1. Campus Tuxtepec
Ingeniería en Biotecnología
Universidad del Papalopan
“ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA DE EXTRACTOS DE HOJAS DE LA
PLANTA SILVESTRE Kalanchoe tubiflora EN UN MODELO MURINO”
Protocolo de Tesis
Presenta:
Nancy Yaret Mariano Flores
Director:
Dra. Jacqueline Capataz Tafur
San Juan Bautista Tuxtepec Oaxaca Mayo, 2022.
2. Introducción:
Inflamación:
Es una reacción de defensa del
sistema inmunológico que inicia
con algún tipo de estímulo,
teniendo como objetivo adaptar al
organismo en situación anormal.
La actividad antiinflamatoria ha despertado en los últimos años un gran interés
científico en el área farmacológica, principalmente en virtud de la capacidad potencial
de ciertos compuestos de interferir en la evolución de enfermedades graves que
cursan a través de procesos inflamatorios .
Figura 1. Inflamación en
diferentes puntos del
cuerpo (Roda, 2020).
Gómez, et al., 2011.
3. Introducción:
Ante la búsqueda de nuevas alternativas como tratamiento al proceso
inflamatorio, se han realizado estudios científicos en las plantas medicinales,
dado la diversidad de estructuras químicas que sintetizan estas plantas .
Kalanchoe tubiflora es una planta utilizada en la medicina tradicional como
tratamiento a la inflamación, infecciones, reumatismo; entre otras, gracias a las
actividades que se le atribuye.
Figura 3. K. tubiflora en etapa de
floración (EcuRed, 2020).
Figura 2. K. tubiflora en
crecimiento (Riverside, 2022).
Buenz et al., 2018
4. ¿Qué es la inflamación?
Está definido como una reacción de defensa que inicia con algún tipo de
estímulo, este actuará como un mecanismo homeostático que busca el
equilibrio de las células afectadas, teniendo como objetivo adaptar al
organismo en situación anormal.
Figura 4. Inflamación en diferentes áreas del cuerpo
(Fernández, 2021).
Joosten et al, 2018.
5. Inflamación y Enfermedades:
La inflamación está relacionada con diversas enfermedades, por ejemplo, el
cáncer, la ateroesclerosis, el asma, diabetes, la obesidad y otras enfermedades
autoinmunes como la artritis reumatoide y el lupus eritematoso, entre otras.
Figura 5. Enfermedades relacionadas
con la inflamación. A) Aterosclerosis
múltiple, B) Diabetes, C) Obesidad y D)
Células de cáncer (Medical institute,
2021).
A B
C D
Devarajan et al, 2015
6. Tipos de inflamación:
Inflamación Aguda:
Figura 6. Características de una
inflamación aguda (Siegfred, 2020).
Es una respuesta que se da de manera
rápida, y sirve para la liberación de
mediadores de defensa en el sitio
afectado.
La reacción se desencadena a partir de
distintos factores estimulantes como son
infecciones o toxinas ya sean de origen
bacteriano, vírico o parasitario,
traumatismo, agentes físicos, etc.
Estos producen signos clínicos como;
calor, enrojecimiento en el área,
edema, dolor y pérdida de la función.
1
Nogales, 2008.
7. Tipos de inflamación:
Inflamación Crónica:
Figura 7. Células participantes en
la respuesta inflamatoria crónica
(Delves, 2000).
Este tipo de inflamación es de duración
prolongada que puede ser causada por
infecciones que no desaparecen, por
reacciones inmunitarias anormales en los
tejidos, por estados como la obesidad, etc.
Características principales la intervención
de células; como son los macrófagos,
linfocitos y células plasmáticas, destrucción
hística y reparación que implica la
proliferación de nuevos vasos y fibrosis.
2
Robbins, 2004.
8. Mecanismo de inflamación:
Figura 8. Mecanismo de inflamación aguda, a) Reconocimiento de
la infección, b)trasmisión de una señal al núcleo de la célula y
transcripción de proteínas proinflamatorias c) migración de células
efectoras, d) vasodilatación, e) Resolución ( Ashley et al, 2012). Ahmed, 2011; Ashley et al., 2012.
9. Mediadores químicos:
Mediador Químico Origen Acción
Histamina y Serotonina Aminas vasoactivas. Incremento de la permeabilidad.
Bracidicina Incremento de la permeabilidad y dolor.
C3a Producto de complemento, anafilotoxinas. Incremento de la permeabilidad, opsina.
