Este documento presenta dos técnicas para la extracción de ADN: la técnica orgánica, que utiliza reactivos tóxicos pero obtiene ADN de alta calidad, y la técnica inorgánica, que usa reactivos menos tóxicos pero requiere más muestra. A continuación, detalla los pasos de cada técnica, incluyendo la maceración del tejido, el uso de fenol, cloroformo y etanol para aislar y precipitar el ADN.
María Ángeles Baridon: Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicosBiocientificaSA
Presentación de María de los Ángeles Baridon: "Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos" en el Curso Básico y Taller de PCR en Tiempo Real. HIGA Rossi La Plata, 22 y 23 de Noviembre, 2012.
Organiza: Laboratorio de Virología y Biología Molecular
H.I.G.A. R. Rossi - La Plata.
Auspicia: Servicio de Docencia e Investigación - HIGA Rossi La Plata y Comunidad Vita - Biocientífica S.A.
Enzimología: Estudio de la Actividad de L-lactato: NAD+ Oxidos-Reductasa en el Higado del Animal de Experimetación.
UDO Bolívar.
Por:
Br. Durant, Carlos
Br. Lunar, Xiolimar
Br. Rodríguez, Jorge
Br. Velásquez, Karina
María Ángeles Baridon: Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicosBiocientificaSA
Presentación de María de los Ángeles Baridon: "Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos" en el Curso Básico y Taller de PCR en Tiempo Real. HIGA Rossi La Plata, 22 y 23 de Noviembre, 2012.
Organiza: Laboratorio de Virología y Biología Molecular
H.I.G.A. R. Rossi - La Plata.
Auspicia: Servicio de Docencia e Investigación - HIGA Rossi La Plata y Comunidad Vita - Biocientífica S.A.
Enzimología: Estudio de la Actividad de L-lactato: NAD+ Oxidos-Reductasa en el Higado del Animal de Experimetación.
UDO Bolívar.
Por:
Br. Durant, Carlos
Br. Lunar, Xiolimar
Br. Rodríguez, Jorge
Br. Velásquez, Karina
Universidad de Carabobo - Facultad de Ciencias de la Salud sede Carabobo - Bioanálisis. Técnicas en Biología Molecular. Unidad 1: Extracción de ácidos nucleicos.
Universidad de Carabobo - Facultad de Ciencias de la Salud sede Carabobo - Bioanálisis. Técnicas en Biología Molecular. Unidad 1: Extracción de ácidos nucleicos.
El diagnóstico molecular está basado en el análisis de los ácidos nucleicos ADN y ARN. El análisis de ADN permite obtener información de la estructura de un gen, mientras que el análisis del ARN aporta la información funcional sobre la expresión de una proteína. En la presente actividad de laboratorio se realizó la extracción de ADN de cepas de Trichoderma longibrachiarum (LIG052), Trichoderma atroviride (LIG042), Botrytis sp. (LIG035) y Stromatinia cepivorum (LIG020), y para ARN se empleó una cepa de Trichoderma harzianum (LIG064). La extracción de ADN se practicó utilizando el protocolo modificado para extracción de ADN de Crinipellis, y para ARN el protocolo de extracción de ARN de fruto de fresa, ambos propuestos por el Laboratorio de Investigaciones Genéticas UNET. Se verifico la calidad de las muestras mediante electroforesis en gel de agarosa 1%, observándose un recorrido difuso de las bandas electroforéticas debido a fallas reveladas durante el proceso.
- Directo o en fresco.
1. Obtén una muestra fresca de heces en un recipiente limpio y seco.
2. Utiliza un hisopo o una espátula limpia para tomar una pequeña porción de la muestra.
3. Coloca la muestra en un portaobjetos limpio y añade una gota de solución salina o agua destilada.
4. Cubre la muestra con un portaobjetos o una cubierta protectora.
5. Observa la muestra bajo el microscopio, utilizando diferentes aumentos para detectar parásitos móviles como Giardia o Trichomonas.
2. Establecer relaciones filogenéticas entre individuos/ especies/ seres vivos.
Diagnóstico de enfermedades.
