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NORMA TÉCNICA                                                        NTC
COLOMBIANA                                                           4939

                                                                2001-05-30




CALIDAD DE AGUA.
ENUMERACIÓN DE COLIFORMES Y Escherichia
coli. TÉCNICA CON TUBOS DE FERMENTACIÓN Y
TÉCNICA DE SUSTRATO ENZIMÁTICO




E:       WATER QUALITY. COLIFORM AND ESCHERICHIA COLI
         COUNTING. FERMENTATION TUBE TECHNIQUE AND
         ENZYMATIC SUBSTRATE TECHNIQUE



CORRESPONDENCIA:


DESCRIPTORES:                       Coliformes, E. coli.




I.C.S.: 67.040, 07.100.20

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)
Apartado    14237      Bogotá,   D.C.   -  Tel.  6078888      -    Fax    2221435



Prohibida su reproducción
PRÓLOGO



El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo
nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.

ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.

La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica
está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último
caracterizado por la participación del público en general.

La NTC 4939 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2001-05-30.

Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.

A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a
través de su participación en el Comité Técnico 000031 Microbiología.

ACEGRASAS                                         FRIGORÍFICOS SUIZO S.A.
ALPINA S.A.                                       GASEOSAS COLOMBIANAS S.A.
AQUALAB                                           GASEOSAS LUX
ASINAL LTDA                                       ICA
AVESCO                                            INGENIO PICHICHI
BIOQUILAB LTDA.                                   INGENIO RIOPAILA
CALIDAD MICROBIOLÓGICA                            IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA.
CALIDAD TOTAL                                     LESNIAK E.U.
CARULLA Y CÍA.                                    MEALS S.A.
CERVECERÍA LEONA                                  NESTLÉ DE COLOMBIA S.A.
EMPRESA DE ACUEDUCTO Y                            NULAB LTDA.
ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ                          PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOS
FÁBRICA DE ESPECIAS Y PRODUCTOS                   QUIOS LTDA
EL REY S.A.                                       TECNOCLEAN DE COLOMBIA
FRIGORÍFICOS COLOMBIANOS S.A.                     TRES M DE COLOMBIA

Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las
siguientes empresas:

ALGARRA                                           DISA S.A.
ASEBIOL                                           EMPRESA DE ACUEDUCTO Y
BEATRIZ DEL PILAR MACÍAS                          ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ
CASA LUKER S.A.                                   HACIENDA SANTA HELENA
COLOMBINA S.A.                                    INVIMA
COLSUBSIDIO                                       LA CAMPIÑA S.A.
COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES                   LABORATORIO MICROBIOLOGÍA PARA
CONGELAGRO                                        LA CALIDAD DE LOS ALIMENTOS
CONSESIONARIO TIBITOC                             LABORATORIO PROCALIDAD
LABORATORIOS GRAM                            PRODUCTORA DE JUGOS S.A.
LLOREDA GRASAS S.A.                          QUALA S.A.
MERCK                                        RICA RONDO
MINISTERIO DE SALUD                          UNIDAD ADMINISTRATIVA DE SALUD
PANAMCO COLOMBIA MANANTIAL                   PÚBLICA
PASSIFLORA COLOMBIANA S.A.                   UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO
PROCESADORA DE LECHE S.A.                    UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.

                                                    DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                  NTC 4939




CALIDAD DE AGUA.
ENUMERACIÓN DE COLIFORMES Y Escherichia coli.
TÉCNICA CON TUBOS DE FERMENTACIÓN Y TÉCNICA
DE SUSTRATO ENZIMÁTICO




1.     OBJETO

La presente norma especifica dos métodos para la enumeración de Coliformes y E. coli. El
Método A describe la Técnica de tubos de fermentación y el Método B describe la Técnica de
Substrato enzimático empleando tubos múltiples, presencia y ausencia o multiceldas en
muestras de agua tratada, cruda o residual, de acuerdo con lo propuesto por el Standard
Methods 20 edición 1998.


                                           Método A

                            Técnica de los tubos de fermentación


2.     DEFINICIÓN

Para los propósitos de este método se aplica la siguiente definición.

Coliformes: bacterias gramn negativas que a la temperatura especificada (35 °C ± 2 °C) causan
fermentación de lactosa con producción de gas en las condiciones de ensayo especificadas en
este método.


3.     PRINCIPIO

3.1    PRUEBA PRESUNTIVA

Inoculación de quince tubos con medio selectivo líquido (Véase el numeral 4.2), con serie de
cinco tubos con 10 ml, 1,0 ml y 0,1 ml de muestra de ensayo respectivamente ó diez tubos con
medio selectivo líquido con 10ml de la muestra de ensayo o inoculación de cinco tubos con
medio selectivo líquido con 20 ml de la muestra de ensayo.

3.2    Incubación a 35 °C ± 0,5 °C de los tubos inoculados durante 24 h a 48 h y análisis de
estos tubos.




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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                    NTC 4939

3.3    PRUEBA CONFIRMATIVA

Aislamiento de los cultivos procedentes de la serie de tubos en los cuales se haya observado
formación de gas y acidez en medio líquido para confirmación (Véase el numeral 4.3).

3.4    Incubación a 35 °C ± 0,5 °C durante 24 h

3.5   Cálculo del número más probable de coliformes por 100 ml de muestra (es decir el
NMP), a partir del número de tubos que muestren formación de gas, usando una tabla para
determinación de números más probables.

3.6    Para establecer la presencia de coliformes y establecer una carta de control de calidad,
se utiliza el ensayo completo sobre al menos el 10 % de los tubos confirmados.
Simultáneamente se inoculan en Caldo bilis verde brillante lactosa para coliformes totales y
caldo EC para coliformes fecales o EC+MUG para E. coli a 44,5 ºC. Los resultados positivos de
la prueba indican un ensayo completo

Paralelamente la presencia de tubos positivos en caldo bilis verde brillante pero negativos en
caldo EC o EC+MUG indican la presencia de coliformes no fecales


4.     MEDIOS DE CULTIVO

4.1    GENERALIDADES

En la NTC 4092 (ISO 7218) se presenta información sobre la práctica actual de laboratorio.

4.2    CALDO LAURYL TRIPTOSA

           Composición
              Triptosa                                             20 g
              Lactosa                                              5,0 g
              Fosfato dipotásico K2HPO4                           2,75 g
              Fosfato de potasio KH2PO4                           2,75 g
              Cloruro de sodio NaCl                                5,0 g
              Lauril sulfato de sodio                              0,1 g
              Agua destilada, desionizada                        1 000 ml



Preparación

El caldo lauryl triptosa debe prepararse teniendo en cuenta que la concentración original del
medio debe mantenerse al adicionar la muestra. Por ejemplo: se prepara el medio a doble
concentración si el volumen de la muestra es igual al volumen del medio a utilizar.

Se añaden los ingredientes deshidratados al agua destilada, se mezcla cuidadosamente y se
caliente para disolverlo. El pH deberá ser de 6,8 ± 0,2 después de la esterilización.

Antes de esterilizarlo, se agrega caldo a los tubos de fermentación en cantidad suficiente para
cubrir los tubos durham invertidos, (al menos parcialmente después de la esterilización). Se
cierran los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor.



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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                       NTC 4939

Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min.

Los tubos de fermentación no deben contener burbujas de aire después de la esterilización.

Como alternativa, se omite el tubo durham invertido y se añade 0,01 g/l de púrpura
bromocresol al medio presuntivo para determinar la producción de ácido en lugar de la
formación de gas, lo que indicaría un resultado positivo en esta parte de la prueba.

4.3    CALDO LACTOSA BILIS VERDE BRILLANTE (MEDIO SELECTIVO)

          Composición
           Peptona                                                            10 g
           Lactosa                                                            10 g
           Bilis de buey deshidratada (sales biliares) OXGALL                 20 g
                             1
           Verde brillante                                                0,0133 g
           Agua destilada, desionizada                                    1 000 ml



Preparación

Se añaden los ingredientes deshidratados al agua, se mezcla cuidadosamente y se calienta
para disolverlos. El pH debe ser de 7,2 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizarlo,
se colocan en tubos de fermentación con un tubo durham invertido, una cantidad suficiente de
medio como para que cubra este, al menos parcialmente, después de la esterilización. Se
cierran los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor.

Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min.

Los tubos de fermentación no deben contener burbujas de aire después de la esterilización.

4.4    CALDO E C

           Composición
            Triptosa                                                  20 g
            Lactosa                                                   3,0 g
            Fosfato dipotásico K2HPO4                                2,75 g
            Fosfato de potasio KH2PO4                                2,75 g
            Cloruro de sodio NaCl                                     5,0 g
            Lauryl sulfato de sodio                                   0,1 g
            Agua destilada, desionizada                             1 000 ml



Preparación

Se añaden los ingredientes deshidratados al agua, se mezcla cuidadosamente y se caliente
para disolverlos. El pH debe ser de 6,8 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizarlo,
se colocan en tubos de fermentación con un tubo durham invertido, una cantidad suficiente de
medio como para que cubra este, al menos parcialmente, después de la esterilización. Se
cierran los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor.




