Métodos cromatográficos y cromatografía

1. Cromatografía.
La cromatografíaesunmétodofísicode separaciónparalacaracterizaciónde mezclascomplejas,la cualtieneaplicaciónentodaslasramasde laciencia.Es
unconjuntode técnicasbasadasenel principiode retenciónselectiva,cuyoobjetivoessepararlosdistintoscomponentesde unamezcla,permitiendo
identificary determinarlascantidadesde dichoscomponentes.Diferenciassutilesenel coeficientede particiónde loscompuestosdancomoresultadouna
retencióndiferencialsobrela faseestacionariay, portanto,unaseparaciónefectivaenfunciónde lostiemposde retenciónde cadacomponentede la mezcla.
Lacromatografíapuedecumplirdosfuncionesbásicasqueno se excluyenmutuamente:
-Separarloscomponentesde la mezcla,paraobtenerlosmáspurosy quepuedanserusadosposteriormente(etapafinalde muchas síntesis).
-Medirla proporciónde loscomponentesde lamezcla(finalidadanalítica).Enestecaso,lascantidadesde materialempleadassuelensermuypequeñas.
Ormarys Aguillon.
C.I: 23868376

2. Historia.
Lacromatografía, comoindicasu nombre(provienedel griegoχρῶμαchrōmay γράφωgráphō,quesignificanrespectivamente"color"y "escribir,registrar",
literalmente"escrituradecolor",o mejor"registrode color"), fueempleadaoriginalmenteconsustanciascoloreadas.
Yaen1850,Rungedescribióla formaciónde zonascoloreadascuandose depositabangotasde sustanciascolorantessobrepapelsecante,peroel desarrollo
másimportantevinoconlosexperimentosde MijaílTswet(MikhailSemenovichTsweet,1872-1919),queempleóporprimeravezen1906el término
"cromatografía".A comienzosdelaño1903, MijailTsweet,botánicoruso, logrósepararunmezclade pigmentosde plantas(clorofilas)enunacolumnade
carbonatode calcio. Mástarde,en1910, cromatografióunextractode yemade huevoenunacolumnade inulina. Susinvestigaciones,sinembargo,no fueron
utilizadasporotrosinvestigadoreshasta1931.Estademoraquizáse debióal hechode quelostrabajosde Tswettfueronpublicadosenrusoy enunarevista
queno teníaampliacirculación.

3. El rápidodesarrollode lacromatografíacomoherramientaanalíticasensibleno ocurrióhasta1931,cuandoKuhn,con Lederery conWinterstein,empleóla
técnicaparael análisisde pigmentosde plantas,confirmandolosprimerostrabajosde Tswetty su predicciónde queel carotenono eraunasolasustancia,
sinounamezclade varioshomólogosestrechamenterelacionados.Al mismotiempo, eltamañodelascolumnasempleadasfueaumentandoparapoder
recuperarloscomponentesseparados.Latécnica,porlo tanto,no erasoloanalíticasinopreparatoria. Lacromatografíaencolumnaporestostiempotenía
aplicacioneslimitadas,dadoqueloscomponentesquesepodíanseparareraninvariablementelípidos.Pasaron10 añosantesde queMartiny
Syngedesarrollaranunatécnicamediantela cualse pudieransepararcompuestosacuososo hidrofílicos.Estomarcóunnuevointerésenlatécnicay en1944
Consden,Gordony Martinlograronsepararmezclascomplejasde aminoácidosenpapely fueronpremiadosconelPremioNobel porsustrabajos.Al poco
tiempo,en1947,enEstadosUnidosde Norteamérica,la Comisiónde EnergíaAtómicadioa conocerinformaciónsobreel usode lacromatografíade
intercambioiónicoparalaseparaciónde productosde fisiónnuclear.
El desarrollomásrecienteenel campode la cromatografíase derivade lostrabajosde Stahl, quienen1956presentóunatécnicaprácticamediantelacualuna
capadelgadasílicegel,celulosao alúminaeradiseminadasobreunaplacade vidrio. Estatécnica,llamadacromatografíade capafina, resultóenunanálisis
másrápidoy mássensibleparaelexamende mezclascomplejasy, enmuchoscasos,hasustituidoa otrosmétodossimilaresmás antiguosde cromatografíaen
papeltoche.

