Este documento describe los conceptos básicos de la cinética enzimática, incluyendo el modelo de Michaelis-Menten, la ecuación de Michaelis-Menten y la representación de Lineweaver-Burk. También cubre los diferentes tipos de inhibición enzimática como la competitiva, no competitiva y acompetitiva, así como los parámetros cinéticos asociados a cada tipo de inhibición.

1. Introducción: Cinética enzimática.
Ecuación de Michaelis-Menten.
Ecuación de Lineweaver-Burk.
Reacciones con múltiples substratos.
Inhibición enzimática:
- Reversible
Competitiva.
No competitiva.
Acompetitiva.
- Irreversible. Ejemplos de inhibidores irreversibles
TEMA 11.- CINÉTICA ENZIMÁTICA

2. Perfil cinético de un enzima alostérico
Perfil cinético de un enzima micaeliana
Introducción. Cinética enzimática
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas
por enzimas.

3. Modelo Cinético de Michaelis-Menten
• Las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas:
Primera etapa, se forma el complejo enzima-sustrato.
Segunda etapa, el complejo enzima-sustrato se transforma en el producto,
liberando el enzima.
• V1 = k1 [E] [S]
• V2 = k2 [ES]
• V3 = k3 [ES]
[E] = [ET] - [ES]
• En equilibrio la V de formación de ES es igual a la velocidad de descomposición.
V1 = V2 + V3
k1[S] [E] = (k2 + k3 )[ES]
donde la expresión (k2+ k3)/k1 se ha sustituído por KM, o constante de Michaelis-Menten

4. • La velocidad máxima (Vmax) se obtiene cuando el enzima está saturada por el S.
Vmax = k3 [ET]
• La velocidad de reacción = la velocidad de formación del producto:
v = v3 = k3 [ES] =
• Si introducimos el parámetro Vmax en la ecuación general de la velocidad
obtenemos la expresión más conocida de la ecuación de Michaelis-Menten:
Modelo Cinético de Michaelis-Menten

5. KM es la concentración de sustrato
para la cual la velocidad de reacción
es la mitad de la velocidad máxima.
En efecto, si KM = [S], la ecuación de
Michaelis-Menten se reduce a:
v = Vmax/2.
La representación gráfica de la ecuación de
Michaelis-Menten (v frente a [S]) es una hipérbola
El valor de KM da idea de la afinidad
del enzima por el sustrato: A menor
KM, mayor afinidad del enzima por el
sustrato, y a mayor KM, menor
afinidad.
Modelo Cinético de Michaelis-Menten

6. Para determinar gráficamente los valores de KM y Vmax es más sencillo utilizar la
representación doble recíproca (1/v frente a 1/[S]), ya que es una línea recta. Esta
representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk
1
Vmax
v =
Vmax • [S]
Km + [S]
y= m. x + b
v
1
[S]
1
Km
- 1
• pendiente es KM/Vmax
• abscisa en el origen es -1/KM
• ordenada en el origen es 1/Vmax
v
1
[S]
1 1
Vmax
+
=
Km
Vmax
[ ]
KM/Vmax
A partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores
de KM y Vmax de un enzima para diversos sustratos.
Representación de Lineweaver-Burk

7. Reacciones con múltiples substratos
a) Reacción enzimática con formación de un complejo ternario (ES1S2)
b) Reacción enzimática en la que no se forma de un complejo ternario
Mecanismo ping pong
a.1. Unión aleatoria de los S
a.2. Unión ordenada de los S

8. Inhibidor: Efector que se une al enzima y hace disminuir su actividad,
mediante interacciones con el centro activo u otros centros específicos.
Se excluyen todos aquellos agentes que inactivan a la enzima a través de desnaturalización
de la molécula enzimática.
Dos tipos de inhibidores:
* Inhibidores reversibles: establece un equilibrio con la enzima libre,
con el complejo enzima-substrato, o con ambos.
- COMPETITIVOS: El inhibidor se fija al centro activo de
la enzima libre, impidiendo la fijación del sustrato.
- NO COMPETITIVOS: El inhibidor se fija a la enzima
independientemente de que lo haga o no el sustrato. No
impide la fijación del sustrato a la enzima, pero sí la acción
catalítica.
- ACOMPETITIVOS: El inhibidor se fija únicamente al
complejo enzima-sustrato una vez formado, impidiendo la
acción catalítica
* Inhibidores irreversibles: modifican químicamente a la enzima mediante
uniones covalentes.
Inhibición Enzimática

9. I
E ES
EI
S
E + P
Características:
-Las fijaciones de sustrato e inhibidor son mutuamente excluyentes.
- A muy altas concentraciones de sustrato desaparece la inhibición.
- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo estructural del sustrato.
- El inhibidor es tan específico como el sustrato.
Ki =
[E] [I]
[EI]
Inhibición competitiva
Se define una constante de equilibrio
de disociación del inhibidor
Inhibición reversible
Inhibición Enzimática

10. ´
Representación directa
Inhibición competitiva
s
0 20 40 60 80 100 120
v
0
20
40
60
80
100
120
Con Inhibidor
Sin Inhibidor
Inhibición competitiva
Km´= Km (1+[I]/Ki)
v =
Vmax • [S]
Km 1+[I] + [S]
Ki
[ ]
´
Inhibición reversible
Inhibición Enzimática

11. 1/s
-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
1/v
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
-1/Km
-1/(Km(1 + i/Ki))
1/Vmax
Inhibición competitiva - Representación recíproca doble
Inhibición Enzimática