                                                     3
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                          NTC 4939

Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min.

Los tubos de fermentación no de           en contener burbujas de aire después de la esterilización.

4.5       AGAR LES ENDO

 Composición
  Peptona                                                                 10 g
  Lactosa                                                                 10 g
  Fosfato dipotásico K2HPO4                                               2,5 g
  Sulfito sódico anhidro                                                  3,3 g
  Pararrosanilina (fuscina)                                               0,3 g
  Agar                                                                    12,5
  Agua destilada, desionizada                                            1 000 ml



Preparación

Se añaden los ingredientes deshidratados al agua, se mezcla cuidadosamente y se caliente
para disolverlos. El pH debe ser de 7,4 ± 0,2 después de la esterilización.

Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min.

Se vierten en cajas de petri de 100 mm x 15 mm

4.6       AGAR MACCONKEY


   Composición
       Peptona caseinada                                                  17,0 g
       Peptona de carne Proteasa                                          3,0 g
       SorbitolLactosa                                                    10,0 g
       Sales biliares No.3                                                1,5 g
       Cloruro de sodio                                                   5,0 g
       Rojo neutro                                                        0,03 g
       Violeta cristal                                                   0,001 g
                                                                                     a
       Agar                                                            12 g a 15 g
       Agua                                                              1 000 ml
   a
          Dependiendo de la concentración de gel del agar



Preparación

Se añaden los ingredientes al agua, se mezcla cuidadosamente y se caliente hasta ebullición para
disolverlos. Se esteriliza en el autoclave por 15 min a 121 °C. Tras la esterilización, se vierte el agar
en cajas de petri (100 mm x 15 mm). El pH debe ser de 7,1 ± 0,2 después de la esterilización.




                                                        4
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                        NTC 4939

4.7     AGAR NUTRITIVO

           Composición
            Extracto de carne                                         3,0 g
            Peptona                                                   5,0 g
            Cloruro de sodio                                          5,0 g
                                                                                 a
            Agar                                                   12 g a 18 g
            Agua                                                    1 000 ml
            a
                Dependiendo de la concentración de gel del agar.



Preparación

Se añaden los ingredientes al agua, se mezcla cuidadosamente y se caliente para disolverlos.
El pH debe ser de 6,8 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizar, se dispensa el
medio en tubos con tapón de rosca. Después de la esterilización, inmediatamente coloque en
posición inclinada, de forma que el agar solidifique formando pendiente. Ajustar los tapones
después de que se hayan enfriado y conserve en una zona fría y protegida.

4.8     REACTIVOS PARA LA TINCIÓN DE GRAM

4.8.1   Oxalato de amonio - cristal violeta (de Hucker)

Se disuelven 2 g de cristal violeta (con un contenido de colorante del 90 %) en 20 ml de alcohol
etílico al 95 %; se disuelven 0,8 g de (NH4)2C2O4.H2O en 80 ml de agua destilada; se mezclan
ambas soluciones y se deja reposar durante 24 h antes de usarlas; se filtra a través de un
papel y se conserva en un frasco de tinción.

4.8.2   Solución de Lugol, modificación de Gramn

Se tritura en un mortero, 1 g de cristales de yodo y 2 g de KI. Se añade lentamente agua
destilada y se tritura con cuidado después de cada adición hasta que se complete la solución.
Se almacena en una botella de vidrio ámbar, añadiendo el resto del agua (usando un total de
300 ml).

4.8.3   Contraste

Se disuelven 2,5 g de safranina en 100 ml de alcohol etílico al 95 %. Se añaden de 10 ml a
100 ml de agua destilada.

4.8.4   Alcohol acetona

Se mezclan partes iguales de alcohol etílico al 95 % y acetona.




                                                      5
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                           NTC 4939

4.9     CALDO E C + MUG

             Composición
              Triptosa o tripticasa                                                 20 g
              Lactosa                                                              5,0 g
              Mezcla de sales biliares o sales biliares No. 3                      1,5 g
              Fosfato dipotásico K2HPO4                                            4,0 g
              Fosfato de potasio KH2PO4                                            1,5 g
              Cloruro de sodio NaCl                                                5,0 g
              4-methylumberiferil B D glucoronidasa MUG                            0,05 g
              Agua destilada, desionizada                                        1 000 ml



Preparación

Se disuelven los componentes o el medio completo deshidratado en el agua, mediante
calentamiento si es necesario.

Se ajusta el pH, si es necesario, de tal modo que después de la esterilización sea 6,9 +/-2 a
25 °C.

Se distribuye el medio, en cantidades de 10 ml en tubos de ensayo de 16 mm x 180 mm (véase
el numeral 5.4)

Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min. Los tubos no deben
presentar fluorescencia bajo la luz UV a 366nm

No es necesario utilizar tubos invertidos. Las tapas pueden ser metálicas o plásticas resistentes
al calor


5.      APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO


Nota 1. Si el material desechable tiene especificaciones adecuadas, es una alternativa aceptable frente al material de
vidrio reutilizable.



Equipo usual de laboratorio microbiológico y, en particular, lo siguiente. Véase la NTC 4092
(ISO 7218).

5.1     APARATO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIÓN EN
        HÚMEDO (AUTOCLAVE)

Véase la NTC 4092 (ISO 7218).

5.2     INCUBADORA

Con capacidad de funcionar a 35 °C ± 2 °C.

5.3     ASAS

Hechas de platino/iridio o níquel/cromo o asas desechables.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                      NTC 4939

5.4    TUBOS DE ENSAYO

Con capacidad apropiada para la esterilización y almacenamiento de medios de cultivo y la
incubación de medios.

5.5    TUBOS DURHAM

Con capacidad de 50 mm x 10 mm

5.6    PIPETAS DE ENTREGA TOTAL

Con capacidad nominal de 1ml y 10 ml, graduadas respectivamente en divisiones de 0,1 ml y
0,5 ml.

5.7    MEDIDOR DE PH

Con capacidad para dar lecturas con aproximación a 0,01 unidades de pH a 25 °C, que permita
realizar mediciones con una exactitud de ± 0,1 unidad de pH

5.8    PIPETEADOR

5.9    CAJAS PETRI


6.     MUESTREO

Para la toma de muestra y muestreo seguir los procedimientos descritos por el Standard
Methods Parte 9060 Capítulo 9-17 ó NTC-ISO 5667-3, NTC-ISO 5667-5 y NTC-ISO 5667-14.


7.     PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO

Se comienza el examen microbiológico de las aguas máximo 24 h después de su recolección.
Si se sabe que el resultado puede ser usado para una acción legal analizar la muestra antes de
6 h, manteniéndola refrigerada y con cadena de custodia


8.     PROCEDIMIENTO

Véase el diagrama del Anexo A (Normativo).

8.1    MUESTRA DE ENSAYO, SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES

                         Tabla 1. Preparación del medio líquido de Lauril Triptosa

                                                                                     Medio líquido de lauril
          Inóculo        Cantidad de medio en el        Volumen del medio +          triptosa deshidratado
            ml                    tubo                        inóculo                      requerido
                                   ml                           ml                              g/l
            1                   10 o más                     11 o más                          35,6
           10                      10                            20                            71,2
           10                      20                            30                            53.4
           20                      10                            30                           106,8
           100                     50                           150                           106,8
           100                     35                           135                           137,1
           100                     20                           120                           213,6



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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                    NTC 4939

8.2    PRUEBA PRESUNTIVA (Inoculación e incubación)

Se agrupan los tubos de fermentación en hileras de cinco o diez en una gradilla para tubos de
ensayo. El número y el volumen de los tubos de muestra seleccionados dependen de la
cantidad y de las características del agua que se vaya a estudiar.

Para agua potable: se utilizan cinco porciones de 20 ml o diez porciones de 10 ml, o una sola
botella de 100 ml.

Si se trata de agua no potable: se utiliza cinco tubos por dilución (de 10 ml, 1 ml, 0,1 ml, etc.).

Se agita vigorosamente la muestra y las diluciones unas 25 veces. Se inocula cada tubo en un
grupo de cinco con volúmenes duplicados de muestra (en diluciones decimales crecientes, si
se utilizan cantidades decimales de la muestra). Se mezclan las porciones a estudiar mediante
agitación suave. Se verifica que en los tubos durham invertidos no halla quedado aire.

Se incuban los tubos inoculados o las botellas a 35 °C ± 0,5 °C. Después de 24 h ± 2 h, se
agita cada tubo o botella suavemente y se observa si se produce crecimiento, gas o una
reacción ácida (color amarillo) y, en caso contrario, se reincuba y se vuelve a examinar al final
de 48 h ± 3 h. Se registra la presencia o ausencia de crecimiento, gas y reacción ácida. Si no
se ha utilizado el tubo de durham, un crecimiento con acidez significa una presunta reacción
positiva.

