Seminario de clase

1. TÈCNICAS MOLECULARES DE UTILIDAD EN INVESTIGACIÓN INDUSTRIAL
LIANY LUNA
TANIA VELASCO
Prácticas complementarias

2. SUMARIO
Competencias
General
Específicos
ExtraccióndeDNA
Técnicasdebiologíamolecular
Reacciónencadenadelapolimerasa(PCR)
Clonación
Transformación
WesternBlot
Purificación“Mini-Prep”delDNAdeunplásmidorecombinadooclonado
EvaluacióndeDNAyProteínas
Electroforesisengeldeagarosa
Electroforesisengeldepoliacrilamida(SDS-PAGE)
Bibliografía

3. COMPETENCIAS
COMPETENCIA GENERAL
Conocer las diferentes técnicas moleculares utilizadas en investigación industrial implementadas en los laboratorios de Genética y Bioquímica funcional y estructural de la UFSCAR

4. COMPETENCIAS
COMPETENCIAS ESPECIFICAS
Conocer e identificar la aplicabilidad de las diferentes técnicas moleculares en el área de la investigación en el desarrollo de trabajos de investigación
Entender los principios básicos de cada una de las técnicas de biología molecular
Identificar la multidisciplinariedad con la cual se trabaja las diferentes técnicas moleculares

5. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
Número de copias de un fragmento deADN particular, partiendo de un mínimo; partiendo de fragmento original, o molde.
Fase 1:
Desnaturalización
Fase 2:
Hibridación
Fase 3:
Elongación

6. CICLOS DE LA PCR
Temperaturas
Desnaturalización
Hibridación
Elongación

7. CLONACIÒN MOLECULAR DE DNA
Recombinación In vitro de un fragmento de DNA con un DNA vector (molécula de ADN utilizado como un vehículo para llevar material genético extraño) con capacidad de replicación autónoma (Plásmido).
El fragmento de DNA se replicara junto con el DNA vector en la célula hospedadora y así será posible obtenerlo en un número elevado de copias.

8. Principio de la clonación de DNA
Inserción del DNA amplificado mediante PCR ,en un plásmido apropiado (DNA vector) mediante un proceso denominado ligación, con previa linearización
In vivo
Hospedador apropiado
Electrocompetente
Favorece la entrada del DNA recombinante
Etapas del proceso
Restricción
Restrictasas
Catalizan el corte de ambas cadena azúcar–fosfato del dsDNA
Clasificación
Tipo I
Cortan en el sitio de reconocimiento (4 a 8 pb) o muy cerca, de forma específica.
Tipo II
Cortan a distancias grandes y variables del sitio de reconocimiento
Tipo III
Cortan 25 pb fuera del sitio de reconocimiento

9. Etapas del proceso
Ligación
Un extremo 5’ (portador de un grupo fosfato) y un extremo 3’ (grupo hidroxilo de la desoxirribosa)
Requiere
Transformaciòn
Introducciónde material genético en una célula
Orificios en las envolturas celulares, mediante procesos químicos y tratamientos físicos

10. Etapas del proceso
Métodosdetransformacióncomúnmenteutilizados
Electroporación
Breve pulso eléctrico, permeabilizando las membranas (poros u orificios)
Entrada en la célula de moléculas de DNA grandes
Biobalistica
Microproyectiles para introducir ácidos nucleicos con partículas microscópicas
Metales pesados como el oro o tungsteno
Impregnadas del DNA

11. Etapas del proceso
Métodosdetransformacióncomúnmenteutilizados
Microinyecciòn
Se inyecta el DNA con una aguja muy fina (Micromanipulador) y la ayuda de un microscopio a cada una de las células; una a una y manualmente
Lipofecciòn
Liposomas capaces de unirse tanto al DNA como a la superficie celular, ambos cargados negativamente
El DNA transferido no se integra en el genoma

12. Etapas del proceso
Selección
Vector con DNA
Codifica para una o varias enzimas que le confiere resistencia a antibióticos
Células + Vector
Crecen en medio selectivo suplementado con Antibiótico
( Ampicilina, Tetraciclina, Zeocina)
Selección de colonias transformantes

13. Purificación “Mini-prep” del DNA de un plásmido recombinado o clonado
DNA extracromosómico, circular y de pequeño tamaño y que se caracterizan por que se pueden replicar de manera independiente del DNA cromosómico.
Estructura de un plásmido
Origen de Replicación:
Gen de resistencia:
Sitios de restricción:

