3. Secuenciación de DNA
Método enzimático de terminación de cadena
(método dideoxi de Sanger)
• Polimerización interrumpida de ADN
• Se lleva a cado polimerización de ADN en
presencia de derivados dideoxi que detienen la
polimerización en diferente momento,
obteniéndose fragmentos de diferente tamaño.
• Se examinan en electroforesis, se “lee”
secuencia directamente del gel
16. Phred Quality Values
• Phred : Software que realiza el basecalling.
Q = -10 log(Pe)
Phred quality
score
Probability that
the base is called
wrong
Accuracy of the
base call
10 1 in 10 90%
20 1 in 100 99%
30 1 in 1,000 99.9%
40 1 in 10,000 99.99%
50 1 in 100,000 99.999%
20. Introducción a la SBS
• Secuenciación por Síntesis
• Enzimas:
– Ligasa
– Polimerasa
• Tipo:
– Single Molecule
– Basada en ensamble
• Ejecución:
– Tiempo Real
– Controlada Sincrónicamente
22. • Se fragmenta el DNA
• Se reparan los
extremos
• Se agregan los
adaptadores
Illumina - SBS
23. • Se agrega el DNA a la
placa
• Se hibrida
aleatoriamente con los
adaptadores que estan
en la placa
Illumina - SBS
24. • Se agregan NTPs sin
marcar y DNA
polimerasa.
• Comienza la
amplificación
Illumina - SBS
25. • Se denatura el DNA y
se vuelve a realizar la
amplificación puente.
• Se han generado
millones de Clústers en
la placa.
Illumina - SBS
26. • Se agregan los dNTPs,
cada uno posee un
fluoroforo de color
particular:
– G - Amarillo.
– C – Azul
– A – Rojo
– T - Verde
• Se excita con un laser y
se captura una imagen.
Illumina - SBS
27. • Se excita con un laser y
se captura una imagen.
• La imagen capturada
en una posición
específica corresponde
al primer nucleótido.
Illumina - SBS
34. • Cada Perla ‘bead’
contiene miles de
adaptadores, pero solo
se le adhiere
un fragmento de DNA
que queda atrapado en
una emulsión que
contiene en su interior
los elementos para una
PCR.
Roche 454- Pirosecuenciación - SBS
35. • El DNA se amplifica en
esta emulsión
Generando cientos de
copias en cada perla
Roche 454- Pirosecuenciación - SBS
36. • Estas son puestas en la
PicoTiter Plate (PTP). El
diseño de esta permite
una bead por orificio.
Roche 454- Pirosecuenciación - SBS
44. Secuenciación por Semiconducción
• Matriz de alta
densidad de pozos
que permiten
generar este
proceso
paralelamente
• Cada pozo secuencia
una hebra.
51. Aplicaciones – Tecnologías de
Secuenciación
• De novo Genome Assembly
• Secuenciación completa del genoma de un
organismo, sin referencia previa.
52. Aplicaciones – Tecnologías de
Secuenciación
• De novo Genome Assembly (454 o Illumina)
• Secuenciación completa del genoma de un
organismo, sin referencia previa.
• Tamaño del Genoma
• Coverage esperado
• Coverage real
• Complejidad del Genoma
• Capacidad de Cómputo
53. Panda Genome
• 2.25 Gigabases -> 2.250.000.000 de
núcleotidos cubrieron el 94% del genoma.
• Sólo se utilizo Illumina.
• Se utilizaron especies de referencia para
formar los cromosomas.
55. Aplicaciones – Tecnologías de
Secuenciación
• Metagenómica (454)
• Estudio de los metagenomas, secuenciación
del material genetico obtenido desde el
ambiente / organismo.
• Clasificación Taxonómica
• Perfil Metabólico
57. Aplicaciones Tecnologías de
Secuenciación
• Genome Mapping (Illumina / SOLiD)
• Secuenciación con referencia, permite
identificar variantes inter/intra especies.
Variaciones estructurales, cambios en los
genomas.
• SNPs
• Variantes estructurales
58. Aplicaciones Tecnologías de
Secuenciación
• RNA –Seq Mapping (Illumina / SOLiD)
• Identificar expresión diferencial,
secuenciación del transcriptoma en diferentes
condiciones
• Expresión Diferencial
• SNPs
• Isoformas
59. Aplicaciones Tecnologías de
Secuenciación
• RNA –Seq De novo (Illumina)
• Identificar expresión diferencial, secuenciación
del transcriptoma en diferentes condiciones,
reconstrucción del transcriptoma en un
organismo, condición específico
• Obtención transcriptoma
• Expresión Diferencial
• SNPs