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INTERACCIONES ANTIGENO-
ANTICUERPO, ENSAYOS INMUNES Y
   SISTEMAS EXPERIMENTALES
INTRODUCCIÓN
• La utilización de la reacción in vitro entre
  antígenos y anticuerpos séricos (serología)
  sirve de base para muchos ensayos inmunes.
• Debido a la notable especificidad de la
  respuesta inmune, la interacción entre
  antígeno y anticuerpo in vitro se utiliza
  ampliamente con propósitos diagnósticos,
  para la detección bien sea de antígenos o de
  anticuerpos. Ejemplo serotipificación de
  diversos microorganismos utilizando
  antisueros específicos.
• La interacción de antígenos multivalentes con
  anticuerpos con al menos sitios de
  combinación por molécula, que generan
  ligamiento cruzado (ver Figura), puede
  resultar en:
• - precipitación (si el antígeno es soluble)
• - aglutinación (si el antígeno es particulado)
• - activación del complemento
Se utilizan otros ensayos inmunes en la
evaluación y el estudio de los componentes
celulares del sistema inmune, como son:
- métodos de rutina para medir la función
linfocitaria (métodos para medir la
inmunocompetencia humoral y de células T).
- sistemas de cultivo celular
- técnicas de ADN recombinante
1. Interacciones Primarias Entre Antígeno y
Anticuerpo
• Las fuerzas de unión entre un anticuerpo y un
  epítope son por enlaces no-covalentes y por
  tanto relativamente débiles. Involucran
  fuerzas de van der Waals, electrostáticas e
  hidrofóbicas.
• Los complejos antígeno-anticuerpo se pueden
  disociar fácilmente por:
• - Cambio de pH
• - Concentraciones salinas altas
• - iones caotrópicos (cianatos que interfieren con los
  puentes de hidrógeno de las moléculas de agua)
1.1 Constante de Asociación, Afinidad y Avidez
• Es una medida de afinidad de un anticuerpo
  monovalente por un epítope del antígeno o un
  hapteno.
• La afinidad de unión de un anticuerpo anti-A
  con un antígeno multivalente A puede ser
  varias veces mayor que la afinidad con un
  antígeno univalente A (ver Figura).
• La asociación entre un antígeno y anticuerpos
  depende de:
• - la afinidad de cada epítope y su anticuerpo
  correspondiente
• - la suma de las afinidades de todos los epítopes
  involucrados.
• El termino avidez se utiliza para denotar la
  energía de unión promedio entre anticuerpos
  y un antígeno multivalente.
• En general, anticuerpos IgM tienen mayor
  avidez que anticuerpos IgG, aunque la unión
  de cada Fab en el anticuerpo IgM puede tener
  la misma afinidad que el Fab de un IgG.
2. Interacciones Secundarias entre Antígeno y
Anticuerpo
2.1 Reacciones de Aglutinación
• La reacción de un anticuerpo con un antígeno
  multivalente que es particulado (ejemplo, una
  partícula insoluble) resulta en el ligamiento
  cruzado de varias partículas antígenos por los
  anticuerpos. El ligamiento cruzado resulta
  eventualmente en la aglutinación de los
  antígenos por los anticuerpos.
Aglutinación
2.1.1 Título.
El ensayo de aglutinación.
• - es un método que algunas veces se utiliza para
  medir el nivel de un anticuerpo sérico especifico para
  un antígeno particulado.
• - El título aglutinante de un suero determinado es
  una expresión semicuantitativa de los anticuerpos
  presentes en el suero.
• - se realiza mezclando diluciones séricas con una
  concentración fija de antígeno. Diluciones altas no
  causan aglutinación del antígeno. La dilución más
  alta de un suero que alcanza aglutinación visible del
  antígeno se denomina título.
• Tubos con altas concentraciones de suero que
  no causan aglutinación representan una
  prozona. Por qué no aglutina? por exceso de
  anticuerpos, cada epítope de una partícula se
  une únicamente a una sola molécula de
  anticuerpo, por lo que se previene el
  ligamiento cruzado entre diferentes partículas.
• Debido al fenómeno de prozona es imperativo
  que el antisuero se pruebe en diferentes
  diluciones.
2.1.2 Potencial Zeta.
• Ciertos antígenos partículados pueden poseer una
  carga eléctrica, ejemplo, carga neta negativa de
  eritrocitos debido al ácido siálico.
• Partículas cargadas suspendidas en solución salina
  generan un potencial eléctrico llamado potencial
  zeta, que impide estén muy cerca la una de la otra.
• Debido al potencial zeta, anticuerpos con brazos Fab
  cortos (IgG) puede que no aglutinen antígenos,
  mientras que anticuerpos como IgM con Fab más
  largos y pentavalentes si lo pueden hacer.
