
antibiótico. Figura N°11.4.
FIGURA N°11.3. El principio de difusión en disco. La concentración de antibiótico disminuye a
medida que aumenta la distancia del disco.
FIGURA N°11.4. Placa de susceptibilidad de antibiótico en disco, que muestra el mismo principio
de la figura anterior. Puede observarse un margen preciso en el área donde la
concentración de antibiótico es insuficiente para evitar el crecimiento
bacteriano.

159
FIGURA N°11.5. Durante la ejecución del antibiograma, debe tenerse la precaución del espesor
del agar Müeller-Hinton, dado que ello conduciría a lecturas erróneas,
La placa debe haber sido previamente inoculada con la suspensión bacteriana en estudio,
iniciándose un crecimiento simultaneo de bacterias en la superficie del agar. Cuando se alcanza
una masa de bacterias crítica, la actividad inhibitoria del antibiótico es superada y se produce el
crecimiento. El tiempo necesario para alcanzar la masa celular crítica es de 4-10 h en las bacterias
estudiadas habitualmente, siendo característico para cada especie e influido por el tipo de medio
de cultivo y temperatura empleada. La amplitud lateral de la difusión antimicrobiana antes que
sea alcanzado el tiempo crítico, será afectada por la profundidad del agar (Figura N°11.5), dado
que la difusión ocurre en tres dimensiones. El punto en el cual se alcanza la masa crítica, aparece
como un círculo marginado bien definido de crecimiento, con el disco en el centro del círculo si la
prueba ha sido realizada correctamente.
La concentración de antibiótico difundido en esta interfase de crecimiento y las
bacterias inhibidas, se conoce como ”Concentración Crítica” y se aproxima a la MIC obtenida en
las pruebas de dilución. En la práctica, no se hace el cálculo directo de la MIC, pero puede
calcularse con razonable exactitud si se conocen las características de la difusión antimicrobiana y
el crecimiento bacteriano.
4. PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD MEDIANTE EL EPSILÓMETRO (ε-TEST )
El epsilómetro o Epsilon-test (ε-test) es un método cuantitativo de determinación in vitro
de sensibilidad a antibióticos por difusión. El sistema consiste en utilizar una tira de plástico que
contiene concentraciones crecientes de un determinado antimicrobiano que van desde 0,016
g/ml hasta 256 g/ml, que difunde en un medio de agar inoculado con el microorganismo
(resultando el método más simple que otros métodos para obtener una MIC) (Figura N°11.7).
Tras la incubación, aparece un área de inhibición de forma elipsoidal (de ahí el nombre de la
técnica). La MIC se lee directamente en una escala dibujada sobre la tira, en el punto donde el
elipsoide de inhibición hace intersección con la tira.
Este es el método de elección para hacer estudios de susceptibilidad en gérmenes
problemáticos o con requerimientos especiales, como por ejemplo Streptococcus pnemoniae,
Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae y gérmenes anaeróbicos.
Mediante esta técnica se puede determinar la sensibilidad a varios antibióticos en la
misma placa, disponiendo las tiras según los radios de la placa (Fig. N°8). En esta práctica se
utilizará un sólo antibiótico, ya que se hace de forma complementaria al método de Kirby-Bauer.
Plate too thin
Plate too thin
Zone too big
Zone too big
Plate too thick
Plate too thick
Zone too small
Zone too small
Plate just right
Plate just right
Zone
Zone
reproducible
reproducible
2 mm
2 mm
4 mm
4 mm
6 mm
6 mm