Interpretación. La aparición de gas o ácido en los tubos o botellas dentro de las 48 h ± 3 h
constituye una presunta reacción positiva. Los tubos con este tipo de reacción deben ser
estudiados en la fase confirmatoria.

La ausencia de reacción ácida o de formación de gas al finalizar las 48 h ± 3 h de incubación
indica una reacción negativa.

Se someten las muestras de agua potable que demuestren crecimiento sin una reacción ácida
o formación de gas a la fase confirmatoria. El límite arbitrario de 48 h para la observación
excluye sin ninguna duda a los miembros ocasionales del grupo coliforme que crecen de
manera muy lenta

8.3    PRUEBA CONFIRMATIVA

Se someten todos los tubos o botellas de la fase presuntiva que muestren crecimiento,
cualquier cantidad de gas o reacción ácida dentro de las 24 h ± 2 h de incubación a la fase
confirmatoria. Si se observa una fermentación activa o un crecimiento ácido antes de las 24 h ± 2 h,
transfiera al medio de confirmación; preferiblemente examine los tubos a las 18 h ± 1 h. Si hay
otros tubos o botellas de la fase presuntiva con crecimiento ácido después de las 48 h ± 3 h de
incubación, también se llevarán a la fase confirmatoria.

Se agitan suavemente o se hacen rotar los tubos o botellas de la fase presuntiva que muestren
gas o crecimiento ácido para que se produzca una resuspensión de los microorganismos.

Con una asa estéril de 3,0 mm a 3,5 mm de diámetro, se transfiere un asa completa de cultivo
al tubo de fermentación que contiene el medio verde brillante de lactosa bilis o introduzca un
aplicador de madera estéril en el cultivo, de al menos 2,5 cm, se retira rápidamente y se
introduce hasta el fondo en la botella o el tubo de fermentación con el medio mencionado.




                                                 8
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                   NTC 4939

Se retira y desecha el aplicador. Se repite esta operación para todos los tubos posiblemente
positivos.

Se incuba el medio de verde brillante lactosa bilis a 35 °C ± 0,5 °C. La formación de cualquier
cantidad de gas en el tubo durham invertido en el medio de fermentación verde brillante de
lactosa bilis a cualquier tiempo (por ejemplo, 6,0 h ± 1 h, 24 h ± 2 h) dentro de las 48 h ± 3 h
constituye un resultado positivo en la fase confirmatoria.

Se calcula el NMP a partir del número de tubos positivos en el medio de fermentación verde
brillante de lactosa bilis.

Procedimiento alternativo. Se usa esta alternativa sólo para aguas contaminadas o
residuales que se sepa presenten sistemáticamente resultados positivos.

En caso de que todos los tubos sean positivos en dos o más diluciones consecutivas durante
24 h, lleve sólo a la fase confirmatoria los tubos de la dilución más alta (menor muestra de
inóculo) en la cual todos los tubos son positivos y algunos tubos positivos en diluciones aún
más altas.

Se somete a la fase confirmatoria todos los tubos que presenten gas o crecimiento ácido sólo
después de las 48 h.

8.4    PRUEBA COMPLETA

Para establecer la presencia de bacterias coliformes y obtener datos sobre el control de
calidad, se usa la prueba completa sobre por lo menos el 10 % de los tubos positivos
confirmados.

Simultáneamente, se inocula en medio líquido verde brillante de lactosa bilis para coliformes
totales y medio líquido EC para coliformes fecales o puede ser usado medio líquido EC-MUG
para Escherichia coli.

Se consideran como respuesta positiva de la prueba completa los resultados positivos en caldo
medio líquido EC y medio líquido EC-MUG a temperatura elevada (44,5 °C).

Los cultivos que sean positivos en medio de verde brillante lactosa bilis y negativos en medio
EC y EC-MUG indican la presencia de coliformes no fecales.

Se siembra asépticamente una placa de agar LES Endo o agar MacConkey por cada tubo de
medio verde brillante lactosa bilis que ha producido gas; se realiza la operación lo antes posible
tras la detección del gas.

Se siembran las cajas de forma que asegure la existencia de algunas colonias aisladas,
separadas por al menos 0,5 cm. Si existen coliformes y se quiere obtener una elevada
proporción de aislamientos satisfactorios, se deben tener las siguientes precauciones: (a) Se
utiliza un asa estéril de 3 mm de diámetro o una aguja de inoculación ligeramente curvada en la
punta; (b) se abre e inclina el tubo de fermentación evitando la toma con la aguja de cualquier
membrana o espuma; (c) se introduce el extremo del asa o la aguja en el líquido del tubo a una
profundidad de alrededor de 0,5 cm, y (d) se siembra la caja con la parte curvada de la aguja
en contacto con el agar para no arañar la superficie.

Se flamea el asa entre los cuadrantes segundo y tercero para mejorar el aislamiento de las
colonias.


                                                9
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                   NTC 4939

Se incuban las cajas invertidas a 35 °C ± 0,5 °C durante 24 h ± 2 h.

Las colonias que se desarrollan en el agar LES Endo pueden definirse como típicas (rosas a
rojo oscuras con un brillo verde metálico superficial) o atípicas (rosas, rojas, blancas o incoloras
sin brillo) a las 24 h de incubación.

Las colonias típicas de la fermentación de la lactosa desarrolladas sobre el agar MacConkey
son rojas y pueden estar rodeadas por una zona opaca de precipitado biliar.

Se toma de cada caja una o más colonias típicas bien definidas o, si no existen, dos o más
entre las que se consideren como probablemente formadas por microorganismos del grupo
coliforme y se las pasa a un tubo de fermentación con medio de lauril triptosa y a uno con agar
en inclinado (este último no es necesario si se trata de muestras de agua potable).

Si es necesario, utilice una lupa para colonias a fin de conseguir un aumento óptimo a la hora
de tomarlas de las cajas de agar LES Endo o agar MacConkey.

Cuando se transfiera las colonias, se eligen las que estén bien aisladas y se toca apenas su
superficie con una aguja esterilizada a la llama, enfriada al aire para evitar en lo posible el
peligro de transferir un cultivo mixto.

Se incuban los tubos con el medio secundario (medio líquido de lauril triptosa con tubos
durham de fermentación invertidos) a 35 °C ± 0,5 °C durante 24 h ± 2 h; si no se produce gas
en este período se prolonga la incubación hasta 48 h ± 3 h.

Se estudian microscópicamente las preparaciones teñidas con Gram y obtenidas en los cultivos
de pendiente de agar a las 24 h, correspondientes a los tubos secundarios que muestren gas.

Tinción de Gram. Si se trata de muestras de agua potable, se puede prescindir de la tinción de
Gramn en la prueba completa, ya que es raro que existan bacterias gramnpositivas y
microorganismos esporulados sobrevivientes en este método de detección selectiva.

Existen varias modificaciones de la técnica de Gramn. Se utiliza la modificación de Hucker para
teñir las extensiones de cultivos puros; se incluye un control para organismos grampositivos y
otro para gramnegativos.

Se preparan emulsiones ligeras distintas de los crecimientos bacterianos en estudio y de los
cultivos de control positivos y negativos sobre el mismo porta, utilizando para ello gotas de
agua destilada colocadas en el cristal.

Se dejan secar al aire y se fijan pasando el porta sobre una llama, se tiñen por 1 min con la
solución de oxalato de amonio cristal violeta. Se enjuaga con agua corriente y se aplica la
solución de Lugol durante 1 min.

Se lava de nuevo el porta teñido con agua corriente. Se decolora durante aproximadamente
15 s - 30 s con alcohol acetona, manteniendo el porta entre los dedos y deje que el alcohol
acetona fluya por la extensión teñida hasta obtener un líquido incoloro. No decolore en exceso.

Contraste con safranina durante 15 s, lave con agua corriente, seque con papel absorbente o al
aire y examine microscópicamente. Los microorganismos grampositivos son azules y los
gramnegativos rojos. Los resultados sólo son aceptables cuando los controles dan la reacción
adecuada.



                                                10
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                           NTC 4939

Interpretación. El resultado positivo de la prueba completa requiere la formación de gas en los
tubos secundarios con medio de lauril triptosa en 48 h ± 3 h y la demostración de bacterias
alargadas gramnegativas no esporuladas procedentes de los cultivos con agar, lo que
demuestra la presencia de un miembro del grupo coliforme.


9.     EXPRESIÓN DE RESULTADOS

9.1    PRECISIÓN DE LA PRUEBA DE TUBOS DE FERMENTACIÓN

A menos que se estudien numerosas porciones de la muestra, la precisión de la prueba de
tubos de fermentación es muy baja. Por ejemplo, si sólo 1 ml es examinado en una muestra
que contiene 1 coliforme/ml, casi un 37 % de los tubos de 1 ml pueden producir resultados
negativos, debido a la distribución aleatoria de las bacterias en la muestra.