• ¿Cómo aglutinar antígenos de eritrocitos con
  anticuerpos IgG?
2.1.3 El Test de Coombs
• El termino denota, la detección usando anti-
   inmunoglobulinas, de cualquier Ig unida a un
   antígeno
- Emplea anticuerpos contra inmunoglobulinas (por
eso también se llama el test anti-inmunoglobulina).
- Se basa en dos hechos importantes:
i) inmunoglobulinas de una especie son inmunogénicas
cuando se inyectan en otra especie
ii) muchas de las anti-inmunoglobulinas (ejemplo, IgG
de conejo anti-humano) se unen a la porción Fc del
anticuerpo, dejando libre las porciones Fab para que
reaccionen con el antígeno.
• Cuando se utiliza por ejemplo, IgG humano
  contra antígenos de eritrocitos exhibiendo
  potencial zeta no hay aglutinación, pero al
  adicionar IgG de conejo contra IgG humano
  éste se une a Fc y puede hacer ligamiento
  cruzado de IgG humanos sobre eritrocitos
  relativamente distantes (ver Figura).
• Incluso la adición de anti-inmunoglobulina
  puede causar aglutinación en caso de
  concentración alta de anticuerpos dirigidos
  contra eritrocitos (fenómeno de prozona).
Hay dos versiones del Test de Coombs.
1. Test directo.
• Detecta anticuerpos unidos.
• - se adicionan anti-inmunoglbulinas a las partículas
  (ejemplo, eritrocitos) que se sospecha tienen
  anticuerpos unidos a antígenos sobre sus superficies.
• - Ejemplo: recién nacido con sospecha de
  enfermedad hemolítica. Si el Test de Coombs
  utilizando una suspensión con eritrocitos de un bebé
  aglutina significa que presenta la enfermedad.
2. Test indirecto.
• Detecta anticuerpos en suero.
    - se utiliza para detectar la presencia, en el suero, de
anticuerpos específicos contra antígenos particulados.
    - anticuerpos séricos si se adicionan a partículas
puede que no las aglutinen debido al potencial zeta. La
adición subsiguiente de anti-Ig causará aglutinación.
    - Ejemplo: detección de anticuerpos IgG anti-Rh en
la sangre de mujeres Rh-negativas.
2.1.4 Aglutinación Pasiva.
• Si el antígeno es un constituyente natural de
  una partícula, la reacción de aglutinación se
  conoce como aglutinación directa.
• Si la reacción de aglutinación ocurre entre
  anticuerpos y antígenos solubles que se han
  adherido a una partícula insoluble, se conoce
  como aglutinación pasiva.
• La reacción de aglutinación (directa o pasiva,
  sin o con el Test de Coombs) se utiliza
  ampliamente en clínica. Ejemplos:
- tipificación de eritrocitos en bancos de sangre
- diagnóstico de diversas enfermedades hemolíticas
mediadas inmunológicamente (anemia auto-hemolítica
inducida por droga)
- tests para el factor reumatoide (IgM humana contra
IgG humana)
- test confirmatorio para sífilis
- test látex de embarazo (detección de HCG en la orina
de una mujer embarazada)
ENSAYOS DE AGLUTINACIÓN
Hemaglutinación de Isoantígenos
• En la tipificación sanguínea, los anticuerpos se
  adicionan a células sanguíneas rojas dando una
  reacción positiva cuando se amontonan las células o
  "hemaglutinación".
• Los reactivos se preparan en una solución coloreada
  para observar más facilmente los agregados RBC. De la
  misma manera, en un suero de paciente, se le puede
  probar al anticuerpo, la capacidad de generar
  hemaglutinación de RBCs debido a la presencia del
  anticuerpo que reconoce isoantígenos que no están
  presentes en los RBCs del propio paciente.
- Personas con el tipo de sangre
A tienen anticuerpos anti-B;
-Personas con el tipo de sangre
B tienen anticuerpos anti-A;
- Personas con el tipo de sangre
O tienen anticuerpos anti-A y
anti-B;
- Personas con el tipo de sangre
AB no tienen anticuerpos que
reconozcan ningún isoantígeno.
Por tanto, la prueba es un
método rápido para determinar
si un paciete tiene niveles
normales de anticuerpos típicos
basados en el tipo de sangre
sanguíneo
• Prueba de Aglutinación en Látex
• El test de aglutinación en látex es uno de los
  diversos tipos de aglutinación por anticuerpos
  que detectan antígenos en una muestra
  utilizando anticuerpos unidos a una cama u otro
  material visible.
• Detecta la presencia de antígenos bacterianos
  que están presentes como reactivos en el
  sistema, unidos a la superficie de camas azules
  de látex. Una reacción positiva causa la
  agrupación de las camas. Las camas agrupadas
  se pueden ver a simple vista. Una reacción
  negativa deja las camas de látex en solución y
  de aspecto azul lechoso.