160
FIGURA N°11.7. Representación esquemática del método del E-test. La flecha indica la zona
donde se lee la Concentración Mínima Inhibitoria.
FIGURA N°11.8. Imágenes de pruebas de susceptibilidad mediante el método del Epsilón Test.
5. MÉTODOS AUTOMATIZADOS
En este momento existen varios sistemas que ofrecen diferentes niveles de
automatización para el estudio de susceptibilidad. Utilizan una medición turbidimétrica o
fluorométrica para detectar crecimiento bacteriano en un medio líquido. La mayoría de ellos
emplea el método de microdilución y períodos de incubación menores que los habituales. Estos
métodos son bastante confiables para el estudio de enterobacterias y otros gérmenes de
crecimiento rápido, pero generalmente no son los adecuados para los de crecimiento lento o con
requerimientos especiales.
Infectious Diseases
Staphylococcus aureus E-test
E-test for Penicillin G. This is not good

161
6. ACTIVIDADES PRÁCTICAS
6.1. PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD DE MACRODILUCIÓN EN CALDO
Material
1 Cultivo bacteriano Escherichia coli en medio líquido (Caldo LB).
2 7 tubos con 1 ml de caldo Müeller-Hinton.
3 Solución de ampicilina (16 μg/ml) en caldo Müeller-Hinton (2 ml).
4 Pipetas de 1 ml y pipetas Pasteur.
Técnica
1 Preparación del inoculo:
2 Esta técnica sólo es aplicable a especies bacterianas en cultivo puro. Por ello,
previamente se procederá si es preciso a hacer un aislamiento de placa.
3 La preparación del inoculo se realiza sembrando una colonia aislada del microorganismo
en estudio en un tubo de caldo Mueller-Hinton e incubando a 37°C durante 24 h.
Preparación de las diluciones de antibiótico
1 Rotular los tubos de caldo Müeller-Hinton: 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 y 0 μg/ml.
2 Pipetear 1 ml del tubo que contiene la solución de ampicilina (16 μg/ml) al marcado con
8.
3 Mezclar bien con movimientos de rotación y transvasar 1 ml al tubo siguiente (4 μg/ml).
4 Repetir el paso anterior hasta llegar al tubo marcado con 0,25 μg/ml, del que se desecha
1 ml.
5 No añadir antibiótico al tubo marcado 0.
Siembra
Tomar una muestra del cultivo de E. coli con una pipeta Pasteur, e inocular una gota en
cada tubo de la serie de diluciones (incluidas las de 16 y 0 μg/ml). Incubar los tubos a 37°C
durante 20 h.
Interpretación
Al día siguiente, observar si hay turbidez en los tubos. De los que no presenten
crecimiento, el que contenga la concentración más baja de antibiótico corresponderá a la MIC. El
tubo que no contiene antibiótico debe estar turbio (control positivo).
6.2. PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD DE DIFUSIÓN EN DISCO - ANTIBIOGRAMA - (MÉTODO DE
BAUER – KIRBY)
Principio
Se sustenta en lo señalado anteriormente, los diámetros de zonas generados por la
prueba no tienen valor sin la referencia a la correlación con la MIC y sin la guía interpretativa
publicada por la NCCLS (National Comité for Clinical Laboratory Standards).
Medio y Reactivos.
1. Aislamiento bacteriano.
2. Caldo nutritivo.
3. Tubo estándar 0.5 de Mc. Farland.
4. Placas de 150 mm con agar Müeller-Hinton (pH 7,2 – 7,4 y la profundidad de 4 mm
aproximadamente.

