5. Mecanismo de formación de un gen de fusión y
expresión de una proteína quimérica como
consecuencia de una traslocación cromosómica
Gen de fusión
Proteína quimérica
BCR-ABL
mRNA
DNA
Gen A
mRNA
Proteína normal
BCR
DNA
Gen B
Proteína normal
mRNA ABL
10. La traslocación tienelugar en la zona nocodificante (intrones)
La traslocación tienelugar en la zona nocodificante (intrones)
PROTEINA DE FUSION
BCR-ABL
Es diferente para
cada paciente
Se forma la misma
proteína anómala
Es una zona
demasiada grande
para su análisis por
PCR
11. Copia de RNA a
DNA (transcripción
reversa RT)
CELULAS
Extracción RNA
Reacción de PCR
Detección del
producto
amplificado
Oligo region Oligo región
BCR ABL
RT-PCR
cDNA
BCR-ABL
mRNA
BCR-ABL
Proteína
BCR-ABL
Transcripción
Traducción
15. Baseline
Δ Fluorescence
PCR a tiempo Real o PCR cuantitativa
Área
detección PCR
a tiempo real
PCR tradicional
Threshold es el
punto de detección
Cycle Threshold (Ct) Ciclo
en la que la muestra
cruza el threshold
24. Tiempo Alertas
Respuesta
Subóptima
Fracaso
Dx
Alto riesgo LMC
Del 9q+
ACA en células Ph+
- -
3 meses < RHC No RH
6 meses < RCiP
< RHC
No RCi
12 meses < RMoM < RCiC < RCiP
18 meses < RMoM < RCiC
En cualquier
momento
BCR-ABL ratio
ACA en células Ph-
ACA en células Ph+
Pérdida de RMoM
Mutaciones
Pérdida de RHC
Pérdida de RCiC
Mutaciones
26. Mecanismos de resistencia a Imatinib
BCR/ABL-dependiente:
- Mutaciones Puntuales
- Amplificación / sobreexpresión
BCR/ABL-independiente:
- Evolución Clonal (p53 loss ...)
- quinasas de la familia Src
- Expresión diferente de proteínas implicadas
en el transporte de proteínas
- Barreras farmacológicas(e.g., CYP450)
- Niveles plasmáticos bajos de IM
28. Fallo Primario (%)
Pérdida Respuesta
a los 3 años (%)
FC precoz FC tardía FA
(600 mg)
CB
(600 mg)
0
25
50
75
100
4
7
20
4
24
60
66
93
Frecuencia de resistencia a
Imatinib a los 3 añosPercent
Hochhaus and La Rosée Leukemia. 2004
29. Mas de 40 mutaciones diferentes se han descrito !
Mutaciones de Abl
Phospate-
binding site
P-loop
Imatinib
-binding site
Catalitic site Activation
Loop
G250E
Q252R/H
Y253F/H
E255K/V
T315I/S
F317L
M351T
E355G/D
F359V/I
V379I
L387M/F
H396R/P
F311L/I
M343T
F382L
S417Y/F
E459K/Q
V289A
D276G
T277A
A380T
E279K
E281A/K
E292V
V299L
L364I
L384M
E453G/K
M244V
L248V
F486S
carboxy terminal
35. T315I
- Mutación con mayor trascendencia clínica:
- Resistencia TOTAL a Imatinib
- Resistencia a los nuevos inhibidores (Nilotinib y Dasatinib)
T315I
37. SECUENCIACIÓN DIRECTA
- Amplificación de BCR-ABL por PCR
- 2ª Amplificación de ABL
- Purificación producto de PCR
- Reacción de secuenciación
Sensibilidad limitada 25-40%
Screening
Método de elección o estándar
38. 100%
T315I
50%
T315I
25%
T315I
10%
T315I
5%
T315I
1%
T315I
Diluciones de Baf3-T315I en K562
DETECCIÓN DE LA MUTACION T315I MEDIANTE SECUENCIACIÓN
Cortesía de X. Agirre, A. Jiménez y J. Román.
T C A T T G A G T
T C A C T G A G T
C
C C
T C A T T G A G T
T C A C T G A G T
C
C C
T C A T T G A G T
T C A C T G A G T
C
C C
T C A T T G A G T
T C A C T G A G T
C
C C
T C A T T G A G T
T C A C T G A G T
C
C C
T C A T T G A G T
T C A C T G A G T
C
C C
39. PCR específica de secuencia (ASO-PCR)
CGTAGGTCATGAACTCAA
GCATCCAGTACTTGAGTT …………………………………TGAGGTCTGACAGGTGTCGTA
ACTCCAGACTGTCCACAGCAT
BCR
ABL
DISEÑO DE CEBADORES ESPECÍFICOS PARA LA SECUENCIA CON LA MUTACIÓN
Elevada Sensibilidad (1 / 100.000)
Falsos positivos en niveles altos de
sensibilidad.
No Screening
semi-CUALITATIVA o CUALITATIVA
MUTACIÓN
Willis et al. Blood 2005
40. Pueden detectarse mutaciones antes del tratamiento con
inhibidores pero no se correlaciona con resistencia clinica.
Debe realizarse el screening mutacional
en pacientes no tratados?
NONO
41. El hecho que las mutaciones se detecten en una pequeña
proporción de pacientes en RCC y que sean transitorias se
considera UN TRABAJO INUTIL a no ser que haya un
aumento de 10 veces en el nº de cópias del gen BCR-ABL.
Debe realizarse el screening mutacional
en pacientes en RCC?
NONO
42. ¿Cuándo realizar un estudio
mutacional?
•NO es necesario al Diagnóstico
RESISTENCIA PRIMARIA
•No respuesta hematológica a los 3 meses
•No respuesta citogenética a los 12 meses (RMC, RCC)
RESISTENCIA ADQUIRIDA
•Ante una pérdida de respuesta hematológica
•Ante una pérdida de respuesta citogenética
•¿Ante un incremento en los niveles de BCR-ABL?
•Según el grupo de Adelaida ante un > de 2 veces el
valor anterior
•Lo recomendable es ante un > de 10 veces (1 log) y es
aconsejable demostrar el > en dos muestras consecutivas
•Progresión a FA o CB
Indicaciones para screening de
mutaciones
43. Cuando debe realizarse el estudio
mutacional?
Pacientes en la 2nda generacíon de TKIs:
•En TODOS los pacientes, el ESTUDIO
MUTACIONAL deberia realizarse al
inicio y a intervalos regulares para
analizar la cinética de las mutaciones
existentes o las que emergen de nuevo
45. • La cuantificación de la enfermedad residual y el estudio
mutacional son herramientas básicas para realizar un
tratamiento racional en los pacientes afectos de LMC.
• Casi la mitad de los pacientes que son resistentes a
imatinib presentan mutaciones en el dominio kinasa ABL.
• Las mutaciones son responsables de >90% de
resistencias y pueden beneficiarse del tratamiento con la
2nda generación de TKIs.
Conclusiones
46. Centros 46 laboratorios- Unificar la técnica de
cuantificación del gen
BCR-ABL mediante RQ-
PCR.
-Unificar el sistema de
expresar los resultados como
el ratio de copias
BCR-ABL/gen control %.
-Detectar problemas
metodológicos.
-Realizar un programa de
control de calidad.
AGRADECIMIENTOS: Grupo de Biologia Molecular de la Asociación
Española de Hematologia y Hemoterapia y NOVARTIS