2.2 Reacciones de Precipitación
• 2.2.1 Reacciones en soluciones.
• Ocurren cuando se mezclan anticuerpos y
  antígenos solubles.
• La precipitación de complejos antígeno-
  anticuerpo ocurre debido a que anticuerpos
  divalentes cruzan ligadamente antígenos
  multivalentes formando un enrejado, que
  cuando alcanza un determinado tamaño
  precipita (reacción de precipitina).
Precipitación
• Una reacción de precipitación ocurre como
  resultado de la combinación de anticuerpos
  en solución con sustancias solubles con las
  que los anticuerpos reaccionan.
• Si ocurre in vivo una reacción de
  precipitación en las articulaciones o en el
  riñón, ocasiona inflamación debido a que
  los complejos inmunes en esas áreas son
  filtrados hacia afuera causando irritación.
Precipitación (continuación)
• En un test de precipitina sérica, se combinan
  las diluciones del antígeno el anticuerpo en
  solución acuosa hasta que ocurre una reacción
  de precipitacion y particulas visibles se
  acumulan.
• Con un nefelometro se puede medir la
  cantidad de "flocculation“, midiendo las
  propiedades de dispersión de la luz de
  particulas en agregación. La prueba "Gold
  Standard" para la sífilis tiene como base una
  reacción inmunológica de floculación.
Precipitación en Solución
• Es dificil de lograr la “Zona de Equivalencia”
  precisa donde hay una concentración perfecta
  tanto de antígeno como de anticuerpo en
  solución.
• Se requerirían preparar muchos tubos con
  diversas concentraciones de anticuerpos y
  antígenos para lograr justo la cantidad
  apropiada.
• Únicamente después de la centrifugación el
  anillo delgado se hace más visible.
• En la práctica, las reacciones de precipitación
  se preparan generalmente, como reacciones
  de difusión en agar, para hacer más visible el
  precipitado.
Inmunodifusión en Geles de Agar
• Se utiliza un gel de agarosa como matrix para
  combinar difusión con precipitación. Los
  reactivos difunden a través del gel resultando en
  precipitación cuando se alcanzan los puntos de
  equivalencia.
• Un solo antígeno puede dar lugar a una sola línea
  de precipitación en la presencia de su anticuerpo
  homólogo. Cuando hay dos antígenos presentes
  en un sistema, cada uno se comporta
  independientemente. Por lo tanto, si se detectan
  varias bandas de precipitación, equivalen al
  menos a un número igual de combinaciones
  antígeno-anticuerpo.
• Los anticuerpos séricos no son homogéneos(uno
  tiene anticuerpos que reconocen todo tipo de
  organismos infecciosos y de alergénos).
• Es dificil obtener un solo antígeno aun en las
  preparaciones más puras, de modo que hay
  diversas reacciones posibles antígeno-anticuerpo
  en una sola mezcla.
• La difusión en gel permite examinar dichos
  sistemas múltiples debido a que la técnica
  permite la separación de las reacciones.
• Como los componentes individuales en un
  sistema reaccionan independientemente, los
  tests de precipitación en agar se denominan
  "inmunodifusión doble " o simplemente
  inmunodifusión (anteriormente se denominaba
  de Ouchterlon).
• El color blanco espeso de la matrix sólida de agar
  permite visualizar la reacción de precipitación. El
  método se utiliza clinicamente en
  inmunología/reumatología.
• Esta técnica tiene diversas y diferentes
  aplicaciones; ejemplos incluyen:
• - Determinación de la homogeneidad de sistemas
  antígeno-anticuerpo.
• - Diagnosticar enfermedades autoinmunes
  especificas.
• - Después de la purificación de una mezcla de
  antígenos.
• - Elucidar las reacciones entre antígenos
  relacionados serológicamente.
La precipitación aparece
como una línea continua en la
forma de un ángulo entre los
dos pozos y el pozo 3.
Esta banda sin ninguna
proyección en el angulo se
denomina banda de
identidad.
Si se coloca en el pozo 1 una
solución con antígenos X y Y, en el
pozo 2 una solución con solo
antígeno X, y en el pozo 3 antisuero
con anticuerpos especificos tanto
para X como para Y, se observa una
reacción similar a la de la Fig.
Note que hay una proyección de
reacción hacia el pozo XY, lo que
indica que están relacionados los
dos materiales antigénicos de los
pozos 1 y 2, pero que el material
en el pozo 1 posee una
especificidad antigénica que no
posee el material en el pozo 2. esto
indica una identidad parcial.