C5a Producto de complemento, anafilotoxinas. Incremento de la permeabilidad, quimiotaxis,
adhesión y activación leucocitaria.
Prostaglandinas Metabolitos del ácido araquidónico. Vasodilatación, dolor, fiebre, activa a otros
mediadores.
Leucotrieno B4 Metabolitos del ácido araquidónico. Quimiotaxis, adhesión y activación leucocitaria.
Leucotrieno C4, D4, E4 Metabolitos del ácido araquidónico. Incremento de la permeabilidad,
bronconstricción, vasoconstricción.
Metabolitos del oxígeno Radicales libres. Incremento de la permeabilidad, lesión
endotelial y tisular.
Factor Activador de Plaquetas PAF Incremento de la permeabilidad,
broncoconstricción, cebador de leucocitos.
Interleucinas-1 (IL-1) y Factor de Necrosis
Tumoral
Citocinas. Reacciones de fase aguda, activación
endotelial, quimiotaxis.
Óxido Nítrico Incremento de la permeabilidad, vasodilatación,
citotoxicidad.
Tabla 1. Mediadores químicos de la respuesta inflamatoria aguda (León, 2015)
10. Células participantes:
Las células que intervienen de la RIA son células epiteliales, estas son las primeras
que detectan el daño o al agente por sus receptores de reconocimiento de
patrones (PRR), otras células como los linfocitos son responsables de la
inflamación tipo crónica.
Figura 9. Células participantes en la inflamación (Romero, 2010).
González, 2019.
11. Tratamiento farmacológico:
En la actualidad existen innumerables fármacos destinados al tratamiento
antiinflamatorio, aunque un gran número de fármacos contienen ciertas
propiedades antinflamatorias, solamente se consideran antinflamatorios dos
grandes grupos de fármacos: los esteroideos y los no esteroideos.
Tipo de fármaco
Antiinflamatorios esteroideos Cortisona Metilprednisolona
Hidrocortisona Triamcinolona
Deflazacort Dexametasona
prednisona betametasona
Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) Ibuprofeno Indometacina
Naproxeno Ketoprofeno
Diclofenaco Piroxican
Celecoxib Rofecoxib
Tabla 2. Clasificación y ejemplos de fármacos antiinflamatorios.
Divins, 2014.
12. Antiinflamatorios Esteroideos:
Son fármacos antiinflamatorios, antialérgicos e inmunosupresores
derivados del cortisol o hidrocortisona, una hormona que es producida
por la corteza adrenal.
Figura 10. Molécula del Cortisol
(Fuentes, 2021).
Figura 11. Dexametasona (Ejemplo de
fármaco esteroideo) (Farma, 2020).
Serra et al., 2012.
13. Antiinflamatorio No esteroideo AINE:
Son medicamentos que están indicados para el alivio de cuadros de dolor
e inflamación aguda y crónico, este grupo se encuentran entre los
fármacos más utilizados tanto por prescripción médica, como por
automedicación. Tiene efectos analgésicos y antiinflamatorios gracias a la
inhibición de la COX, y eso depende del fármaco utilizado si cumple su
acción en la COX-1 o COX-2.
Figura 12. Ibuprofeno (Ejemplo de
fármaco no esteroideo).
Figura 13. Indometacina (Ejemplo de
fármaco no esteroideo) (EcuRed, 2016).
Prozzi et al., 2018.
14. Mecanismo de acción:
Figura 14. Mecanismo de acción de fármacos esteroideos y AINES (Royo, et al., 2021).
Disminuye la
producción de
eicosanoides.
Impide la liberación
de AA.
Inhibe la síntesis de
citocinas
proinflamatorias..
COX-1
Se expresa en
forma
constitutiva
COX-2
Necesita ser
inducida, se
expresa en
forma transitoria
y promueve la
formación rápida
de mediadores.
Fosfolípidos
Ác.
araquidónico
PG
TX
PGE2
PLA2
COX-1
Constitutiva
COX-2
Inducible
Glucocorticoides
Pérez et al, 2002.
15. Efectos adversos:
Aunque la efectividad de los antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos es
alta, esto no descarta la posibilidad de reacciones contraproducentes,
provocado por el mal manejo del fármaco en el paciente:
Dosis.
Incompatibilidad
con el pacientes
Efectos adversos de Antiinflamatorios Esteroideos:
El síndrome de Cushing, afectaciones en el sistema cardiovascular, obesidad, dislipemia,
hipertensión arterial, riesgo de presentar diabetes mellitus y afectaciones en el sistema
óseo .