Cuando en estas condiciones se utilizan cinco tubos, cada uno con 1 ml de la muestra, se
puede esperar un resultado completamente negativo en alrededor de 1 % de las veces.

Aunque se utilicen cinco tubos de fermentación, la precisión de los resultados no es muy
elevada. Por tanto, hay que tener cuidado a la hora de interpretar el significado sanitario de los
resultados de coliformes obtenidos cuando se utilizan pocos tubos con dilución de muestra,
sobre todo cuando el número de muestras de una toma es limitado.

9.2    CÁLCULO Y REGISTRO DEL NMP

Para calcular la densidad de coliformes, se calcula en términos del Número Más Probable
(NMP). Las Tablas 2, 3 y 4 indican los valores del NMP para distintas series de siembras y
resultados. En estas tablas se contemplan límites de confianza del 95 % para cada valor del NMP.

Si los volúmenes de la muestra utilizados son los contenidos en las tablas, se reporta el valor
correspondiente al número de resultados positivos y negativos en las series en forma de
NMP/100 ml o se reporta como presencia o ausencia de coliformes totales o fecales.

Los volúmenes de muestra indicados en las Tablas 2 y 3 están relacionados de forma más
específica con las aguas terminales.

La Tabla 4 ilustra los valores de NMP para combinaciones de resultados positivos y negativos
cuando se estudian volúmenes de cinco muestras de 10 ml, 1 ml y 0,1 ml.

En caso de que las series de diluciones decimales sean distintas de las de la tabla, se
seleccionan los valores de NMP de la Tabla 4 por la combinación de tubos positivos,
calculando de acuerdo con la siguiente fórmula:


                                                             10
                   Valor del NMP (de la tabla) x                           = NMP / 100 ml
                                                   Mayor volumen estudiado



Cuando se utilice más de tres diluciones en series de diluciones decimales, sólo se tomarán los
resultados de tres de ellas para calcular el NMP.




                                                       11
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                             NTC 4939

Para seleccionar las tres diluciones por utilizar en la determinación del índice del NMP, se
escoje la dilución más alta con resultado positivo entre las cinco estudiadas (no hay ninguna
dilución menor que haya dado un resultado negativo) y las dos siguientes diluciones más altas.

Se usan los resultados de estos tres volúmenes para calcular el índice del NMP. En el ejemplo
siguiente, los resultados de la dilución significativa se dan en negritas. El numerador
representa los tubos positivos y el denominador, el total de tubos estudiados; la combinación
de positivos indica únicamente el número total de tubos positivos por dilución:


                                                                                     Combinación Índice NMP /
     Ejemplo           1 ml             0,1 ml          0,01 ml        0,001 ml
                                                                                     de positivos   100 ml
         a              5/5               5/5             2/5             0/5            5-2-0           5 000
         b              5/5               4/5             2/5             0/5            5-4-2           2 200
         c              0/5               1/5             0/5             0/5            0-1-0                20



En c, se selecciona las tres primeras diluciones, de manera que se incluya el resultado positivo
en la dilución media.

Cuando se presenta un caso como el que se muestra a continuación en la línea d, en el que
una dilución muestra un positivo mayor que las tres elegidas según la regla general, el
resultado se incorpora a la mayor de las diluciones elegidas, como sucede en e:


                                                                                     Combinación Índice NMP /
     Ejemplo           1 ml             0,1 ml          0,01 ml        0,001 ml
                                                                                     de positivos   100 ml
         d              5/5               3/5             1/5             1/5            5-3-2           1 400
         e              5/5               3/5             2/5             0/5            5-3-2           1 400



Si desea resumir en un solo valor de NMP los resultados de una serie de muestras, se recurrirá
a la media geométrica o la mediana.

En la Tabla 4 se muestran las combinaciones de tubos positivos más probables. Si aparecen
combinaciones poco probables con una frecuencia superior al 1 %, hay que pensar que la
técnica es inadecuada o que no se ha cumplido por completo el supuesto estadístico en que se
basa el cálculo del NMP.

El NMP para combinaciones que no aparecen en la tabla, o para otras combinaciones de tubos
o diluciones, puede calcularse mediante la sencilla fórmula de Thomas:


                                                      No. de tubos positivos
             NMP/100 ml =                                                                             x 100
                              ml de muestra en los tubos negativos x ml de muestra en todos los tubos



Aunque los cálculos del NMP se facilitan para su uso en la prueba de coliformes, también son aplicables para
determinar el NMP de cualquier otro microorganismo, siempre que se disponga de los medios de estudio
adecuados.




                                                          12
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                    NTC 4939


  Tabla 2. Índice de NMP y límites de aceptación del 95 % para distintas combinaciones de resultados
                   positivos y negativos cuando se emplean cinco porciones de 20 ml


    No. de tubos que                                  Límites de confianza del 95 % (aproximados)
                                  Índice
 dan reacción positiva de
                                   NMP/
    un total de cinco
                                  100 ml                   Superior                  Inferior
       de 20 ml c/u

            0                       <2,2                      0,0                       6,0
            1                       2,2                       0,1                      12,6
            2                       5,1                       0,5                      19,2
            3                       9,2                       1,6                      29,4
            4                       16,0                      3,3                      52,9
            5                      >16,0                      8,0                     Infinito



  Tabla 3. Índice de NMP y límites de aceptación del 95 % para distintas combinaciones de resultados
                    positivos y negativos cuando se emplean diez porciones de 10 ml




    No. de tubos que                                  Límites de confianza del 95 % (aproximados)
                                  Índice
 dan reacción positiva de
                                   NMP/
     un total de diez
                                  100 ml
       de 10 ml c/u                                        Superior                  Inferior

            0                      <1,1                       0,0                       3,0
            1                       1,1                      0,03                       5,9
            2                       2,2                      0,26                       8,1
            3                       3,6                      0,69                      10,6
            4                       5,1                       1,3                      13,4
            5                       6,9                       2,1                      16,8
            6                       9,2                       3,1                      21,1
            7                      12,0                       4,3                      27,1
            8                      16,1                       5,9                      36,8
            9                      23,0                       8,1                      59,5
           10                      >23,0                     13,5                     Infinito




                                                 13
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                    NTC 4939

  Tabla 4. Índice de NMP y límites de aceptación del 95 % para distintas combinaciones de resultados
          positivos y negativos cuando se usan cinco tubos por dilución (10 ml, 1,0 ml, 0,1 ml)




                                  Índice              Límites de confianza del 95 % (aproximados)
     Combinación
                                   NMP/
     de positivos
                                  100 ml                   Superior                  Inferior

          0-0-0                     <2                         -                         -
          0-0-1                     2                         1,0                       10
          0-1-0                     2                         1,0                       10
          0-2-0                     4                         1,0                       13

          1-0-0                      2                        1,0                       11
          1-0-1                      4                        1,0                       15
          1-1-0                      4                        1,0                       15
          1-1-1                      6                        2,0                       18
          1-2-0                      6                        2,0                       18

          2-0-0                      4                        1,0                       17
          2-0-1                      7                        2,0                       20
          2-1-0                      7                        2,0                       21
          2-1-1                      9                        3,0                       24
          2-2-0                      9                        3,0                       25
          2-3-0                      12                       5,0                       29

          3-0-0                      8                        3,0                       24
          3-0-1                      11                       4,0                       29
          3-1-0                      11                       4,0                       29
          3-1-1                      14                       6,0                       35
          3-2-0                      14                       6,0                       35
          3-2-1                      17                       7,0                       40

          4-0-0                      13                       5,0                       38
          4-0-1                      17                       7,0                       45
          4-1-0                      17                       7,0                       46
          4-1-1                      21                       9,0                       55
          4-1-2                      26                       12                        63
          4-2-0                      22                        9                        56
          4-2-1                      26                       12                        65
          4-3-0                      27                       12                        67
          4-3-1                      33                       15                        77
          4-4-0                      34                       16                        80
                                                                                         Continúa . . .




                                                 14
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                  NTC 4939

                                          Tabla 4. (Final)


                                 Índice               Límites de confianza del 95 % (aproximados
       Combinación
                                  NMP/
       de positivos
                                 100 ml                      Superior               Inferior

          5-0-0-                   23                           9                     86
          5-0-1                    30                           10                   110
          5-0-2                    40                           20                   140
          5-1-0                    30                           10                   120
          5-1-1                    50                           20                   150
          5-1-2                    60                           30                   180
          5-2-0                    50                           20                   170
          5-2-1                    70                           30                   210
          5-2-2                    90                           40                   250
          5-3-0                    80                           30                   250
          5-3-1                   110                           40                   300
          5-3-2                   140                           60                   360
          5-3-3                   170                           80                   410
          5-4-0                   130                           50                   390
          5-4-1                   170                           70                   480
          5-4-2                   220                          100                   580
          5-4-3                   280                          120                   690
          5-4-4                   350                          160                   820
          5-5-0                   240                          100                   940
          5-5-1                   300                          100                   1300
          5-5-2                   500                          200                   2000
          5-5-3                   900                          300                   2900
          5-5-4                  1600                          600                   5300
          5-5-5                  >1600                           -                     -



10.    INFORME DE ENSAYO

En el informe de ensayo se debe especificar el método usado, la temperatura seleccionada, y
los resultados obtenidos. También se deben mencionar todos los detalles de las operaciones
no especificados en esta norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles de
cualesquier incidente que puedan haber influido en los resultados.