Si el material en los pozos 1 y
2 no poseen antígenos en
común y el antisuero en el
pozo 3 posee especificidades
para ambos materiales, la
reacción aparece como dos
líneas que se cruzan.
Inmunoelectroforesis (IEP)
• La (IEP) es un procedimiento que combina la
  separación de antígenos por electroforesis de
  zona con la difusion de anticuerpos precipitantes
  en angulos rectos hacia la dirección de la
  migración del antígeno.
• La extensión de la migración de cualquier
  proteína depende del buffer de electroforesis,
  tiempo, voltaje, y punto isoeléctrico de la
  proteína. En especial, el pH determina la
  separación de una proteína de otra.
• La diferencia neta entre el punto isoeléctrico de
  una determinada proteína y el pH del buffer de
  electroforesis determina la extensión de la
  migración hacia el catodo o el anodo.
• Este método inmunológico se utiliza para
  detectar anormalidades en proteínas séricas
  especificas y para identificar inmunoglobulinas
  especificas utilizando reactivos anticuerpos anti-
  humanos.
• Los reactivos anticuerpos anti-humanos se han
  preparado contra fracciones purificadas de
  globulinas humanas y se obtienen
  comercialmente para propósitos de investigación
  o biomédicos.
WESTERN BLOT
RADIOINMUNOENSAYO
ELISA
CLASIFICADOR DE
 CELULAS ACTIVADO
POR FLUORESCENCIA
Anticuerpos Monoclonales
Método de Inmunofluorescencia
• Su propósito es detectar la localización y la
  abundancia relativa de cualquier proteína para la
  cual se tiene un anticuerpo.
• Utilizando anticuerpos para la proteína, puede
  conocer donde esa proteína se localiza.
• Por ejemplo, si va a utilizar anticuerpos para la
  bomba calcio ATPasa, que se localiza en el
  reticulo endoplasmático de la célula debe tener
  presente:
• - que el anticuerpo utilizado reconoce la calcio
  ATPasa de gallina.
• - la inmunofluorescencia se puede utilizar para
  cualquier proteína.
• La clave para éste método es la habilidad para
  visualizar el anticuerpo cuando se mira a
  través de un microscopio.
• Como los anticuerpos son más pequeños que
  las calcio ATPasas, el anticuerpo no se puede
  ver directamente.
• Por lo que se usa un marcador fluorescente
  unido covalentemente al anticuerpo.
• Cuando una luz ilumina el marcador
  fluorecente, este absorve la luz y emite una
  luz de color diferente que es visible para el
  investigador y se puede fotografiar.
Figure. Illustration of the direct and indirect methods for immunofluorescence.
Figura. In most immunofluorescence
experiments, two antibodies are
employed.
The first one, called the primary antibody,
is typically generated in a mouse and
binds to your favorite protein, which in
this case is the chicken calcium ATPase
(shown as a series undulating striped line
that zigzags through the ER membrane 10
times).
The secondary antibody was purchased
from a company that sells antibodies that
bind to mouse antibodies and have a
fluorescent dye covalently attached to it.
As illustrated here, the secondary
antibodies can bind to multiple sites on
the primary antibody and thus produce a
brighter signal since more dyes are
brought to a single location.
Figura.
This immunofluorescence
micrograph shows the ER being
labeled with a monoclonal
antibody against the chicken
calcium ATPase.
This chicken cell was fixed,
permeablilized, and processed for
immunofluorescence.
White indicates the location of the
fluorescent antibody and thus the
calcium ATPase to which the
antibody was bound.
Immunofluorescence image of the            Immunofluorescence - Axons of the
eukaryotic cytoskeleton. Actin filaments   Drosophila CNS antibody [BP102]
are shown in red, microtubules in green,   (ab12455)
and the nuclei in blue.
RATONES TRANSGÉNICOS
Genes responsible for particular traits
or disease susceptibility are chosen
and extracted. Next they are injected
into fertilized mouse eggs. Embryos
are implanted in the uterus of a
surrogate mother. The selected genes
will be expressed by some of the
offspring.
Since the first gene transfers into mice
were successfully executed in 1980,
transgenic mice have allowed
researchers to observe experimentally
what happens to an entire organism
during the progression of a disease.
Transgenic mice have become models
for studying human diseases and their
treatments.
The image shows transgenic mice that carry   Transgenic mouse lines expressing GFP,
the piggyBac transposon that has caused      known as "green mice." FEBS Lett, 407,
their cells to express red fluorescent       313-9 (1997)
protein. (Credit: Howard Hughes Medical
Institute (HHMI), Yale University).
RATONES
KNOCKOUT
N2KO mice created by the PI in 1997,
that contain a targeted deletion of the
Nhlh2 transcription factor (Good et al,
1997).
These animals develop an adult onset
overweight phenotype, characterized by
increased body weight and body fat
after 7 (females) to 12 (males) weeks of
age.
