Protocolo de prácticas

1. Metabolismo de carbohidratos
Introducción
Los carbohidratos son biomoleculas con estructura química de polihidroxialdehídos o
polihidroxicetonas. Este grupo constituye a las biomoleculas mas abundantes de la naturaleza que
representan a mas del 50% del carbono orgánico y 0.3% del peso corporal en el ser humano. Son los
nutrimentos mayoritarios de la dieta normal y proporcionan 50 a 60% del consume calórico total.
Las funciones biológicas de los carbohidratos consisten en la fuente energética principal en el
humano, como la glucosa; son los elementos estructurales, como la celulosa y la quitina en vegetales e
insectos, respectivamente; son precursores de biomoleculas complejas, como los ribonucleótidos, que
contienen ribosa; almacenan energía, ya sea en forma de almidón en los vegetales, que es la fuente
principal de carbohidratos en la dieta, o de glucógeno en los animales. (En el humano los depósitos de
glucosa y glucógeno son: hígado, 75g Glno; músculo, 250g Glno y plasma 10g Glu).
Fuentes de glucosa (carbohidratos)
El individuo puede ingerir los carbohidratos en forma de monosacáridos y disacáridos, también
denominados azucares simples, o como polisacáridos o azucares complejos. Los primeros sufren poco
o nulo procesamiento digestivo y por lo tanto se absorben rápido en el intestino, lo que ocasiona
elevación súbita de la glucosa sanguínea o la glucemia; en cambio, los azucares complejos sufren
mayor procesamiento digestivo y son absorbidos mas lentamente y ocasionan menor elevación de la
glucemia. Por lo tanto, el tipo de carbohidratos ingeridos tiene repercusion en la regulación de la
glucemia del paciente diabético. En este se encuentra alterada la producción de insulina o la acción
de la misma para mantener la glucosa sérica en los parámetros normales. Por ello, los carbohidratos
complejos son los más adecuados en estos pacientes.
Fuentes de glucosa sanguínea
durante un día normal. Entre las
comidas, la glucosa sanguínea procede
principalmente del glucógeno hepático.
Según la frecuencia de las ingestas, la
glucogenolisis y la gluconeogénesis
pueden ser más o menos activas durante
el día. Al final del día o durante la
madrugada, tras el agotamiento de una
fracción importante del glucógeno
hepático, la gluconeogénesis es la
principal fuente de la glucosa
sanguínea.
La glucemia se mantiene en límites muy estrechos (60 a 100 mg/dl), incluso durante los estados
postprandial, de ayuno o de inanición. ¿Cómo se repone la glucosa plasmática en estos casos? La
insulina disminuye la glucemia al favorecer el ingreso de la glucosa al hígado, músculo y tejido
adiposo, entre otras acciones (postprandial). Por otra parte, las hormonas contrarreguladoras de la
insulina, como glucagón, adrenalina y glucocorticoides (ayuno e inanición), elevan la glucemia al
activar la glucogenolísis, gluconeogénesis, lipolisis y proteolisis, así como al reducir la utilización

2. periférica de la glucosa. La función de mantener la normoglucemia (glucemia normal) es fundamental
debido a que el cerebro, los eritrocitos y otras células del organismo utilizan como combustible
principal a la glucosa. (De los 200g de glucosa que ingerimos diariamente; aproximadamente 160g,
son consumidos por neuronas y eritrocitos). Las consecuencias del déficit o ausencia de glucosa en
estos tejidos son catastróficas.
Alteración del metabolismo de la glucosa
Cuando el organismo pierde la capacidad de regular la glucemia, la glucosa plasmática se eleva; a
este trastorno se le denomina diabetes mellitus. Esta enfermedad es muy grave y frecuente, ya
conocida desde la antigüedad. Una alteración bioquímica muy importante y común a todas las
variedades de esta enfermedad es la híperglucemia. "La diabetes mellitus es la enfermedad sistémica,
crónico degenerativa, de carácter heterogéneo, con grados variables de predisposición hereditaria, con
participación de factores ambientales, que se caracteriza por hiperglucemia crónica debido a la
deficiencia en la acción o producción de insulina, lo que afecta el metabolismo intermedio de
carbohidratos, proteínas y grasas".