En el informe de ensayo se debe incluir toda la información necesaria para la identificación
completa de la muestra.


                                           Método B

                              Técnicas con sutrato enzimático


11.    DEFINICION

Para los propósitos de este método se aplican las siguientes definiciones:

Bacterias Coliformes Totales

Cuando se utiliza la técnica enzimática, el grupo Coliforme Total se define como toda bacteria
que posea la Enzima β-D galactosidasa; la cual tiene la propiedad de abrir el substrato
cromogénico, resultando en la liberación del cromógeno.


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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                  NTC 4939

Escherichia coli

Cuando se utiliza la técnica enzimática, la Escherichia coli es definida, como toda bacteria que
da respuesta positiva al grupo Coliforme Total y además posee la enzima β-glucoronidasa, la
cual tiene la propiedad de abrir el substrato fluorogénico, resultando en la liberación del
fluorógeno.


12.    PRINCIPIO

Bacterias Coliformes Totales

Substratos cromogénicos tales como Orto-nitrofenil-β-D-galactopiranosido (ONPG) o clorofenol
rojo β-D-galactopiranósido (CPRG) son utilizados para detectar la enzima β-D- galactosidasa la
cual es producida por las Bacterias Coliformes Totales. La enzima β-D-galactosidasa hidroliza
el substrato y produce un cambio de color, lo cual indica una prueba positiva para Coliformes
totales en 24 h (ONPG) o 28 h (CPRG) sin procedimientos adicionales.

Escherichia coli

Un substrato fluorogénico tal como 4-metil-umbeliferil-β-D-glucoronido (MUG) es utilizado para
detectar la enzima β-glucoronidasa la cual es producida por E.coli. La enzima β-glucoronidasa
hidroliza el substrato y da un producto fluorescente cuando es revelado bajo luz ultravioleta de
onda larga (366 nm). La presencia de fluorescencia indica una prueba positiva para E.coli.

El medio de cultivo utilizado se basa en la tecnología del substrato definido, el cual emplea
nutrientes - indicadores que producen color y/o fluorescencia al ser metabolizados por los
microorganismos Coliformes Totales y E coli; los cuales son detectados simultáneamente.

El reactivo proporciona dos nutrientes indicadores específicos: ONPG (O- nitrofenil -β-d-
galactopiranósido) y MUG ( 4-metil-umbeliferil-β- D- glucorónido). Durante la metabolización de
éstos nutrientes por la enzima Coliforme β-D galactosidasa y β- glucoronidasa de E. coli, se
produce un color amarillo (del ONPG) y fluorescencia (del MUG). Con lo cual queda confirmada
la presencia de Coliformes totales y de E coli respectivamente.

Interferencias

La técnica del substrato enzimático ONPG-MUG tiene limitaciones, particularmente en aguas
con alta turbiedad; para tales aguas es conveniente hacer diluciones con agua destilada estéril.
Además, si la muestra tiene un color de fondo, se debe comparar bolsas o tubos según el
formato utilizado, que contienen muestra con medio de cultivo inoculado, contra un blanco de
control de la misma muestra de agua y para este caso se recomienda usar CPRG-MUG.

Bacterias no Coliformes tales como Aeromonas y especies de Pseudomonas, pueden producir
pequeñas cantidades de la enzima β- D-galactosidasa, pero son suprimidas y generalmente no
producen una respuesta positiva dentro del tiempo de inoculación a menos que estén
presentes mas de 104 UFC/ml.

Algunas cepas de Shigella spp también pueden producir una respuesta positiva a la
fluorescencia, pero debido a que este microorganismo es un conocido patógeno humano, se
considera que no va en detrimento para la prueba de calidad sanitaria de agua.




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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                  NTC 4939

13.    EQUIPOS Y MATERIALES

13.1   Autoclave

13.2   Cabina de flujo laminar

13.3   Incubadora a 35,5 °C ± 0,5 °C

13.4   Pipetas Bacteriológicas estériles de 0,1 ml, 1 ml y 10 ml

13.5   Frascos o bolsas estériles de 100 ml

13.6   Tubos tapa rosca ó Bolsas multiceldas

13.7   Sellador para bolsas multiceldas

13.8   Pipeteador

13.9   Lámpara UV de 366 nm y 6 watios de intensidad


14.    MEDIOS DE CULTIVO

Medio substrato

Comercialmente se encuentran formulaciones predispensadas para el procedimiento de tubos
múltiples o de botellas por 100 ml para el ensayo presencia ausencia.


15.    PROCEDIMIENTO

15.1   PROCEDIMIENTO DE TUBOS MÚLTIPLES

Se selecciona el número apropiado de tubos por muestra con medio predispensado para
prueba de tubos múltiples.

Se siguen las instrucciones del fabricante para preparar seriales de diluciones para varias
formulaciones.

Asépticamente, se agregan 10 ml de muestra a cada tubo, se tapa ajustadamente y se mezcla
vigorosamente para disolver.

La mezcla permanece sin color con la prueba con base en ONPG y se torna amarilla en el
formato CPRG. Algunas partículas pueden permanecer indisolubles durante la prueba; esto no
afecta el comportamiento del ensayo.

Se incuba a 35 °C ± 0,5 °C por el periodo especificado por el fabricante del substrato.

El procedimiento también puede desarrollarse agregando la cantidad apropiada de substrato a
la muestra, mezclando completamente y dispensando en 5 o 10 tubos estériles. Se incuba
como se establece para el procedimiento de tubos múltiples, utilizando las series establecidas
en el Método A.



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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                   NTC 4939

15.2   PROCEDIMIENTO MULTICELDA

El procedimiento multicelda es desarrollado con paquetes desechables estériles de medio. Se
agrega la muestra a un recipiente de 100 ml, luego se agrega el substrato, se agita
vigorosamente y se vierte dentro de la bolsa. El sellador de bolsa dispensa la muestra dentro
de los pozos y la sella. Se incube a 35 °C ± 0,5 °C por el período especificado por 24 h. El valor
del NMP es obtenido de la tabla suministrada por el fabricante.

15.3   PROCEDIMIENTO PARA PRESENCIA/AUSENCIA (P/A)

Asépticamente, se agrega el medio enzimático previamente pesado a 100 ml de muestra ,en
un recipiente de vidrio borosilicato no fluorescente y estéril o en una botella equivalente.
Opcionalmente, se agrega 100 ml de muestra al substrato enzimático, en un recipiente estéril
suministrado por el fabricante. Asépticamente, se tapa y se mezcla completamente para
disolver el substrato. Se incuba a 35 °C ± 0,5 °C por 24 h.


16.    INTERPRETACIÓN

Bacteria Coliforme Total

Después del período de incubación mínima apropiada se examinan los tubos o los recipientes
para el cambio de color apropiado (véase la Tabla 5). El ONPG es hidrolizado por la enzima de
la bacteria para producir un color amarillo. El CPRG es hidrolizado por la enzima de la bacteria
para producir un color rojo o magenta. Si la respuesta de color no es uniforme a través del tubo
ó la bandeja multicelda, se mezcla invirtiéndolo antes de leer. Se leen las instrucciones del
fabricante como guía para la interpretación. Algunos fabricantes sugieren comparar los tubos ó
bandeja multiceldas de muestra contra un comparador de color disponible suministrado por el
fabricante. Las muestras son negativas para Coliformes totales si no se observa color en el
ensayo con ONPG o si el tubo es amarillo cuando se utiliza CPRG. Si hay una respuesta
cromogénica cuestionable después de 18 h o de 24 h para ONPG, se incuba por un tiempo
adicional de 4 h. Si la respuesta es negativa después de 28 h para el CPRG se incuba hasta
por un tiempo adicional de 20 h. Si el cromógeno se intensifica la muestra es positiva para
Coliformes Totales. Si no la muestra es negativa.

Escherichia coli

Se examinan los tubos positivos de Coliformes totales o los recipientes para fluorescencia
usando una lámpara de luz ultravioleta (preferiblemente de 6 watios, de onda larga (366 nm).
Se compara cada tubo ó bandeja multicelda contra el comparador de referencia disponible. La
presencia de fluorescencia es una prueba positiva para E. coli. Si la fluorescencia es
cuestionable se incuba por un periodo adicional de 4 h para la prueba con ONPG y hasta por
un periodo adicional de 20 h para las pruebas con CPRG; la fluorescencia intensificada es una
prueba de resultado positivo.