Weight gain is not due to increased food
intake but due, rather, to failure to
partake in high levels of physical activity.
Thus, failure to exercise leads to adult-
onset obesity in N2KO mice (Coyle et al.,
2002).
This problem extends directly to
humans, as being overweight is a
worldwide problem that affects nearly
60% of the U.S. adult population, due in
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5. interacciones antigeno anticuerpo, ensayos inmunes y sistemas experimentales

  • 1. INTERACCIONES ANTIGENO- ANTICUERPO, ENSAYOS INMUNES Y SISTEMAS EXPERIMENTALES
  • 2. INTRODUCCIÓN • La utilización de la reacción in vitro entre antígenos y anticuerpos séricos (serología) sirve de base para muchos ensayos inmunes. • Debido a la notable especificidad de la respuesta inmune, la interacción entre antígeno y anticuerpo in vitro se utiliza ampliamente con propósitos diagnósticos, para la detección bien sea de antígenos o de anticuerpos. Ejemplo serotipificación de diversos microorganismos utilizando antisueros específicos.
  • 3.
  • 4. • La interacción de antígenos multivalentes con anticuerpos con al menos sitios de combinación por molécula, que generan ligamiento cruzado (ver Figura), puede resultar en: • - precipitación (si el antígeno es soluble) • - aglutinación (si el antígeno es particulado) • - activación del complemento
  • 5. Se utilizan otros ensayos inmunes en la evaluación y el estudio de los componentes celulares del sistema inmune, como son: - métodos de rutina para medir la función linfocitaria (métodos para medir la inmunocompetencia humoral y de células T). - sistemas de cultivo celular - técnicas de ADN recombinante
  • 6. 1. Interacciones Primarias Entre Antígeno y Anticuerpo • Las fuerzas de unión entre un anticuerpo y un epítope son por enlaces no-covalentes y por tanto relativamente débiles. Involucran fuerzas de van der Waals, electrostáticas e hidrofóbicas. • Los complejos antígeno-anticuerpo se pueden disociar fácilmente por: • - Cambio de pH • - Concentraciones salinas altas • - iones caotrópicos (cianatos que interfieren con los puentes de hidrógeno de las moléculas de agua)
  • 7. 1.1 Constante de Asociación, Afinidad y Avidez • Es una medida de afinidad de un anticuerpo monovalente por un epítope del antígeno o un hapteno. • La afinidad de unión de un anticuerpo anti-A con un antígeno multivalente A puede ser varias veces mayor que la afinidad con un antígeno univalente A (ver Figura). • La asociación entre un antígeno y anticuerpos depende de: • - la afinidad de cada epítope y su anticuerpo correspondiente • - la suma de las afinidades de todos los epítopes involucrados.
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  • 9.
  • 10. • El termino avidez se utiliza para denotar la energía de unión promedio entre anticuerpos y un antígeno multivalente. • En general, anticuerpos IgM tienen mayor avidez que anticuerpos IgG, aunque la unión de cada Fab en el anticuerpo IgM puede tener la misma afinidad que el Fab de un IgG.
  • 11.
  • 12. 2. Interacciones Secundarias entre Antígeno y Anticuerpo 2.1 Reacciones de Aglutinación • La reacción de un anticuerpo con un antígeno multivalente que es particulado (ejemplo, una partícula insoluble) resulta en el ligamiento cruzado de varias partículas antígenos por los anticuerpos. El ligamiento cruzado resulta eventualmente en la aglutinación de los antígenos por los anticuerpos.
  • 14. 2.1.1 Título. El ensayo de aglutinación. • - es un método que algunas veces se utiliza para medir el nivel de un anticuerpo sérico especifico para un antígeno particulado. • - El título aglutinante de un suero determinado es una expresión semicuantitativa de los anticuerpos presentes en el suero. • - se realiza mezclando diluciones séricas con una concentración fija de antígeno. Diluciones altas no causan aglutinación del antígeno. La dilución más alta de un suero que alcanza aglutinación visible del antígeno se denomina título.
  • 15. • Tubos con altas concentraciones de suero que no causan aglutinación representan una prozona. Por qué no aglutina? por exceso de anticuerpos, cada epítope de una partícula se une únicamente a una sola molécula de anticuerpo, por lo que se previene el ligamiento cruzado entre diferentes partículas. • Debido al fenómeno de prozona es imperativo que el antisuero se pruebe en diferentes diluciones.