162
Procedimiento.
1. Con el asa de alambre o un hisopo de Dacron, tocar cuatro a cinco colonias de apariencia
similar y transferirlo a un tubo de ensayo con 4–5 ml de caldo nutritivo.
2. Incubar a 35°C hasta que la turbidez coincida con el estándar 0,5 de Mc. Farland (1,5 X 108
UFC), empleando para tal efecto luz adecuada sobre un fondo blanco.
3. En los quince minutos posteriores al ajuste de la turbidez, sumergir un hisopo estéril en la
suspensión del inoculo y se le rota varias veces, haciendo una presión leve sobre las paredes
del tubo antes de retirar el hisopo.
4. Inocular la superficie seca de la placa de agar Müeller Hinton a temperatura ambiente,
pasando el hisopo tres veces por toda la superficie, rotando la placa aproximadamente 60°
para asegurar la distribución homogénea del inoculo; se espera 3-5 m, pero no más de quince;
para que la superficie del agar se seque antes de colocar los discos de antibióticos.
Método de Cubierta de Agar Alternativo
5. Ajustar la suspensión bacteriana similar al estándar 0,5 de Mc Farland.
6. Adicionar 0.001 ml. de caldo con una asa calibrada a 9 ml. de suspensión acuosa de agar al 1%
a 45° - 50°C.
7. Mezclar el agar sembrado invirtiendo suavemente y se extiende sobre la superficie de la placa
Petri con agar Müeller Hinton.
8. Dejar las placas 3 – 5 m antes de aplicar lo discos de antibióticos.
Prueba de Antibióticos
9. Los discos impregnados con los antibióticos son colocados en la superficie del agar, con la
ayuda de una pinza o dispensador multidisco.
10.Presionar con suavidad cada uno de los discos, garantizando un contacto uniforme y la droga
difunda inmediatamente. Los discos deben tener una distribución pareja, de modo que estén
separados a por lo menos 24 mm de centro a centro.
11.Incubar las placas a 35°C por 16 – 18 h.
Interpretación.
Se efectúa a través de la medida de los diámetros de halos de inhibición; estas pueden
aparecer a las cuatro horas de incubación en aquellas bacterias de crecimiento rápido; sin
embargo, se ha estandarizado para ser leídas a las 16 – 18 h. La medición debe hacerse en la zona
de inhibición completa, mediante calibres deslizantes y/o reglas con aproximación al milímetro.
Todas las mediciones se toman visualmente, sin ayuda de instrumental alguno, mirando el
fondo de la placa con luz reflejada. Las placas de susceptibilidad preparadas con agar sangre
observarse desde la superficie y medirse sin la tapa de la placa, usando otra vez luz reflejada.
La lectura debe suministrar un correlato interpretativo (Susceptible, Moderadamente
Susceptible, Intermedio o resistente) como referencia de los lineamientos publicados. Ver Figura
N°11.6, Tabla N°11.5.
Interacción de antibióticos
La interacción entre dos antibióticos puede resultar en uno de los siguientes cuatro
fenómenos:

163
1. Indiferencia: La MIC de un antibiótico no se modifica con la presencia del otro.
2. Adición: Las actividades se suman. De esta forma es igual agregar la mitad de la concentración
de cada uno que la concentración total de uno solo.
3. Sinergismo: La actividad antibiótica se potencia de tal manera que las concentraciones
mínimas inhibitorias bajan más allá de la mitad de la original.
4. Antagonismo: Se produce un efecto de disminución de la actividad de uno o los dos agentes
antibacterianos.
Errores potenciales del método de difusión.
1. Densidad del inoculo.
2. Momento en que se colocan los discos.
3. Temperatura de incubación.
4. Tiempo de incubación.
5. Tamaño de la placa, espesor del medio y distancia entre los discos.
6. Potencia de los discos de antibióticos.
7. Composición del medio.
8. La presencia de colonias en el interior del halo indica contaminación, cultivo mixto o aparición
de resistencia.
Control de Calidad.
Se emplean cepas de referencia como Staphylococcus aureus, Escherichia coli y
Pseudomonas aeruginosa, las que deben probarse cada vez que se utiliza un nuevo lote de discos
o agares. La decisión definitiva sobre el uso de un determinado antibiótico y la dosificación del
mismo no solo depende de los resultados del laboratorio, sino de la interpretación que el médico
pueda darle y de otros factores, como son la virulencia del microorganismo, efectos secundarios,
farmacocinética del medicamento, difusión en el organismo y estado inmunitario del hospedero.
FIGURA N°11.6. Modelo de informe producto de la solicitud clínica de un “Cultivo y
Antibiograma”.

