Enfocada a biología molecular

1. SECUENCIACION DE
ADN
NALLELI VERGARA OLMEDO
ABDÓN VIRGEN PIMIENTA

2. GENERALIDADES
• Una secuencia de ADN es una sucesión de letras que representa la
estructura primaria de una molécula de ADN.
• Las posibles letras son A, C, G, y T, que simbolizan las cuatro
subunidades de nucleótidos de una banda ADN.
• Las secuencias se presentan yendo de 5' a 3' (de izq. a derecha).
• Para que pueda llamarse secuencia tiene que haber una sucesión de
al menos 4 nucleótidos.

3. HISTORIA
• A principios de los años 70, era muy dificil y costoso
secuenciar fragmentos de solo 5 a 10 nucleotidos.
• Walter Gilbert y Frederick Sanger fueron los que dieron un
gran paso en la secuenciacion de ADN. Dieron lectura a las
primeras secuencias concretas como la mitocondria humana y
el virus Epstein-Barr.

4. Frederick Sanger y Walter Gilbert
Compartieron, en 1980, el premio Nóbel de química por haber desarrollado
independientemente métodos de secuenciación del ADN . Gilbert, junto a A.
Maxam, creó el método químico, en el cual a partir de enzimas de restricción,
inducían la rotura química del ADN por bases específicas.
Sanger, que anteriormente ganó el premio Nóbel de 1959 por la secuenciación
de la proteína insulina, desarrolló el metodo de secuenciación didesoxi, para
poder ser identificada. La síntesis se va interrumpiendo con nucleótidos cuyos
azucares carecen de OH, con lo cual pudo ir verificando que nucleótidos se
iban elongando.

5. METODO QUIMICO DE
SECUENCIACION DEL ADN
• Es el metodo de Maxan y Gilbert y fue uno de los metodos
mas usados, se basa en la hidrolisis quimica y en un diseño
aplicable a secuencias de ADN de menos de 250 nucleotidos.
Se describe en 3 etapas:
• 1.- Marcaje del DNA
• 2.- Hidrolisis quimica selectiva de ADN
• 3.-Analisis de los productos

7. METODO ENZIMATICO (SANGER)
• A diferencia del metodo quimico, en este metodo no se
degrada el ADN, sino que se acude a la interruccion
controlada de la sintesis de una hebra complementaria
durante una replicacion in vitro. Esta sintesis es catalizada por
una ADN pol que define el carácter enzimatico del metodo.
Este metodo tiene la posibilidad de secuenciar fragmentos
mas largos y con menor margen de error.

8. • El metodo se describe en 3 secciones:
• 1.- Sintesis enzimatica
• 2.-Analisis de los fragmentos
• 3.-Automatizacion

9. 1.- Sintesis enzimatica

10. SINTESISDE UNADNCOMPLEMENTARIODE
LONGITUDVARIABLE
• Como se emplea una ADN pol para sintetizar las hebras
complementarias que queremos secuenciar, la primer
caracteristica es que necesitamos un cebador (oligonucleotido
que hibrida el extremo 3´de la region que vamos a
secuenciar).

11. • La segunda y principal caracteristica de este metodo de
secuenciacion es el uso de didesoxinucleotidos (que son
analogos de los desoxinucleotidos) que provocan la detencion
de la sintesis de ADN.

13. Los didesoxinucleotidos compiten con los desoxinucleotiodos en la reaccion
de sintesis. Los ddNTPs detienen la sintesis.

17. 2.-Analisis de los fragmentos

18. SEPARACION DE LOS
FRAGMENTOS Y ANALISIS
• Se sigue un procedimiento completamente analogo al analisis
del metodo quimico.

20. 3.-Automatizacion

21. AUTOMATIZACION
• Se usa un fluorocromo diferente para cada una de las 4
reacciones de sintesis, que automatiza el metodo. La lectura
de la fluoresencia es continua, por lo tanto la electroforesis
sigue transcurriendo.

23. BIBLIOGRAFIA
• BIOLOGIA MOLECULAR E INGENIERIA GENETICA Jose luque
Ed. Harcourt Cap. 18 (Secuenciacion del genoma y proyectos
genoma) pags. 231-238
• BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR 6ta Edicion Geral Karp ED.
Mc Graw Hill Cap. 10 (Naturaleza del gen y del genoma) Sub-
tema (Secuenciacion de gemomas: la base genetica del ser
humano) pags. 405-410