4. En 1959,Porathy Flodinintrodujeronunanuevatécnicallamadacromatografíadefiltraciónde gel. Estase haconvertidoenunapoderosay nueva
herramientaparala separaciónde sustanciasde altopesomolecular,particularmentelasproteínas,y ha encontradomuchasaplicacionesenloscamposdela
bioquímica, lamedicina,la fisiologíay la biología. Lamayoríade lastécnicasdefiltraciónengelutilizancolumnasy recientementese hanhechotrabajoscon
unacombinaciónde filtraciónengely materialesde intercambioiónico,lograndoquelasseparacionescomplejasseanextremadamenterápidasy eficientes.
Losprimerosequiposde cromatografíade gasesaparecieronenel mercadoa mediadosdelsigloXX. A su vez,la cromatoografíalíquidade alta
resolución(HPLC,highPerformanceLiquidChromatography, eninglés)comenzóa desarrollarseenlosaños1960,aumentandosu importanciaenlasdécadas
siguientes,hastaconvertirseenla técnica cromatográficamásempleada.Sinembargoestose irámodificandoconelpasode losaños.
Clasificación de los métodos de separación en cromatografía.
Lasdistintastécnicascromatográficasse puedendividirsegúncómoestédispuestala faseestacionaria:

5. -Cromatografíaplana.Lafaseestacionariase sitúasobreunaplacaplanao sobreunpapel.Lasprincipalestécnicasson:
-Cromatografíaenpapel.
-Cromatografíaencapafina
-Cromatografíaencolumna:Lafaseestacionariasesitúadentrode unacolumna.Segúnel fluidoempleadocomofasemóvilsedistinguen:
.Cromatografíade líquidos.
.Cromatografíaengases.
.Cromatografíade fluidossupercríticos.
Lacromatografíadegasesse aplicaa numerososcompuestosorgánicos. Enel casode compuestosno volátiles,se recurrea procesosdenominadosde
"derivatización", a finde convertirlosenotroscompuestosquese volatilicenenlascondicionesdeanálisis.

6. Dentrode la cromatografíalíquida, destacalacromatografíalíquidade altaresolución(HPLC,delinglésHighPerformanceLiquidChromatography), quees
la técnicacromatográficamásempleadaenlaactualidad,normalmenteensumodalidadde fasereversa,enlaquelafaseestacionariatienecarácterno polar,
y la fasemóvilposeecarácterpolar(generalmenteaguao mezclasconelevadaproporcióndela mismao de otrosdisolventepolares,comoporejemplo,
metanol).El nombrede "reversa"vienedadoporquetradicionalmentela faseestacionariaestabacompuestade síliceo alúmina,de carácterpolar,y portanto
la fasemóvileraundisolventeorgánicopocopolar. Unaserieeluotrópicaesunrangode sustanciasde diferentespolaridadesqueactúancomofasemóvily
quepermitenobservarunmejordesplazamientosobreunafaseestacionaria.
Tipos Fase móvil Fase estacionaria
Cromatografía en papel Líquido Papel de celulosa.
Cromatografía en capa fina Líquido Gel de sílice o alúmina.
Cromatografía en gases Gas
Columnas capilares de sílice fundida, con
recubrimientos internos de varios tipos de
siloxanos enlazados, columnas empaquetadas
con tierras diatomeas hechas de tubos de
vidrio o metal.
Cromatografía líquida en fase reversa Líquido (polar)
Relleno de siloxano de octilo o siloxano de
octadecilo.
Cromatografía líquida en fase normal
Líquido
(menos polar)
Relleno de sílice, alúmina o un soporte al que
se unen químicamente grupos polares (ciano,

7. Cromatografía líquida de intercambio
iónico
Líquido (polar) Resinas de intercambio iónico.
Cromatografía líquida de exclusión Líquido
Relleno de pequeñas partículas de sílice o
polímeros con red de poros uniforme.
Cromatografía líquida de adsorción Líquido
Partículas finamente divididas de sílice o
de alúmina.
Cromatografía de fluidos supercríticos Líquido
Columnas abiertas de sílice fundida con
recubrimientos internos de varios tipos
de siloxanos enlazados y de enlaces
cruzados.