164
TABLA N°11.4. Criterios de interpretación basados en el método de Kirby-Bauer.

165

166
6.3. PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD MEDIANTE EPSILÓMETRO
Material
1. Una placa con agar Mueller-Hinton.
2. Tiras de ε-test (conservadas congeladas hasta el momento de su utilización).
3. Un tubo con 5 ml de agua destilada estéril.
4. Torundas estériles de algodón.
5. Pinzas.
6. Un cultivo puro del microorganismo problema.
Técnica
1. Utilizar el inoculo preparado como se ha descrito en el apartado anterior.
2. Impregnar la torunda con la suspensión del inoculo y sembrar con ella toda la superficie de la
placa de Mueller-Hinton.
3. Con la ayuda de las pinzas (previamente flameadas y frías) coger una tira de ε- test y colocarla
sobre la superficie del agar. Incubar a 37ºC, 18-24 horas y realizar la lectura de la CMI.
Interpretación.
Leer la CMI sobre la tira de ε-test Interpretar el resultado en términos de sensibilidad o
resistencia, comparando la CMI con las concentraciones críticas indicadas en la Tabla 11.4.
7. CUESTIONARIO
1. Definir un agente antimicrobiano.
2. ¿Qué se entiende por resistencia a los antibióticos?. Susceptibilidad?.
3. ¿Por qué son utilizados cultivos puros para las pruebas de sensibilidad a los
antimicrobianos?.
4. ¿Sería aceptable el uso de un cultivo mixto para esta prueba? ¿Por qué?.
5. Enumere tres factores que pueden influir en la exactitud de la prueba.
6. Cuando se realiza una prueba de dilución en caldo, ¿por qué es necesario incluir un tubo
control de crecimiento? Un tubo de control de la esterilidad?.
7. ¿Cómo puede la concentración mínima bactericida de un agente antimicrobiano se
determina a partir de un ensayo MIC?.

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8. ¿Puede un microorganismo, que es susceptible a un agente antimicrobiano en las pruebas
de laboratorio, no responder cuando la droga es utilizados para tratar al paciente?
Explique.
9. Los agentes antibacterianos, son útiles en las infecciones virales? Explique.
10. ¿Por qué es mejor usar la palabra susceptibles lugar de la palabra sensible en la
descripción de la respuesta de un organismo a un medicamento?
Cuando se habla del paciente, lo que hace la sensibilidad a los fármacos término?.
11. Describa mecanismos de resistencia bacteriana a los antibióticos.
11. Si en el laboratorio se obtienen aislamientos de S. aureus de cinco pacientes el mismo día,
es necesario poner a prueba la sensibilidad a los antimicrobianos de
cada aislamiento? ¿Por qué?.
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. INS -1998- GUÍA DE PRÁCTICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DEL LABORATORIO DE
BACTERIAS DE TRANSMISIÓN SEXUAL. Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública,
1998, Lima Perú.
2. Brock, T.; M. Madigam. -1991- MICROBIOLOGÍA. Edit. Prentice Hall Hispanoamericana.
6ta Edic. 956 pp.
3. Guerci, A. -1985- LABORATORIO: Métodos de Análisis Clínicos y su Interpretación. 3ª
Edición. Edit. El Ateneo. Bs.As. 513 pp.
4. Jawetz, E.; Melnick, J.; Adelberg, A. -1997- MICROBIOLOGÍA MÉDICA. Edit. Moderna.
México. 476 pp.
5. MacFaddin -2003- PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DE
IMPORTANCIA CLÍNICA. Edit. Médica Interamericana. 3ª Edic. Bs.As. Argentina 850 pp.
6. Mendo, M. – 2003 - MEDIOS DE CULTIVO EN MICROBIOLOGÍA. Manual de Laboratorio.
Edic. Laborales SRL. 5ª Edic. Lima-Perú. 237 pp.

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