17.    INFORME DEL ENSAYO

Si se desarrolla un procedimiento tubos múltiples, calcule el NMP para Coliformes totales y
E. coli del numero de tubos positivos como se describe en el numeral 9. Si se desarrolla el
procedimiento de bandeja multiceldas, calcule el NMP para Coliformes y E. coli tomando como
referencia la tabla suministrada por el fabricante. Si se sigue un procedimiento de presencia
ausencia, se reportan los resultados como presencia/ausencia de Coliformes totales y E. coli en
100 ml de muestra.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                     NTC 4939

                            Tabla 5 Cambios de Color para varios medios

          Substrato          Coliforme Positivo        E. Coli Positivo     Resultado Negativo
                                                                           Color demasiado pálido/
         ONPG- MUG                Amarillo             Azul fluorescente
                                                                                 No fluoresce
         CPRG- MUG            Rojo o Magenta           Azul fluorescente    Amarillo/ No fluoresce



18.    CONTROL DE CALIDAD

Se prueba el comportamiento de cada lote de medio adquirido, inoculando con tres baterías de
control: Escherichia coli, una Coliforme total diferente a E. coli (por ejemplo Enterobacter
cloacae) y una no Coliforme. También, se agrega un control de agua estéril. Si el control de
agua estéril presenta tinte fluorescente o tinte de resultado positivo Coliforme se descarta y se
utiliza un nuevo lote de substrato. Se debe evitar utilizar un inóculo pesado. Si se utiliza
Pseudomonas como el no Coliforme se selecciona una especie no fluorescente. Se incuba
estos controles a 35 °C ± 0,5 °C como se indicó antes. Se lee y se registra los resultados.


19.    APÉNDICE

19.1   NORMAS QUE SE DEBEN CONSULTAR

Las siguientes normas contienen disposiciones que, mediante la referencia dentro de este
texto, constituyen la integridad del mismo. En el momento de su publicación eran válidas las
ediciones indicadas. Todas las normas están sujetas a actualización; los participantes,
mediante acuerdos basados en esta norma, deben investigar la posibilidad de aplicar la última
versión de las normas mencionadas a continuación.

NTC 4092:1997, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Reglas generales
para los análisis microbiológicos. (ISO 7218:1997).

NTC-ISO 5667-3:1995 Gestión Ambiental. Calidad de agua. Muestreo. Directrices para la
Conservación y manejo de las muestras.

NTC-ISO 5667-5:1996 Gestión Ambiental. Calidad de agua. Guía para el muestreo de agua
potable y agua utilizada para alimentos y procesamiento de bebidas.

NTC-ISO 5667-14:1999 Calidad de agua muestreo. Parte 14: Guía para el control de la calidad
en el muestreo y en el manejo ambiental del agua.

19.2   DOCUMENTO DE REFERENCIA

AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION;
WATER ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods For The Examination of Water and
Wastewater, 20 TH EDITION.1998.Washington Multiple Tube Fermentation Technique for
Members of the Coliform Group (SM 9921) and Enzyme Sustrate Coliform Test (SM 9223).




                                                  19
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA                                                  NTC 4939

                                                                   Anexo A (Normativo )

          Esquema de las pruebas presuntiva, confirmativa y completa para la detección de
                                       coliformes totales


                                                                                                Inocular caldo lauril triptosa o caldo presencia asencia en tubos de
                                                                                                 fermentación o botellas e incubar a 24 +/- 2 horas a 35 +/- 0,5°C




                                                                                   (1) Producción de gas y/o crecimiento ácido.                  (2) Ausencia de gas o ácido.
                                                                                Transferir a fase confirmatoria a caldo bilis lactosa           Incubación adicional 24 horas
                                                                                verde brillante. Incubar 48 +/- horas a 35 +/- 0,5°C                  (total 48 +/- 3 horas)



                                                                  (a) Gas producido. Transferir a agar          (b) No gas producido.
                                                                     LES Endo o agar MacConkey.                Prueba negativa. Grupo                 (a) Gas o ácido producido.
                                                                Incubar a 24 +/- 2 horas a 35 +/- 0,5°C           coliforme ausente.                       continue en (1a)



                                                                                                                                                         (b) Crecimiento ácido
                                         (1,1) Colonias de coliformes típicas o atípicas.                                                                Confirmar como en (1)
                                               Transferir a agar blando y tubos de            (1,2) Colonias negativas.
                                          fermentación con caldo lauril triptosa. Incubar     Grupo coliforme ausente
                                           agar blando 18 a 24 h y caldo lauril triptosa                                                               (c) no producción de ácido
                                              de 24 +/- 2h a 48 +/- 3h a 35 +/- 0,5°C                                                                    y gas. Prueba negativa
                                                                                                                                                        Grupo coliforme ausente



                                (a') Producción de gas.
                                                                         (b') Ausencia de gas.
                                  teñir con gran parte
                                                                            Prueba negativa
                            del crecimiento en agar blando
                                                                      Ausencia de grupo coliforme.




(1,11) Presencia de bacilos gramnegativos.
  Ausencia de esporas. Prueba completa:
                                                  (1,12) Presencia de esporas o esporas y
       presencia de grupo coliforme.
                                                  bacilos grampositivos. Prueba completa:
   Presencia de bacilos gramnegativos y
                                                        Ausencia de grupo coliforme
  grampositivos. Repetir el procedimiento
            comenzando en 1,1