Figura 15. Síndrome de Cushing (Middlesex
Health, 2021).
Gutiérrez, 2020.
16. Efectos adversos:
Efectos adversos de Antiinflamatorios no Esteroideos, AINES:
El sistema digestivo y en el sistema cardiovascular, provocando síntomas como ardor,
dispepsia, estreñimiento, náuseas, vomito, anorexia, dolor epigástrico o hinchazón
abdominal y en casos, en extremo graves erosión gástrica, perforación e incluso
hemorragia gástrica.
A B
C D
Figura 16. Ejemplos de
efectos adversos de AINEs. A)
Estreñimiento, B) Naúseas, C)
Anorexia, D) Hemorragia
gástrica (Gamma, 2018).
Muñiz et al., 2019.
17. Modelos Experimentales:
En la búsqueda de nuevas alternativas de fármacos que sustituyan a los
sintéticos son indispensables herramientas de evaluación con base en modelos
animales, para lograr el análisis de diferentes tipos de drogas o compuestos,
examinando su actividad biológica y sus posibles mecanismos de acción.
Según la intensidad de la reacción estos modelos se clasifican en:
1. Modelos
de
Inflamación
Aguda
2. Modelos
de
Inflamación
Crónica
Modelo de edema subplantar de carragenina
Protocolo experimental por aceite de crotón
Edema auricular de ratón inducido por TPA
Granulomas inducidos por pellet de algodón
Artritis por adyuvante de Freud y
Carragenina
Hand y Hossier, 2003.
18. Modelo Auricular inducido por TPA:
Se produce eritema y vasodilatación en el área auricular inducido por TPA en
ratones, pasadas las 3-4 horas aumenta el grosor por la extravasión de
líquidos, y así permite observar el edema.
El TPA (12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato)
es un agente flogógeno y promotor de
tumores, la administración tópica de TPA en
orejas de ratón induce una reacción
inflamatoria aguda que consiste en eritema,
edema e infiltración de neutrófilos.
Figura 17. Estructura del TPA (Bruen, 2007).
Stanley et al., 1991
19. Uso de las plantas medicinales como
alternativa farmacológica:
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) una planta medicinal está
definida como cualquier especie vegetal que contiene sustancias que pueden ser
empleadas para propósitos terapéuticos o cuyos principios activos pueden servir
como precursores para la síntesis de nuevos fármacos.
Los efectos farmacológicos de las plantas medicinales se deben a la presencia de
determinados compuestos químicos:
Glucósidos
cianogénicos,
alcaloides y
glucosinolatos.
Compuestos
fenólicos
(flavonoides)
Terpenos Terpenoides
Li et al., 2020
20. Planta Metabolitos Modelo Referencia
Cavendishia compacta Flavonoides y Terpenos Modelo in vivo de edema
inducido en oreja de ratón por
TPA
Vasco et al., 2019
Geranium seemannii Glucósidos, quinonas,
azúcares reductores, taninos,
flavonoides, cumarinas y
saponinas.
Modelo del granuloma en
ratas.
Hernández et al., 2018
Lepidium virginicum Compuestos polifenólicos,
flavonoides, terpenos y
esteroles.
Línea celular RAW 264.7
(ATCC® TIB-71™) de
macrófagos murinos.
Martínez, 2021
Bursera simaruba Vitamina E y el methyl-β-
peltatin A
Modelo murino de
inflamación inducido por
carragenina-
Noguera, 2004
Jatropha aethiopica Polifenoles, saponinas,
glucósidos cardiotónicos,
terpenos y esteroides
Método de estabilización de
la membrana eritrocitaria
Valdés et al., 2018
Galphimia glauca Ácido palmítico, α-linolénico y
Vitamina E.
Modelo de edema de ratón
inducido por TPA utilizando
microemulsiones base gel.
Román, 2020
Tabla 3. Clasificación de plantas utilizadas en la medicina tradicional con actividad antiinflamatoria.
Vélez et al., 2014
21. Kalanchoe tubiflora
Es una especie endémica originaria del Sur de Madagascar; su nombre procede del
chino Kalan-chowi que significa “cayendo se desarrolla” esta especie es encontrada
en pastizales abiertos y pendientes rocosas.
Se encuentra distribuida en países tropicales y
subtropicales, y en México se distribuyen en los
estados de Chiapas, México, Guerrero, Hidalgo,
Michoacán, Oaxaca, Puebla, Quintana Roo, Tabasco,
Veracruz y Yucatán.