  • 16. 2.1.2 Potencial Zeta. • Ciertos antígenos partículados pueden poseer una carga eléctrica, ejemplo, carga neta negativa de eritrocitos debido al ácido siálico. • Partículas cargadas suspendidas en solución salina generan un potencial eléctrico llamado potencial zeta, que impide estén muy cerca la una de la otra. • Debido al potencial zeta, anticuerpos con brazos Fab cortos (IgG) puede que no aglutinen antígenos, mientras que anticuerpos como IgM con Fab más largos y pentavalentes si lo pueden hacer. • ¿Cómo aglutinar antígenos de eritrocitos con anticuerpos IgG?
  • 17.
  • 18. 2.1.3 El Test de Coombs • El termino denota, la detección usando anti- inmunoglobulinas, de cualquier Ig unida a un antígeno - Emplea anticuerpos contra inmunoglobulinas (por eso también se llama el test anti-inmunoglobulina). - Se basa en dos hechos importantes: i) inmunoglobulinas de una especie son inmunogénicas cuando se inyectan en otra especie ii) muchas de las anti-inmunoglobulinas (ejemplo, IgG de conejo anti-humano) se unen a la porción Fc del anticuerpo, dejando libre las porciones Fab para que reaccionen con el antígeno.
  • 19. • Cuando se utiliza por ejemplo, IgG humano contra antígenos de eritrocitos exhibiendo potencial zeta no hay aglutinación, pero al adicionar IgG de conejo contra IgG humano éste se une a Fc y puede hacer ligamiento cruzado de IgG humanos sobre eritrocitos relativamente distantes (ver Figura). • Incluso la adición de anti-inmunoglobulina puede causar aglutinación en caso de concentración alta de anticuerpos dirigidos contra eritrocitos (fenómeno de prozona).
  • 20.
  • 21. Hay dos versiones del Test de Coombs. 1. Test directo. • Detecta anticuerpos unidos. • - se adicionan anti-inmunoglbulinas a las partículas (ejemplo, eritrocitos) que se sospecha tienen anticuerpos unidos a antígenos sobre sus superficies. • - Ejemplo: recién nacido con sospecha de enfermedad hemolítica. Si el Test de Coombs utilizando una suspensión con eritrocitos de un bebé aglutina significa que presenta la enfermedad.
  • 22.
  • 23. 2. Test indirecto. • Detecta anticuerpos en suero. - se utiliza para detectar la presencia, en el suero, de anticuerpos específicos contra antígenos particulados. - anticuerpos séricos si se adicionan a partículas puede que no las aglutinen debido al potencial zeta. La adición subsiguiente de anti-Ig causará aglutinación. - Ejemplo: detección de anticuerpos IgG anti-Rh en la sangre de mujeres Rh-negativas.
  • 24.
  • 25. 2.1.4 Aglutinación Pasiva. • Si el antígeno es un constituyente natural de una partícula, la reacción de aglutinación se conoce como aglutinación directa. • Si la reacción de aglutinación ocurre entre anticuerpos y antígenos solubles que se han adherido a una partícula insoluble, se conoce como aglutinación pasiva.
  • 26. • La reacción de aglutinación (directa o pasiva, sin o con el Test de Coombs) se utiliza ampliamente en clínica. Ejemplos: - tipificación de eritrocitos en bancos de sangre - diagnóstico de diversas enfermedades hemolíticas mediadas inmunológicamente (anemia auto-hemolítica inducida por droga) - tests para el factor reumatoide (IgM humana contra IgG humana) - test confirmatorio para sífilis - test látex de embarazo (detección de HCG en la orina de una mujer embarazada)
  • 27. ENSAYOS DE AGLUTINACIÓN Hemaglutinación de Isoantígenos • En la tipificación sanguínea, los anticuerpos se adicionan a células sanguíneas rojas dando una reacción positiva cuando se amontonan las células o "hemaglutinación". • Los reactivos se preparan en una solución coloreada para observar más facilmente los agregados RBC. De la misma manera, en un suero de paciente, se le puede probar al anticuerpo, la capacidad de generar hemaglutinación de RBCs debido a la presencia del anticuerpo que reconoce isoantígenos que no están presentes en los RBCs del propio paciente.
  • 28. - Personas con el tipo de sangre A tienen anticuerpos anti-B; -Personas con el tipo de sangre B tienen anticuerpos anti-A; - Personas con el tipo de sangre O tienen anticuerpos anti-A y anti-B; - Personas con el tipo de sangre AB no tienen anticuerpos que reconozcan ningún isoantígeno. Por tanto, la prueba es un método rápido para determinar si un paciete tiene niveles normales de anticuerpos típicos basados en el tipo de sangre sanguíneo
  • 29. • Prueba de Aglutinación en Látex • El test de aglutinación en látex es uno de los diversos tipos de aglutinación por anticuerpos que detectan antígenos en una muestra utilizando anticuerpos unidos a una cama u otro material visible. • Detecta la presencia de antígenos bacterianos que están presentes como reactivos en el sistema, unidos a la superficie de camas azules de látex. Una reacción positiva causa la agrupación de las camas. Las camas agrupadas se pueden ver a simple vista. Una reacción negativa deja las camas de látex en solución y de aspecto azul lechoso.
