La técnica de recuento en placa se utiliza para determinar la presencia de Bacillus cereus en una muestra. La muestra se homogeneiza y se realizan diluciones sucesivas que luego se siembran en placas con agar MYP. Las placas se incuban y se cuentan las colonias rosadas con producción de lecitinasa, seleccionando placas con 15-150 colonias. El recuento de colonias permite calcular la concentración de B. cereus en la muestra original.

1. Técnica de Recuento en Placa

2. BAM: Manual Analítico Bacteriológico de la FDA
(Agencia de alimentos y medicamentos)
La técnica a seguir para la determinación de Bacillus
Cereus es la de Recuento en placa que se encuentra
en la 8va Edición del BAM de acuerdo al Método
de sedimentación en agar.

3. EQUIPOS Y MATERIALES
Placas de Petri
(15 x 100 mm)
Microscopio
Bastidor de tubos
Tubos de ensayo
Pipetas 1 ml
estériles
Asas de siembra
Matraces Erlenmeyer

4. Estufa Vortex mezclador
Incubadora
(30 ± 2 ° C y 35 ± 2 ° C)
Contador de colonias Quemador
BunsenHomogeneizador
Autoclave

5. MEDIO DE CULTIVO
Agar manitol yema de huevo con polimixina
( Mannitol - Egg – Yolk –Polymyxine AGAR: MYP)
Emulsión estéril de
yema de huevo
COMPOSICION
CONCENTRACION
DEL MEDIO
Peptona 10g/L
Extracto de carne
1g/L
D-manitol
10g/L
Cloruro sódico 10g/L
Rojo fenol 0,025g/L
Agar 15g/L 1 vial de Polimixina B

6. Preparación del Agar MYP
Pesar 21,5 g de Agar MYP
Agitar hasta ebullición
Disolver el Agar con 450ml
de agua destilada
1 2
4
Calentar el agar
3
Distribuir la mezcla en un matraz
y taponear con algodón
5 6
Esterilizar en autoclave a
121 ºC (15 psi) por 15 min

7. Agregar 50 ml de la emulsión estéril de yema de
huevo y el contenido de 1 vial de Polimixina B
Verter 15 – 20ml en placas
estériles y dejar solidificar
Enfriar a 45 – 50ºC en una
cubeta
Almacenar las placas en
bolsas de plástico a 2-8ºC
7
8
9
10

8. 1. Disolver 34 g de KH2PO4 en 500 mL de agua destilada
2. Ajustar el pH a 7.2 con NaOH 1N
3. Llevar al volumen de 1 L con agua destilada
4. Esterilizar por 15 minutos a 121°C
5. Almacenar en refrigeración
6. Tomar 1.25 mL de esta solución y llevar a 1 litro
con agua destilada

9. PREPARACION DE LA MUESTRA
10 g de avena en 90 ml de buffer
fosfato de Butterfield (dilución 1/10)
Homogeneizar diluyente por 2 min
a 2500 rpm
1
2
Realizar diluciones sucesivas tomando 1 ml de la dilución 1/10 y descargándolo
en un tubo que contenga 9 ml de diluyente, hasta la dilución 10 - 6
3
Mezclar cada
dilución en agitador

10. TÉCNICA DE RECUENTO EN PLACA
Sembrar 0,1 ml de cada dilución
por duplicado en la superficie de
placas de agar MYP
1

11. Incubar a 30°C por 24 h
2
3
Diseminar el inoculo con una
asa formando estrías

12. Formación de colonias rosadas rodeadas de una
zona de precipitación (producción de lecitinasa)
Seleccionar las placas que contienen entre 15 - 150 colonias
típicas rosadas con producción de lecitinasa
4
5
Picar 5 ó más de las colonias típicas aisladas
y transferir a una estría de agar nutritivo
para confirmación. Incubar 30 °C por 24h
6

13. EJEMPLO
Teniendo en cuenta que debes seleccionar las placas que contienes entre 15 –
150 colonias .
Supongamos:
En la dilución 10-4 se encontraron placas de 100 y 80 colonias, las cuales
están en el rango. Luego se hace un promedio entre las colonias de ambas
placas obteniendo como resultado 90 colonias.
UFC/alicuota = 90 UFC/ 0.1mL = 900 UFC/ mL
UFC*(inversa del factor de dilución) = 900 * 104 = 9*106 UFC/mL de la
muestra