Figura 18. Kalanchoe tubiflora (CactusPlaza.com,
2022). Eggli, 2003.
23. Descripción:
Es una planta crasa, frecuentemente de hasta
50 cm de alto (sin inflorescencia) y de hasta
150 cm de alto (con inflorescencia),.
Sus hojas son verticiladas u opuestas, simples,
subcilíndricas, de color verde oscuro,
parduzco o grisáceo, con manchas
transversales oscuras, a veces ausentes.
Figura 19. Kalanchoe tubiflora. A) Planta de K.
tubiflora, B) Planta en estado de crecimiento, C)
Flores cilíndricas .
Flores et al. 2020
A B
C
24. Cultivos de K. tubiflora:
El cultivo de K. tubiflora es muy simple, tienden a propagarse con facilidad a
partir de esquejes y es por eso mismo que en algunos lugares se les considera
como “maleza”.
Esta especie es resistente a sequías y crecen en climas tropicales y
subtropicales, gracias a su fácil adaptación se encuentra distribuida en
diferentes países.
Figura 20. Distribución mundial del
género Kalanchoe (Arias, 2011).
Golubov, 2012
25. Metabolitos de Kalanchoe:
En la literatura se reportan diferentes compuestos bioactivos en muchas de las
especies del género Kalanchoe, tales como:
Flavonoides Glicósidos
Fenoles
Terpenos
Ác. Acético
Ác. Cítrico
Ác. Fumárico
Ác. Isocítrico
Ác. Láctico
Alcaloides
Taninos Calcio y cloro
Quinonas
Figura 21. Metabolitos encontrados
en el género Kalanchoe.
Abdellaoui et al., 2010; Majaz et al., 2011; Okwu, 2006
26. K. tubiflora en la medicina tradicional:
Esta especie ha sido utilizada en la medicina tradicional contra diversas
infecciones, como antiinflamatorio y en el tratamiento de varios tipos de
cáncer, principalmente entre poblaciones nativas.
Uso externo
Se suele usar el jugo de sus
hojas mezclado con vaselina o
aceite para formar una pasta
que se aplicará en la zona
afectada.
A B
Uso interno
Se comen las hojas del
Kalanchoe , se bebe el jugo
obtenido de sus hojas o bien
estas se utilizan para elaborar
infusiones.
Supratman et al, 2001
27. Actividad antiinflamatoria del género
Kalanchoe :
Planta Extracto Modelo % Referencia
Kalanchoe crenata n-butanol Modelo de edema
de pata inducido
por carragenina
45% Dimo et al., 2006.
Kalanchoe gracilis Metanol Modelos de edema
de pata inducido
por carragenina
50% Rung et al., 2010.
Kalanchoe pinnata Acuoso Edema de oreja
inducido por aceite
de crotón
51% Dantas et al.,
2019.
Kalanchoe
daigremontiana
Éter de petróleo Modelo de edema
de pata inducido
por carragenina.
80%-100% Quintero et al.,
2021.
Tabla 3. Actividad antiinflamatoria del género Kalanchoe en modelos murinos.
Dimo et al, 2006; Rung et al, 2010; Dantas et al, 2019; Quintero et al, 2021.
28. Justificación:
En la actualidad se conocen acerca de 260,000 especies de plantas de las cuales
solo el 10% se les consideran medicinales por lo que aún es necesario realizar
investigaciones que permitan conocer las propiedades terapéuticas y medicinales
de las distintas especies de plantas.
Kalanchoe tubiflora, es una planta utilizada en la medicina tradicional como
tratamiento contra diversas infecciones, como antiinflamatorio y como tratamiento
para distintos tipos de cáncer, ya que se le atribuye propiedades antiinflamatorias,
antitumorales, antihistamínicas y inmunomoduladoras, por eso la importancia de
su estudio.
Calvopiña, 2010.
29. Hipótesis:
Los extractos de hojas de la planta silvestre de Kalanchoe tubiflora presentarán
actividad antiinflamatoria comparable o más potente que el fármaco de referencia.
30. Objetivos:
Objetivo General:
Evaluar extractos de hojas de la planta silvestre de Kalanchoe tubiflora en un
modelo murino CD-1 y realizar un análisis fitoquímico de extractos.
Objetivos específicos:
1. Obtener extractos de diferente polaridad de hojas de Kalanchoe tubiflora.
2. Evaluar la actividad antiinflamatoria de los extractos de K. tubiflora en un modelo
de edema de oreja de ratón inducido por TPA.