8. Términos empleados en cromatografía.
-Analito:eslasubstanciaquese va a separardurantelacromatografía.
-Fasemóvil:eslafasequese mueveenuna direccióndefinida.Puedeserunlíquido(cromatografíade líquidoso CEC).ungas (cromatografíade gases)o un
fluidosupercrítico(cromatografíade fluidossupercríticos). Lamuestraqueestásiendoseparada/analizada(formadade analito/sy el disolvente)se inyectaen
la fasemóvilquese muevea travésde la columna.Enel casode la cromatografíalíquidade altaresolución, HPLC,la fasemóvilesundisolventeno-polarcomo
elhexano(fasenormal)o bienalgúndisolventepolar(cromatografíade fasereversa).
-Faseestacionaria:eslasustanciaqueestáfijaenunaposicióndurantelacromatografía.Un ejemploeslacapade gelde síliceenlacromatografíaencapa
fina.

9. -Cromatografíaanalítica:se empleaparadeterminarla existenciay posiblementetambiénla concentraciónde un analitoenunamuestra.
-Faseenlazada:esunafaseestacionariaquese unede formacovalente a laspartículasde soporteo a lasparedesinternasde la columa.
-Cromatograma:eselresultadográficode lacromatografía.Enelcasode separaciónóptima, losdiferentespicoso manchasdel cromatogramase
correspondena loscomponentesde la mezclaseparada.
-Cromatógrafo:esel equipoque permiteunaseparaciónsofisticada.Porejemplo,uncromatógrafode gaseso uncromatógrafode líquidos.
-Cromatografía:esel métodofísicode separaciónenelcualloscomponentesquesevana separarsedistribuyenentredosfases,unade lascualeses
estacionaria(faseestacionaria)mientrasla otra(lafasemóvil)se mueveenunadireccióndefinida.
-Eluyenteesla fasemóvilqueatraviesala columna.
-Serieeulotrópica: esunalistade disolventesclasificadossegúnsupoderdedilución.

10. -Faseinmovilizada: esuna faseestacionariaqueestáinmovilizadasobrepartículasde soporte, o enla paredinteriordeltubocontenedoro columna.
-Cromatografíapreparativa:seusaparapurificarsuficientecantidadde sustanciaparaun usoposterior,másque paraanálisis.
-Tiempode retención:eseltiempocaracterísticoquetardaun analitoparticularenpasara travésdelsistema(desdelacolumnade entradahastaeldetector)
bajolascondicionesfijadas.
-Muestra:eslamateriaqueva a seranalizadaenlacromatografía.Puedeconsistirenun simplecomponenteo unamezclade varios.Cuandolamezclaes
tratadaenelcursodelanálisis, lafaseo fasesque contienenlos analitosde interésesllamadaigualmentemuestramientraselrestode sustanciascuya
separaciónno resultade interésesllamada residuo.
-Soluto:escadaunode loscomponentesde la muestraqueva a serseparado.
-Disolvente:estodasustanciacapazde solubilizaraotra,yespecialmentela fasemóvillíquidaencromatografíade líquidos.
-Capacidadde cargaEs la cantidadmáximade muestraquepuedeserseparadaenunasolacarga.

11. -Capacidadde fraccionamiento:Es elnúmeromáximode componentesque puedenserseparadosenunasolaoperación.
-Selectividad:Es lacapacidaddepoderdiscriminary distinguirentredoscomponentes.