12. COO-
CH2
CH2
COO-
FAD FADH2
COO-
CH
CH
COO-
Succinato Fumarato
SDH
Succinato
deshidrogenasa
Ejemplo de inhibición competitiva
COO-
CH2
COO-
Malonato
COO-
C O
CH2
COO-
Oxalacetato
Inhibidores
competitivos
Inhibición Enzimática

13. E ES
EI
I
S
E + P
I
ESI
S
- El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre (E) y al complejo
enzima-sustrato (ES)
- Ni el complejo EI ni el complejo ESI son productivos
Características:
Inhibición no competitiva
Inhibición reversible
Inhibición Enzimática

14. Vmax’ Vmax
Vmax’ = Vmax /(1+[I]/Ki)
Vmax . [S]
V´ =
Km . (1+[I]/Ki) + [S] . (1+[I]/Ki)
Vmax´= Vmax/(1+[I]/Ki)
Inhibición no competitiva
Inhibición reversible
Inhibición Enzimática

15. - El I sólo se une al complejo ES y en
un sitio distinto al que se fija el S en el centro
activo
- Baja la Km y Vmax, pero el cociente
Km/Vmax no se altera.
-Ocurre en reacciones multisustratos
El lugar de unión del I se crea
tras la unión del S al E
Inhibición acompetitiva o mixta
Inhibición reversible
Inhibición Enzimática

16. Inhibición acompetitiva
Inhibición reversible
Inhibición Enzimática
Inhibición acompetitiva o mixta

17. Inhibición Irreversible
- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima,
modificándola covalentemente
E + I E’
- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos.
- Una clase especial de inhibidores irreversibles son los Inhibidores suicidas:
Son poco reactivos hasta que se unen al centro activo del enzima, donde se
transforman en un compuesto muy reactivo, inactivando irreversiblemente al enzima.
Inhibición Enzimática
Algunos tipos de inhibidores irreversibles:
1. Reactivos de grupos -SH
2. Organofosforados
3. Ligandos de metales
4. Metales pesados

18. Compuestos organofosforados
CH CH2 OH
Ser
P
F O
CH
CH
H3C CH3
CH3
H3C
CH CH2 O P O
CH
CH
H3C CH3
CH3
H3C
Ser
Diisopropil
fluorofosfato
(DFP)
- Actúan sobre enzimas serínicas (serin proteasas, acetil colinesterasa...),
uniéndose covalentemente a través del grupo fosfato.
Ejemplos: DFP, Insecticidas (Paration, Malation)
Gases de guerra (Sarín), gas mostaza.
Malation
Ejemplos de inhibidores irreversibles
Inhibición Enzimática

19. Penicilinas. Inhiben enzimas serínicas que participan
en la formación de la pared bacteriana.
Ión cianuro, CN-: Se fija con gran afinidad a la sexta posición de
coordinación del Fe hemínico del complejo citocromo oxidasa.
Ejemplos de inhibidores irreversibles
Inhibición Enzimática

20. Inhibidor suicida (Inhibidores activados enzimáticamente)
- Se trata de moléculas que se unen al centro activo de manera específica, igual
que el substrato o los inhibidores competitivos
- Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la molécula en una especie
química muy reactiva que modifica covalentemente a la enzima, inactivándola
- Tienen por tanto la especificidad del inhibidor competitivo y la potencia de los
inhibidores irreversibles
Inhibición Enzimática
E + I EI EI* E’ + I*
1 2 3
Modo de acción de los inhibidores suicidas
1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el sustrato o un inhibidor competitivo convencional.
2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie altamente reactiva I*.
3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola de forma definitiva al igual que un
inhibidor irreversible.

21. Ejemplo de inhibidores suicidas
Sistema de la β
β
β
β-lactamasa bacteriana
La utilización masiva de antibióticos β
β
β
β-lactámicos (penicilinas,derivados semisintéticos y
cefalosporinas) ha conducido a la aparición de resistencias a los mismos.
Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son por producir una enzima, la
β
β
β
β-lactamasa, que inactiva a los antibióticos β-lactámicos.
Inhibición Enzimática
R CO NH
S
N
O
CH3
CH3
COO-
R CO NH
S
HN
CH3
CH3
COO-
C
O
O-
β
β
β
β-Lactamasa
Penicilina (activa)
Ác.peniciloico (inactivo)
Con frecuencia los preparados de penicilinas se formulan
añadiendo un inhibidor suicida de la β
β
β
β-lactamasa, el
ácido clavulánico
O
N
O
COO-
C
CH2OH
H
β
β
β
β-Lactamasa
O
HN
COO-
C
CH2OH
H
C
O
O-
O
HN
COO-
C
CH2OH
H
C
O
O
CH2
CH
Ser
Esta molécula reacciona con la
serina activa de la β
β
β
β-lactamasa,
produciendo su inactivación
Ác.clavulánico

22. Resumen de los parámetros cinéticos de las reacciones enzimáticas:
efecto de los distintos tipos de inhibición.
Tipo de inhibición Ecuación de velocidad Km Vmáx
Sin inhibidor
Inhibición competitiva
Inhibición no competitiva
Inhibición acompetitiva o
mixta
Vmáx . [S]
V = Km Vmáx
Km + [S]
Vmáx . [S]
V = Km (1+[I]/Ki) Vmáx
Km . (1+[I]/Ki) + [S]
Vmáx . [S]
V = Km Vmáx/(1+[I]/Ki)
Km.(1+[I]/Ki)+[S].(1+[I]/Ki)
Vmáx . [S]
V = Km/(1+[I]/Ki) Vmáx/(1+[I]/Ki)
Km +[S].(1+[I]/Ki)
Inhibición Enzimática