3. Analizar fitoquímicamente los extractos bioactivos.
31. Diagrama experimental:
Recolección
del material de
Kalanchoe
tubiflora.
Obtención de
extractos
secos.
Hexano
Acetato de
etilo
Metanol Agua
Actividad anti
inflamatoria en
modelo de
edema de oreja
de ratón.
Análisis
fitoquímico y
cromatografía en
capa fina de
metabolitos
secundarios.
Cuantificación de
fenoles y
flavonoides
totales.
32. Metodología:
Obtención de los extractos crudos:
Figura 23. Rotovapor,FS,2022.
Secado,
pulverización y
tamizaje del
material.
Extracción con
diferentes
solventes.
Los extractos
obtenidos se dejarán
secar en una
campaña de
extracción.
Murillo y Méndez, 2003
33. Análisis fitoquímico y Cromatografía en Capa Fina (CCF) de los extractos
de K. tubiflora:
Se utilizará el método descrito por Patil & Deshmukh (2016), para la detección
de taninos, flavonoides, cumarinas, glicósidos, terpenoides, esteroides y
proteínas .
Prueba Observación
Taninos Precipitado verde
Flavonoides Coloración amarilla (desaparece con el tiempo).
Saponinas Presencia de espuma
Esteroides Anillo de color marrón rojizo en la unión
Florataninos Precipitado rojo
Carbohidratos Anillo de color violeta en la unión
Glucósidos Coloración violeta, azul o verde
Cumarinas Coloración amarilla
Alcaloides Coloración naranja o rojo intenso
Proteínas Precipitado blanco
Antocianina
y Betacianina
Coloración verde azulado positivo antocianina y coloración amarilla
positivo a Betacianina
Quinonas Coloración roja
Fenoles Anillo azul o verde oscuro
Tabla 5. Pruebas fitoquímicas para extractos de plantas.
Patil y Deshmukh, 2016.
34. Metodología:
Actividad anti-inflamatoria en el modelo de edema de ratón inducido por TPA.
Grupo Tratamiento
Control Positivo Dexametasona (1.0 mg/oreja)
Control Negativo TPA (1.6 mg/ oreja)
T1: E. Hexano (1.6 mg/ oreja)
T2: E. Acetato de etilo (1.6 mg/ oreja)
T3: E. Metanol (1.6 mg/ oreja)
T4: E. Acuoso (1.6 mg/ oreja)
Se realizará con el método descrito por Payá et al., (1993).
Tabla 6. Método para actividad antiinflamatoria.
Payá et al., (1993).
35. Después de cuatro horas de la administración del extracto, los animales se
sacrificarán en una cámara de cloroformo. Se tomarán secciones circulares de
6 mm de diámetro del pabellón auricular de las orejas tratadas y no tratadas.
I𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 % = ∆𝑝 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − ∆𝑝 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 × 100
Se evaluará la dosis-respuesta de los extractos más activos a dosis de 0.4, 0.8,
1.6 y 3.2 mg/oreja para hallar la dosis efectiva 50 (DE50).
Payá et al., (1993).
36. Metodología:
Cuantificación de compuestos fenólicos totales y flavonoides.
Figura 24. Lector de microplacas, 2021.
La cuantificación de los compuestos fenólicos totales se realizará por el método
descrito por Arthur, et al. (2011), con modificaciones por Cruz-Cruz (2013), este
método está basado en la reducción del ácido fosfomolíbdico hasta óxidos
azules de molibdeno con estados de oxidación inferiores a 7+.
Los resultados se expresarán como microgramos equivalentes de ácido gálico
(µg EAG) /g de peso seco.
Arthur et al, 2011; Cruz-Cruz, 2013.
37. Metodología:
Análisis estadístico.
Los datos se analizarán con una prueba de ANOVA de una vía con una post
prueba de Tukey, con un nivel de significancia p<0.05, con el programa
estadístico Minitab 17 versión 1.0.0.1..
Los resultados se presentaron con valor medio ± SD..
38. Cronograma de actividades:
Actividades mayo Junio Julio Agosto Septiembre Octubre Noviembre
Revisión
bibliográfica
Defensa del
protocolo
Recolección del
material vegetal y
Obtención de
extractos crudos
Actividad
antiinflamatoria
Análisis
fitoquímico y CCF
Cuantificación de
compuestos
Análisis
estadístico
Redacción de
Resultados
Escritura de Tesis
Defensa de Tesis