Evaluar los niveles de expresión génica.
Modificar genéticamente organismos.
Etc.
3. Cantidad del material de partida.
Condiciones en las que se encuentra dicho material.
Contaminantes e interferentes en el material biológico.
4. Contaminación por material biológico humano.
Contaminación microbiológica.
Contaminacion química.
5. Técnica Orgánica (Solventes)
ADN de muy buena calidad y cantidad.
Péptidos y proteínas son extraídas en la fase orgánica (Fenol), después se
realiza digestión con proteinasa K.
El cloroformo permite que todo el fenol pueda ser lavado.
DESVENTAJAS:
Reactivos altamente tóxicos.
Pérdidas significativas de ADN y mucho mas si esta degradado.
6. Técnica de tipo inorgánica
Utiliza reactivos bajos en toxicidad
Permite visualizar la malla del ADN.
Desventajas:
Requiere una mayor cantidad de muestra.
7.
8. 1.Pesar 1 g de tejido fresco
2.Macerar el tejido en un mortero utilizando nitrógeno líquido.
3.Agregar 2 ml de solución de cloruro de guanidinio (2 volúmenes por 1 de muestra) y
mezclar por inversión.
4.Agregar 2 ml de fenol:cloroformo (1 vol. Fenol + 1 vol. Cloroformo), mezclar y
centrifugar a 10,000 rpm por 45 minutos a 4 °C.
5.Transferir la fase superior a un tubo limpio y repetir el paso 4, pero centrifugando 15
min.
6.Agregar 0.7 ml (0.7 vol.) de etanol absoluto y 0.2 vol. De ácido acético 1M.
7.Incubar toda la noche a -20 °C para precipitar el RNA.
9. 8. Centrifugar a 10,000 rpm por 10 minutos y desechar el sobrenadante.
9. Lavar la pastilla con acetato de sodio 3M pH= 5.2.
10. Centrifugar 5 min. a 13,000 rpm y 4 °C.
11. Agregar 400 µl de etanol al 70% y lavar la pastilla.
12. Centrifugar por 3 minutos y eliminar el sobrenadante.
13. Resuspender la pastilla con agua destilada estéril y almacenar a -20 °C.
10. 1. Moler el tejido hasta obtener un polvo fino con Nitrógeno líquido.
2. Adicionar 1 ml de TRIzol por cada 100 mg de micelio. Seguir moliendo 1 min más y
descongelar hasta que esté a punto de atole.
3. Transferir 1 ml de atole a cada tubo Eppendorf nuevo y estéril con una punta para pipeta
cortada de la punta.
4. Incubar durante 5 minutos a 24 °C.
5. Adicionar 200 µl de Cloroformo/Alcohol Isoamílico 24:1 y agitar en vortex durante 15
segundos.
6. Incubar durante 3 minutos a 24 °C.
7. Centrifugar a 12,000 rpm durante 10 minutos a 8 °C.
8. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo (capa superior incolora).
9. Precipitar adicionando 500 µl de alcohol isopropílico. Agitar en vortex durante 5
segundos e incubar durante 10 minutos a 24 °C.
11. 10. Centrifugar a 12,000 rpm durante 10 minutos a 8 °C. Se verá una pequeña pastilla en el
fondo del tubo. Colocar los tubos en hielo.
11. Desechar el sobrenadante por decantación. Eliminar el liq. remanente con una pipeta.
12. Lavar la pastilla adicionando 500 µl de etanol al 70% (preparado con agua con DEPC).
13. Centrifugar a 12,000 rpm durante 10 minutos a 8 °C. Colocar los tubos en hielo.
14. Desechar el sobrenadante por decantación e invertir el tubo sobre una sanita para
eliminar el líquido residual.
15. No dejar secar por mucho tiempo la pastilla.
16. Adicionar 10-20 µl de agua con DEPC y resuspender la pastilla pipeteando de 20 a 30
veces. Colocar los tubos en hielo.
17. Almacenar en el Revco a -70 °C.