3. Criterios diagnósticos de intolerancia a la glucosa y diabetes
1. Glucosa plasmática en ayunas <110 mg/dl (<6,1 mM) = glucosa normal.
2. Glucosa plasmática en ayunas ≥110 mg/dl y ≤126 mg/dl (entre 6,1 mM y 7 mM) = glucemia
anormal de ayuno.
3. Glucosa plasmática en ayunas ≥ l26 mg/dl (ó ≥7.0 mM) = diagnóstico provisional de diabetes
para ser confirmado.
4. Alteración del PTOG ≥ 140 mg/dl e inferior a 200 mg/dl (entre 7,8 mM y 11,1 mM); 2 horas
después de la carga de 75 g/ 300 ml de glucosa
Diabetes Mellitus
1) Criterio 1. Glucemia al azar ≥ 200 mg/dl ( ≥11,1 mM)
2) Criterio 2. Glucemia en ayunas ≥ 126 mg/dl ( ≥ 7 mM)
3) Criterio 3. Glucemia entre 140 mg/dl y 200 mg/dl (entre 7,8 mM y 11,1 mM ó mayor)
durante PTOG
• Si se cumple uno de los criterios el diagnóstico es provisional; se tiene que confirmar al día
siguiente con otro criterio.
• El criterio 1 es suficiente si se acompaña de los síntomas característicos de la diabetes: poliuria,
polidipsia y pérdida de peso injustificada.

4. Resistencia a la insulina (prediabetes)
La resistencia a la insulina (RI) se puede definir como disminución de la acción biológica de la
hormona con respuesta compensatoria de hiperinsulinemia. La combinación de estas dos condiciones,
RI e hiperinsulinemia, induce al desarrollo de un conjunto de alteraciones que evolucionan a otras
enfermedades crónicas. Por ello, la detección del estado de RI tiene aplicación en la identificación de
individuos en riesgo de desarrollar la enfermedad, con objeto de prevenir su aparición.
Existen varios métodos para el diagnostico de individuos con RI, entre ellos:
1. Medición de la concentración de insulina sanguínea en ayunas como expresión de la sensibilidad
a la hormona (opcional).
2. También se han propuesto diversas formulas para la estimación de RI; una de las mas utilizadas
es el análisis del modelo homeostático, mas conocido como índice HOMA (por sus siglas en ingles).
[Insulina de ayuno (µU/ml)] x [glucosa de ayuno mmol/L]
HOMA- IR= -------------------------------------------------------------------------------------22.5
La formula para el cálculo de HOMA cuando se utilizan mg/dl de glucosa queda de la siguiente
manera:
[Insulina de ayuno (µU/ml)] x [glucosa de ayuno mg/dl]
HOMA- IR= -------------------------------------------------------------------------------------405
3. En la práctica clínica cotidiana, los métodos mas simples y económicos para estimar la RI son la
concentración sanguínea de triglicéridos (TG) y el valor de la relación TG/HDL-colesterol. Los
puntos de corte son los siguientes:
Nivel circulante de triglicéridos ≥ 130 mg/dl
Relación TG/HDL-c ≥ 3.0
Pruebas bioquímicas en el diagnóstico de la diabetes
• Hemoglobina glucosilada
• Glucosa en ayunas
• Glucosa posprandial
• Curva de tolerancia a la glucosa
Hemoglobina glucosilada
La elevación continua y prolongada de la glucemia, característica de la diabetes, origina la
glucosilación no enzimática de las proteínas del organismo. Esta modificación química de las
proteínas causa alteraciones en sus funciones y estructuras, lo que tiene relevancia en las
complicaciones crónicas de la diabetes. La hemoglobina glucosilada (HbA1c) y la albúmina
glucosilada son las proteínas circulantes en la sangre, con aplicación en el diagnostico y pronostico
de la diabetes. La concentración de HbA1c se utiliza en la clínica como criterio del control de la
glucemia durante seis a ocho semanas previas a la prueba.