14. Mini-prep
Extracción deADNde naturalezaplasmídicade uncultivo bacteriano
Lisis alcalina
Desnaturalización del DNA mediante NaOH (medio básico) y SDS (detergente)
Cuando se neutraliza el medio + Acetato potásico
Precipitación de proteínas por SDS y concentración de sales
DNA plasmídico se renaturaliza correctamente
y queda soluble
GE Healthcare ( Ilustra plasmid-prep mini spin kit)

15. EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO
Iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas delADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula
Lisis celular mediante un detergente y el ADN se disuelve en una solución tampón
El tampón contiene: ADN y restos celulares (Proteínas, ARN y Carbohidratos)
Las proteínas asociadas al ADN se fraccionan en cadenas más pequeñas y separadas (Detergente)
ADN ( Se extrae con alcohol etílico al 95%)

16. Reactivos utilizados en la extracción de ADN
Detergente aniónico, agente solubilizante de proteínas, membranas y tejidos
Deshidrata ADN (perder contacto con el agua)
Precipitación del ADN
Precipitación del ADN, compite con el agua
Deshidratandolo y llevándolo al fondo del tubo

17. WESTERN BLOT O INMUNOBLOT
Visión general
Técnica analítica usada para detectarproteínasespecíficas en una muestra determinada
Preparación de la muestra
Disrupción mecánica
o química
Sobrenadante de Cultivos
celulares
Electroforesis en gel de Acrilamida
Las proteínas en el extracto se separan de acuerdo a su tamaño
Transferencia electroforética a una membrana
Las proteínas son transferidas electroforéticamente a un soporte rígido o membrana, dónde quedan inmovilizadas
(SDS) se une a las proteínas y confiere una carga (-) a las proteínas
Hibridación del Anticuerpo
Incuba con un anticuerpo primario dirigido contra el epítopo específico de la proteína diana.
un anticuerpo secundario marcado que se unirá de forma específica al anticuerpo primario, proporcionando una forma de detección

18. Preparación de la muestra
Detección de las bandas

19. GEL DE AGAROSA
TAE
Pesar Agarosa
ChemiDoc
Fuente de Energía
una técnica que se emplea para separar los ácidos nucleicos y las proteínas en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas

20. GEL DE POLIACRILAMIDA
Peines
Vidrios
Soporte de fundición
Soporte de fundición de vidrio
Tanque de buffer
Montaje de Fijación y electrodo
Fuente de Energía
Tampón de corrida

21. Revelar el Gel
Comassie
azul brillante
Horno por 30 segundos
Solución lavadora
Acido Acético 8% Etanol 15%

22. Transformación
16 horas 37 °C
10 mL de LB
kana (25μg/mL) Overnight, 37 °C
220rpm
100 mL de LB
Kana (25μg/mL)
Colonia única
1 mL
DO600de 0.7
1 mMIPTG
1% L-arabinose
2 horas, 37 °C
220rpm
centrifugación
Resuspende
0.5 mL
(50 mMfosfatosódio, pH 7.4 ; 5 mMEDTA)
Igual volume de
Esferas de vidro
vortex
E. Coli (BL21-AI)
pET28a_PcaK
Transferência de el lisado
Centrifugación
Listo para Purificación de proteína
Agar LB
PROCEDIMIENTO PARA OBTENER PROTEÍNA

23. PURIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD DE NIQUEL-INTERCAMBIO IONICO

24. Buffer de
lavado 10 mM
Columna de IMAC-Níquel
Buffer de
lavado 25 mM
Buffer de
lavado 50 mM
Buffer de
lavado 100 mM
Buffer de
lavado 75 mM
Buffer de
lavado 250 mM
Buffer de lavado 10 mM: KPB + NaCl1 M + glicerol 10% + imidazol 10 mM.
Gel del Electroforesis de Poliacrilamida

25. BIBLIOGRAFIA
ProtocolosdelDepartamentodeGenéticayEvolucióndellaboratoriodeBiologíaMolecular,UniversidadFederaldeSaoCarlos.
Nelson,D;Cox,M.LEHNINGERPRINCIPIOSDEBIOQUIMICA.4ªedición.Edit.Omega. Pags.306-317
Albertsycols.BIOLOGIAMOLECULARDELACELULA.4ªedición.EdicionesOmega. Pags.500-504
Lodishycols.BIOLOGIACELULARYMOLECULAR.5ªedición.Ed.MedicaPanamericana
Karp,G.BIOLOGIACELULARYMOLECULAR.4ªedición.Edit.McGrawHill.Pags.822- 835
Higuchi,R.;Fockler,C.;Dollinger,G.;Watson,R.1993.KineticPCRanalysis:realtimemonitoringofDNAamplificationreactions.Bio/Technology11:1026-1030