  • 30. 2.2 Reacciones de Precipitación • 2.2.1 Reacciones en soluciones. • Ocurren cuando se mezclan anticuerpos y antígenos solubles. • La precipitación de complejos antígeno- anticuerpo ocurre debido a que anticuerpos divalentes cruzan ligadamente antígenos multivalentes formando un enrejado, que cuando alcanza un determinado tamaño precipita (reacción de precipitina).
  • 31. Precipitación • Una reacción de precipitación ocurre como resultado de la combinación de anticuerpos en solución con sustancias solubles con las que los anticuerpos reaccionan. • Si ocurre in vivo una reacción de precipitación en las articulaciones o en el riñón, ocasiona inflamación debido a que los complejos inmunes en esas áreas son filtrados hacia afuera causando irritación.
  • 32.
  • 33. Precipitación (continuación) • En un test de precipitina sérica, se combinan las diluciones del antígeno el anticuerpo en solución acuosa hasta que ocurre una reacción de precipitacion y particulas visibles se acumulan. • Con un nefelometro se puede medir la cantidad de "flocculation“, midiendo las propiedades de dispersión de la luz de particulas en agregación. La prueba "Gold Standard" para la sífilis tiene como base una reacción inmunológica de floculación.
  • 34. Precipitación en Solución • Es dificil de lograr la “Zona de Equivalencia” precisa donde hay una concentración perfecta tanto de antígeno como de anticuerpo en solución. • Se requerirían preparar muchos tubos con diversas concentraciones de anticuerpos y antígenos para lograr justo la cantidad apropiada. • Únicamente después de la centrifugación el anillo delgado se hace más visible.
  • 35.
  • 36.
  • 37. • En la práctica, las reacciones de precipitación se preparan generalmente, como reacciones de difusión en agar, para hacer más visible el precipitado.
  • 38. Inmunodifusión en Geles de Agar • Se utiliza un gel de agarosa como matrix para combinar difusión con precipitación. Los reactivos difunden a través del gel resultando en precipitación cuando se alcanzan los puntos de equivalencia. • Un solo antígeno puede dar lugar a una sola línea de precipitación en la presencia de su anticuerpo homólogo. Cuando hay dos antígenos presentes en un sistema, cada uno se comporta independientemente. Por lo tanto, si se detectan varias bandas de precipitación, equivalen al menos a un número igual de combinaciones antígeno-anticuerpo.
  • 39.
  • 40. • Los anticuerpos séricos no son homogéneos(uno tiene anticuerpos que reconocen todo tipo de organismos infecciosos y de alergénos). • Es dificil obtener un solo antígeno aun en las preparaciones más puras, de modo que hay diversas reacciones posibles antígeno-anticuerpo en una sola mezcla. • La difusión en gel permite examinar dichos sistemas múltiples debido a que la técnica permite la separación de las reacciones. • Como los componentes individuales en un sistema reaccionan independientemente, los tests de precipitación en agar se denominan "inmunodifusión doble " o simplemente inmunodifusión (anteriormente se denominaba de Ouchterlon).
  • 41. • El color blanco espeso de la matrix sólida de agar permite visualizar la reacción de precipitación. El método se utiliza clinicamente en inmunología/reumatología. • Esta técnica tiene diversas y diferentes aplicaciones; ejemplos incluyen: • - Determinación de la homogeneidad de sistemas antígeno-anticuerpo. • - Diagnosticar enfermedades autoinmunes especificas. • - Después de la purificación de una mezcla de antígenos. • - Elucidar las reacciones entre antígenos relacionados serológicamente.
  • 42. La precipitación aparece como una línea continua en la forma de un ángulo entre los dos pozos y el pozo 3. Esta banda sin ninguna proyección en el angulo se denomina banda de identidad.
  • 43. Si se coloca en el pozo 1 una solución con antígenos X y Y, en el pozo 2 una solución con solo antígeno X, y en el pozo 3 antisuero con anticuerpos especificos tanto para X como para Y, se observa una reacción similar a la de la Fig. Note que hay una proyección de reacción hacia el pozo XY, lo que indica que están relacionados los dos materiales antigénicos de los pozos 1 y 2, pero que el material en el pozo 1 posee una especificidad antigénica que no posee el material en el pozo 2. esto indica una identidad parcial.
  • 44. Si el material en los pozos 1 y 2 no poseen antígenos en común y el antisuero en el pozo 3 posee especificidades para ambos materiales, la reacción aparece como dos líneas que se cruzan.
  • 45.