5. DETERMINACION CUANTITATIVA DE GLUCOSA: METODO DE LA GLUCOSA
OXIDASA / PEROXIDASA
La hiperglucemia se puede determinar fácilmente en un laboratorio de bioquímica y por ello la
determinación de glucosa en fluidos biológicos, como sangre u orina, tiene interés diagnostico.
Los métodos analíticos enzimáticas, basados en la utilización de enzimas como reactivos,
permiten la determinación rápida, especifica y sensible de la concentración de glucosa, y son
ampliamente utilizados en los laboratorios clínicos como herramienta bioquímica fundamental en el
diagnostico de la diabetes.
En esta práctica se realizara la determinación cuantitativa de glucosa en muestras de suero que
simulan el resultado que se obtiene cuando pacientes diabéticos y sujetos sanos se someten a una
prueba clínica conocida como prueba de tolerancia oral a la glucosa (PTOG). En esta prueba, en su
forma mas completa, los sujetos (tras un ayuno de 10 horas) beben una cantidad normalizada de
glucosa (75 g en 300 ml de agua) y se determina la concentración de glucosa en suero sanguíneo a
intervalos de tiempo de 30 minutos hasta 2 horas.
FUNDAMENTO
En el método de la glucosa oxidasa/peroxidasa la glucosa presente en muestras de suero u orina
origina, según las siguientes reacciones acopladas, un compuesto coloreado que puede ser fácilmente
cuantificado haciendo uso de un colorímetro o espectrofotómetro.

6. 1)
Glucosa oxidasa
β-D-Glucosa + O2 + H2O ———————>
Acido glucónico + H2O2
Peroxidasa
2) 2 H2O2 + Fenol + 4-Aminoantipirina ——————> Quinonaimina + 4 H2O
Reacción 1: La glucosa presente en la muestra es oxidada a acido glucónico y peroxido de hidrogeno
por el enzima glucosa oxidasa.
Reacción 2: Reacción indicadora. A partir del peroxido de hidrógeno (producido por la reacción 1),
fenol y 4-aminoantipirina, el enzima peroxidasa genera el compuesto coloreado quinonaimina. La
absorbancia del cromóforo quinonaimina (A500) es proporcional a la concentración de glucosa de la
muestra.
MATERIALES Y REACTIVOS
- Colorímetro y baño termostatizado a 37 °C
- Tubos de ensayo desechables de 10 mL, cubetas de colorímetro y guantes
- Pipetas automáticas y puntas de pipeta,
- Reactivo de glucosa oxidasa con la siguiente composición:
Tampón fosfato 250 mM, pH 7.5; fenol 5 mM; 4-aminoantipirina 0.5 mM;
glucosa oxidasa > 15 kU/L; peroxidasa >1 kU/L
- Estándar de glucosa 5.50 mM.
- Muestras simulando situaciones de normoglucemia e hiperglucemia en humanos sometidos a una
PTOG. Series de muestras A y B.

7. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Disponer en una gradilla 14 tubos desechables; rotularlos y añadir en ellos, los volúmenes de los
reactivos indicados en la tabla siguiente:
TUBOS
Blanco Control 1A 2A 3A 4A 5A 6A -- 1B 2B 3B 4B 5B 6B
H2O (µl)
10
Suero control (µl)
10
Suero A (µl)
10 10 10 10 10 10
Suero B (µl)
10 10 10 10 10 10
Reactivo (ml)
1,0
1,0
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Absorbancia 500
[glucosa] (mM)
[glucosa] (mg/dL)
Tiempo* (min)
0 30 60 90 120 150
0 30 60 90 120 150
(*) Tiempo transcurrido entre la ingesta de glucosa (75 g/300 ml) y la toma de la muestra
sanguínea.
Agitar brevemente los tubos después de las adiciones e incubar a 37 ºC durante 5 minutos. Leer
A500 frente al blanco e introducir los valores en la tabla; a partir de los valores de absorbancia,
calcular las concentraciones de glucosa para cada tubo y re (ver resultados) e incluirlas en la tabla.
RESULTADOS
Cálculo de la concentración de glucosa (mM y mg/dL) en las muestras y representación grafica de
los resultados:
[Glucosa] muestra = [(A500 muestra / A500 control)] x [Glucosa] control
La concentración de glucosa en el suero control es 5.50 mM (100 mg/dL)
1) Construir un gráfico representando las concentraciones de glucosa (mM y mg/dL) en función del
tiempo en las muestras de las series A y B.
2) Identificar los perfiles obtenidos con los esperados para sujetos sanos y diabéticos.
3) Calcular la concentración de glucosa en la disolución ingerida por los sujetos sometidos a la PTOG.
4) Hacer un esquema de la cascada de transducción de señal del receptor de la insulina.