                                                                                      20

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  • 1. NORMA TÉCNICA NTC COLOMBIANA 4939 2001-05-30 CALIDAD DE AGUA. ENUMERACIÓN DE COLIFORMES Y Escherichia coli. TÉCNICA CON TUBOS DE FERMENTACIÓN Y TÉCNICA DE SUSTRATO ENZIMÁTICO E: WATER QUALITY. COLIFORM AND ESCHERICHIA COLI COUNTING. FERMENTATION TUBE TECHNIQUE AND ENZYMATIC SUBSTRATE TECHNIQUE CORRESPONDENCIA: DESCRIPTORES: Coliformes, E. coli. I.C.S.: 67.040, 07.100.20 Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC) Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435 Prohibida su reproducción
  • 2. PRÓLOGO El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último caracterizado por la participación del público en general. La NTC 4939 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2001-05-30. Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través de su participación en el Comité Técnico 000031 Microbiología. ACEGRASAS FRIGORÍFICOS SUIZO S.A. ALPINA S.A. GASEOSAS COLOMBIANAS S.A. AQUALAB GASEOSAS LUX ASINAL LTDA ICA AVESCO INGENIO PICHICHI BIOQUILAB LTDA. INGENIO RIOPAILA CALIDAD MICROBIOLÓGICA IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA. CALIDAD TOTAL LESNIAK E.U. CARULLA Y CÍA. MEALS S.A. CERVECERÍA LEONA NESTLÉ DE COLOMBIA S.A. EMPRESA DE ACUEDUCTO Y NULAB LTDA. ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOS FÁBRICA DE ESPECIAS Y PRODUCTOS QUIOS LTDA EL REY S.A. TECNOCLEAN DE COLOMBIA FRIGORÍFICOS COLOMBIANOS S.A. TRES M DE COLOMBIA Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las siguientes empresas: ALGARRA DISA S.A. ASEBIOL EMPRESA DE ACUEDUCTO Y BEATRIZ DEL PILAR MACÍAS ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ CASA LUKER S.A. HACIENDA SANTA HELENA COLOMBINA S.A. INVIMA COLSUBSIDIO LA CAMPIÑA S.A. COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES LABORATORIO MICROBIOLOGÍA PARA CONGELAGRO LA CALIDAD DE LOS ALIMENTOS CONSESIONARIO TIBITOC LABORATORIO PROCALIDAD
  • 3. LABORATORIOS GRAM PRODUCTORA DE JUGOS S.A. LLOREDA GRASAS S.A. QUALA S.A. MERCK RICA RONDO MINISTERIO DE SALUD UNIDAD ADMINISTRATIVA DE SALUD PANAMCO COLOMBIA MANANTIAL PÚBLICA PASSIFLORA COLOMBIANA S.A. UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO PROCESADORA DE LECHE S.A. UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales. DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
  • 4. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 CALIDAD DE AGUA. ENUMERACIÓN DE COLIFORMES Y Escherichia coli. TÉCNICA CON TUBOS DE FERMENTACIÓN Y TÉCNICA DE SUSTRATO ENZIMÁTICO 1. OBJETO La presente norma especifica dos métodos para la enumeración de Coliformes y E. coli. El Método A describe la Técnica de tubos de fermentación y el Método B describe la Técnica de Substrato enzimático empleando tubos múltiples, presencia y ausencia o multiceldas en muestras de agua tratada, cruda o residual, de acuerdo con lo propuesto por el Standard Methods 20 edición 1998. Método A Técnica de los tubos de fermentación 2. DEFINICIÓN Para los propósitos de este método se aplica la siguiente definición. Coliformes: bacterias gramn negativas que a la temperatura especificada (35 °C ± 2 °C) causan fermentación de lactosa con producción de gas en las condiciones de ensayo especificadas en este método. 3. PRINCIPIO 3.1 PRUEBA PRESUNTIVA Inoculación de quince tubos con medio selectivo líquido (Véase el numeral 4.2), con serie de cinco tubos con 10 ml, 1,0 ml y 0,1 ml de muestra de ensayo respectivamente ó diez tubos con medio selectivo líquido con 10ml de la muestra de ensayo o inoculación de cinco tubos con medio selectivo líquido con 20 ml de la muestra de ensayo. 3.2 Incubación a 35 °C ± 0,5 °C de los tubos inoculados durante 24 h a 48 h y análisis de estos tubos. 1
  • 5. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 3.3 PRUEBA CONFIRMATIVA Aislamiento de los cultivos procedentes de la serie de tubos en los cuales se haya observado formación de gas y acidez en medio líquido para confirmación (Véase el numeral 4.3). 3.4 Incubación a 35 °C ± 0,5 °C durante 24 h 3.5 Cálculo del número más probable de coliformes por 100 ml de muestra (es decir el NMP), a partir del número de tubos que muestren formación de gas, usando una tabla para determinación de números más probables. 3.6 Para establecer la presencia de coliformes y establecer una carta de control de calidad, se utiliza el ensayo completo sobre al menos el 10 % de los tubos confirmados. Simultáneamente se inoculan en Caldo bilis verde brillante lactosa para coliformes totales y caldo EC para coliformes fecales o EC+MUG para E. coli a 44,5 ºC. Los resultados positivos de la prueba indican un ensayo completo Paralelamente la presencia de tubos positivos en caldo bilis verde brillante pero negativos en caldo EC o EC+MUG indican la presencia de coliformes no fecales 4. MEDIOS DE CULTIVO 4.1 GENERALIDADES En la NTC 4092 (ISO 7218) se presenta información sobre la práctica actual de laboratorio. 4.2 CALDO LAURYL TRIPTOSA Composición Triptosa 20 g Lactosa 5,0 g Fosfato dipotásico K2HPO4 2,75 g Fosfato de potasio KH2PO4 2,75 g Cloruro de sodio NaCl 5,0 g Lauril sulfato de sodio 0,1 g Agua destilada, desionizada 1 000 ml Preparación El caldo lauryl triptosa debe prepararse teniendo en cuenta que la concentración original del medio debe mantenerse al adicionar la muestra. Por ejemplo: se prepara el medio a doble concentración si el volumen de la muestra es igual al volumen del medio a utilizar. Se añaden los ingredientes deshidratados al agua destilada, se mezcla cuidadosamente y se caliente para disolverlo. El pH deberá ser de 6,8 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizarlo, se agrega caldo a los tubos de fermentación en cantidad suficiente para cubrir los tubos durham invertidos, (al menos parcialmente después de la esterilización). Se cierran los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor. 2
  • 6. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min. Los tubos de fermentación no deben contener burbujas de aire después de la esterilización. Como alternativa, se omite el tubo durham invertido y se añade 0,01 g/l de púrpura bromocresol al medio presuntivo para determinar la producción de ácido en lugar de la formación de gas, lo que indicaría un resultado positivo en esta parte de la prueba. 4.3 CALDO LACTOSA BILIS VERDE BRILLANTE (MEDIO SELECTIVO) Composición Peptona 10 g Lactosa 10 g Bilis de buey deshidratada (sales biliares) OXGALL 20 g 1 Verde brillante 0,0133 g Agua destilada, desionizada 1 000 ml Preparación Se añaden los ingredientes deshidratados al agua, se mezcla cuidadosamente y se calienta para disolverlos. El pH debe ser de 7,2 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizarlo, se colocan en tubos de fermentación con un tubo durham invertido, una cantidad suficiente de medio como para que cubra este, al menos parcialmente, después de la esterilización. Se cierran los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor. Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min. Los tubos de fermentación no deben contener burbujas de aire después de la esterilización. 4.4 CALDO E C Composición Triptosa 20 g Lactosa 3,0 g Fosfato dipotásico K2HPO4 2,75 g Fosfato de potasio KH2PO4 2,75 g Cloruro de sodio NaCl 5,0 g Lauryl sulfato de sodio 0,1 g Agua destilada, desionizada 1 000 ml Preparación Se añaden los ingredientes deshidratados al agua, se mezcla cuidadosamente y se caliente para disolverlos. El pH debe ser de 6,8 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizarlo, se colocan en tubos de fermentación con un tubo durham invertido, una cantidad suficiente de medio como para que cubra este, al menos parcialmente, después de la esterilización. Se cierran los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor. 3
  • 7. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min. Los tubos de fermentación no de en contener burbujas de aire después de la esterilización. 4.5 AGAR LES ENDO Composición Peptona 10 g Lactosa 10 g Fosfato dipotásico K2HPO4 2,5 g Sulfito sódico anhidro 3,3 g Pararrosanilina (fuscina) 0,3 g Agar 12,5 Agua destilada, desionizada 1 000 ml Preparación Se añaden los ingredientes deshidratados al agua, se mezcla cuidadosamente y se caliente para disolverlos. El pH debe ser de 7,4 ± 0,2 después de la esterilización. Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min. Se vierten en cajas de petri de 100 mm x 15 mm 4.6 AGAR MACCONKEY Composición Peptona caseinada 17,0 g Peptona de carne Proteasa 3,0 g SorbitolLactosa 10,0 g Sales biliares No.3 1,5 g Cloruro de sodio 5,0 g Rojo neutro 0,03 g Violeta cristal 0,001 g a Agar 12 g a 15 g Agua 1 000 ml a Dependiendo de la concentración de gel del agar Preparación Se añaden los ingredientes al agua, se mezcla cuidadosamente y se caliente hasta ebullición para disolverlos. Se esteriliza en el autoclave por 15 min a 121 °C. Tras la esterilización, se vierte el agar en cajas de petri (100 mm x 15 mm). El pH debe ser de 7,1 ± 0,2 después de la esterilización. 4
  • 8. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 4.7 AGAR NUTRITIVO Composición Extracto de carne 3,0 g Peptona 5,0 g Cloruro de sodio 5,0 g a Agar 12 g a 18 g Agua 1 000 ml a Dependiendo de la concentración de gel del agar. Preparación Se añaden los ingredientes al agua, se mezcla cuidadosamente y se caliente para disolverlos. El pH debe ser de 6,8 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizar, se dispensa el medio en tubos con tapón de rosca. Después de la esterilización, inmediatamente coloque en posición inclinada, de forma que el agar solidifique formando pendiente. Ajustar los tapones después de que se hayan enfriado y conserve en una zona fría y protegida. 4.8 REACTIVOS PARA LA TINCIÓN DE GRAM 4.8.1 Oxalato de amonio - cristal violeta (de Hucker) Se disuelven 2 g de cristal violeta (con un contenido de colorante del 90 %) en 20 ml de alcohol etílico al 95 %; se disuelven 0,8 g de (NH4)2C2O4.H2O en 80 ml de agua destilada; se mezclan ambas soluciones y se deja reposar durante 24 h antes de usarlas; se filtra a través de un papel y se conserva en un frasco de tinción. 4.8.2 Solución de Lugol, modificación de Gramn Se tritura en un mortero, 1 g de cristales de yodo y 2 g de KI. Se añade lentamente agua destilada y se tritura con cuidado después de cada adición hasta que se complete la solución. Se almacena en una botella de vidrio ámbar, añadiendo el resto del agua (usando un total de 300 ml). 4.8.3 Contraste Se disuelven 2,5 g de safranina en 100 ml de alcohol etílico al 95 %. Se añaden de 10 ml a 100 ml de agua destilada. 4.8.4 Alcohol acetona Se mezclan partes iguales de alcohol etílico al 95 % y acetona. 5