  • 46. Inmunoelectroforesis (IEP) • La (IEP) es un procedimiento que combina la separación de antígenos por electroforesis de zona con la difusion de anticuerpos precipitantes en angulos rectos hacia la dirección de la migración del antígeno. • La extensión de la migración de cualquier proteína depende del buffer de electroforesis, tiempo, voltaje, y punto isoeléctrico de la proteína. En especial, el pH determina la separación de una proteína de otra. • La diferencia neta entre el punto isoeléctrico de una determinada proteína y el pH del buffer de electroforesis determina la extensión de la migración hacia el catodo o el anodo.
  • 47. • Este método inmunológico se utiliza para detectar anormalidades en proteínas séricas especificas y para identificar inmunoglobulinas especificas utilizando reactivos anticuerpos anti- humanos. • Los reactivos anticuerpos anti-humanos se han preparado contra fracciones purificadas de globulinas humanas y se obtienen comercialmente para propósitos de investigación o biomédicos.
  • 48.
  • 51.
  • 52.
  • 53.
  • 54.
  • 55. ELISA
  • 56. CLASIFICADOR DE CELULAS ACTIVADO POR FLUORESCENCIA
  • 58. Método de Inmunofluorescencia • Su propósito es detectar la localización y la abundancia relativa de cualquier proteína para la cual se tiene un anticuerpo. • Utilizando anticuerpos para la proteína, puede conocer donde esa proteína se localiza. • Por ejemplo, si va a utilizar anticuerpos para la bomba calcio ATPasa, que se localiza en el reticulo endoplasmático de la célula debe tener presente: • - que el anticuerpo utilizado reconoce la calcio ATPasa de gallina. • - la inmunofluorescencia se puede utilizar para cualquier proteína.
  • 59. • La clave para éste método es la habilidad para visualizar el anticuerpo cuando se mira a través de un microscopio. • Como los anticuerpos son más pequeños que las calcio ATPasas, el anticuerpo no se puede ver directamente. • Por lo que se usa un marcador fluorescente unido covalentemente al anticuerpo. • Cuando una luz ilumina el marcador fluorecente, este absorve la luz y emite una luz de color diferente que es visible para el investigador y se puede fotografiar.
  • 60. Figure. Illustration of the direct and indirect methods for immunofluorescence.
  • 61. Figura. In most immunofluorescence experiments, two antibodies are employed. The first one, called the primary antibody, is typically generated in a mouse and binds to your favorite protein, which in this case is the chicken calcium ATPase (shown as a series undulating striped line that zigzags through the ER membrane 10 times). The secondary antibody was purchased from a company that sells antibodies that bind to mouse antibodies and have a fluorescent dye covalently attached to it. As illustrated here, the secondary antibodies can bind to multiple sites on the primary antibody and thus produce a brighter signal since more dyes are brought to a single location.
  • 62. Figura. This immunofluorescence micrograph shows the ER being labeled with a monoclonal antibody against the chicken calcium ATPase. This chicken cell was fixed, permeablilized, and processed for immunofluorescence. White indicates the location of the fluorescent antibody and thus the calcium ATPase to which the antibody was bound.
  • 63. Immunofluorescence image of the Immunofluorescence - Axons of the eukaryotic cytoskeleton. Actin filaments Drosophila CNS antibody [BP102] are shown in red, microtubules in green, (ab12455) and the nuclei in blue.
  • 64. RATONES TRANSGÉNICOS Genes responsible for particular traits or disease susceptibility are chosen and extracted. Next they are injected into fertilized mouse eggs. Embryos are implanted in the uterus of a surrogate mother. The selected genes will be expressed by some of the offspring. Since the first gene transfers into mice were successfully executed in 1980, transgenic mice have allowed researchers to observe experimentally what happens to an entire organism during the progression of a disease. Transgenic mice have become models for studying human diseases and their treatments.
  • 65.
  • 66. The image shows transgenic mice that carry Transgenic mouse lines expressing GFP, the piggyBac transposon that has caused known as "green mice." FEBS Lett, 407, their cells to express red fluorescent 313-9 (1997) protein. (Credit: Howard Hughes Medical Institute (HHMI), Yale University).
  • 68. N2KO mice created by the PI in 1997, that contain a targeted deletion of the Nhlh2 transcription factor (Good et al, 1997). These animals develop an adult onset overweight phenotype, characterized by increased body weight and body fat after 7 (females) to 12 (males) weeks of age. Weight gain is not due to increased food intake but due, rather, to failure to partake in high levels of physical activity. Thus, failure to exercise leads to adult- onset obesity in N2KO mice (Coyle et al., 2002). This problem extends directly to humans, as being overweight is a worldwide problem that affects nearly 60% of the U.S. adult population, due in part to sedentary lifestyles.