  • 9. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 4.9 CALDO E C + MUG Composición Triptosa o tripticasa 20 g Lactosa 5,0 g Mezcla de sales biliares o sales biliares No. 3 1,5 g Fosfato dipotásico K2HPO4 4,0 g Fosfato de potasio KH2PO4 1,5 g Cloruro de sodio NaCl 5,0 g 4-methylumberiferil B D glucoronidasa MUG 0,05 g Agua destilada, desionizada 1 000 ml Preparación Se disuelven los componentes o el medio completo deshidratado en el agua, mediante calentamiento si es necesario. Se ajusta el pH, si es necesario, de tal modo que después de la esterilización sea 6,9 +/-2 a 25 °C. Se distribuye el medio, en cantidades de 10 ml en tubos de ensayo de 16 mm x 180 mm (véase el numeral 5.4) Se esteriliza el medio en autoclave a 121 °C (245 kPa) durante 15 min. Los tubos no deben presentar fluorescencia bajo la luz UV a 366nm No es necesario utilizar tubos invertidos. Las tapas pueden ser metálicas o plásticas resistentes al calor 5. APARATOS Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO Nota 1. Si el material desechable tiene especificaciones adecuadas, es una alternativa aceptable frente al material de vidrio reutilizable. Equipo usual de laboratorio microbiológico y, en particular, lo siguiente. Véase la NTC 4092 (ISO 7218). 5.1 APARATO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIÓN EN HÚMEDO (AUTOCLAVE) Véase la NTC 4092 (ISO 7218). 5.2 INCUBADORA Con capacidad de funcionar a 35 °C ± 2 °C. 5.3 ASAS Hechas de platino/iridio o níquel/cromo o asas desechables. 6
  • 10. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 5.4 TUBOS DE ENSAYO Con capacidad apropiada para la esterilización y almacenamiento de medios de cultivo y la incubación de medios. 5.5 TUBOS DURHAM Con capacidad de 50 mm x 10 mm 5.6 PIPETAS DE ENTREGA TOTAL Con capacidad nominal de 1ml y 10 ml, graduadas respectivamente en divisiones de 0,1 ml y 0,5 ml. 5.7 MEDIDOR DE PH Con capacidad para dar lecturas con aproximación a 0,01 unidades de pH a 25 °C, que permita realizar mediciones con una exactitud de ± 0,1 unidad de pH 5.8 PIPETEADOR 5.9 CAJAS PETRI 6. MUESTREO Para la toma de muestra y muestreo seguir los procedimientos descritos por el Standard Methods Parte 9060 Capítulo 9-17 ó NTC-ISO 5667-3, NTC-ISO 5667-5 y NTC-ISO 5667-14. 7. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO Se comienza el examen microbiológico de las aguas máximo 24 h después de su recolección. Si se sabe que el resultado puede ser usado para una acción legal analizar la muestra antes de 6 h, manteniéndola refrigerada y con cadena de custodia 8. PROCEDIMIENTO Véase el diagrama del Anexo A (Normativo). 8.1 MUESTRA DE ENSAYO, SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES Tabla 1. Preparación del medio líquido de Lauril Triptosa Medio líquido de lauril Inóculo Cantidad de medio en el Volumen del medio + triptosa deshidratado ml tubo inóculo requerido ml ml g/l 1 10 o más 11 o más 35,6 10 10 20 71,2 10 20 30 53.4 20 10 30 106,8 100 50 150 106,8 100 35 135 137,1 100 20 120 213,6 7
  • 11. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 8.2 PRUEBA PRESUNTIVA (Inoculación e incubación) Se agrupan los tubos de fermentación en hileras de cinco o diez en una gradilla para tubos de ensayo. El número y el volumen de los tubos de muestra seleccionados dependen de la cantidad y de las características del agua que se vaya a estudiar. Para agua potable: se utilizan cinco porciones de 20 ml o diez porciones de 10 ml, o una sola botella de 100 ml. Si se trata de agua no potable: se utiliza cinco tubos por dilución (de 10 ml, 1 ml, 0,1 ml, etc.). Se agita vigorosamente la muestra y las diluciones unas 25 veces. Se inocula cada tubo en un grupo de cinco con volúmenes duplicados de muestra (en diluciones decimales crecientes, si se utilizan cantidades decimales de la muestra). Se mezclan las porciones a estudiar mediante agitación suave. Se verifica que en los tubos durham invertidos no halla quedado aire. Se incuban los tubos inoculados o las botellas a 35 °C ± 0,5 °C. Después de 24 h ± 2 h, se agita cada tubo o botella suavemente y se observa si se produce crecimiento, gas o una reacción ácida (color amarillo) y, en caso contrario, se reincuba y se vuelve a examinar al final de 48 h ± 3 h. Se registra la presencia o ausencia de crecimiento, gas y reacción ácida. Si no se ha utilizado el tubo de durham, un crecimiento con acidez significa una presunta reacción positiva. Interpretación. La aparición de gas o ácido en los tubos o botellas dentro de las 48 h ± 3 h constituye una presunta reacción positiva. Los tubos con este tipo de reacción deben ser estudiados en la fase confirmatoria. La ausencia de reacción ácida o de formación de gas al finalizar las 48 h ± 3 h de incubación indica una reacción negativa. Se someten las muestras de agua potable que demuestren crecimiento sin una reacción ácida o formación de gas a la fase confirmatoria. El límite arbitrario de 48 h para la observación excluye sin ninguna duda a los miembros ocasionales del grupo coliforme que crecen de manera muy lenta 8.3 PRUEBA CONFIRMATIVA Se someten todos los tubos o botellas de la fase presuntiva que muestren crecimiento, cualquier cantidad de gas o reacción ácida dentro de las 24 h ± 2 h de incubación a la fase confirmatoria. Si se observa una fermentación activa o un crecimiento ácido antes de las 24 h ± 2 h, transfiera al medio de confirmación; preferiblemente examine los tubos a las 18 h ± 1 h. Si hay otros tubos o botellas de la fase presuntiva con crecimiento ácido después de las 48 h ± 3 h de incubación, también se llevarán a la fase confirmatoria. Se agitan suavemente o se hacen rotar los tubos o botellas de la fase presuntiva que muestren gas o crecimiento ácido para que se produzca una resuspensión de los microorganismos. Con una asa estéril de 3,0 mm a 3,5 mm de diámetro, se transfiere un asa completa de cultivo al tubo de fermentación que contiene el medio verde brillante de lactosa bilis o introduzca un aplicador de madera estéril en el cultivo, de al menos 2,5 cm, se retira rápidamente y se introduce hasta el fondo en la botella o el tubo de fermentación con el medio mencionado. 8
  • 12. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 Se retira y desecha el aplicador. Se repite esta operación para todos los tubos posiblemente positivos. Se incuba el medio de verde brillante lactosa bilis a 35 °C ± 0,5 °C. La formación de cualquier cantidad de gas en el tubo durham invertido en el medio de fermentación verde brillante de lactosa bilis a cualquier tiempo (por ejemplo, 6,0 h ± 1 h, 24 h ± 2 h) dentro de las 48 h ± 3 h constituye un resultado positivo en la fase confirmatoria. Se calcula el NMP a partir del número de tubos positivos en el medio de fermentación verde brillante de lactosa bilis. Procedimiento alternativo. Se usa esta alternativa sólo para aguas contaminadas o residuales que se sepa presenten sistemáticamente resultados positivos. En caso de que todos los tubos sean positivos en dos o más diluciones consecutivas durante 24 h, lleve sólo a la fase confirmatoria los tubos de la dilución más alta (menor muestra de inóculo) en la cual todos los tubos son positivos y algunos tubos positivos en diluciones aún más altas. Se somete a la fase confirmatoria todos los tubos que presenten gas o crecimiento ácido sólo después de las 48 h. 8.4 PRUEBA COMPLETA Para establecer la presencia de bacterias coliformes y obtener datos sobre el control de calidad, se usa la prueba completa sobre por lo menos el 10 % de los tubos positivos confirmados. Simultáneamente, se inocula en medio líquido verde brillante de lactosa bilis para coliformes totales y medio líquido EC para coliformes fecales o puede ser usado medio líquido EC-MUG para Escherichia coli. Se consideran como respuesta positiva de la prueba completa los resultados positivos en caldo medio líquido EC y medio líquido EC-MUG a temperatura elevada (44,5 °C). Los cultivos que sean positivos en medio de verde brillante lactosa bilis y negativos en medio EC y EC-MUG indican la presencia de coliformes no fecales. Se siembra asépticamente una placa de agar LES Endo o agar MacConkey por cada tubo de medio verde brillante lactosa bilis que ha producido gas; se realiza la operación lo antes posible tras la detección del gas. Se siembran las cajas de forma que asegure la existencia de algunas colonias aisladas, separadas por al menos 0,5 cm. Si existen coliformes y se quiere obtener una elevada proporción de aislamientos satisfactorios, se deben tener las siguientes precauciones: (a) Se utiliza un asa estéril de 3 mm de diámetro o una aguja de inoculación ligeramente curvada en la punta; (b) se abre e inclina el tubo de fermentación evitando la toma con la aguja de cualquier membrana o espuma; (c) se introduce el extremo del asa o la aguja en el líquido del tubo a una profundidad de alrededor de 0,5 cm, y (d) se siembra la caja con la parte curvada de la aguja en contacto con el agar para no arañar la superficie. Se flamea el asa entre los cuadrantes segundo y tercero para mejorar el aislamiento de las colonias. 9
  • 13. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 Se incuban las cajas invertidas a 35 °C ± 0,5 °C durante 24 h ± 2 h. Las colonias que se desarrollan en el agar LES Endo pueden definirse como típicas (rosas a rojo oscuras con un brillo verde metálico superficial) o atípicas (rosas, rojas, blancas o incoloras sin brillo) a las 24 h de incubación. Las colonias típicas de la fermentación de la lactosa desarrolladas sobre el agar MacConkey son rojas y pueden estar rodeadas por una zona opaca de precipitado biliar. Se toma de cada caja una o más colonias típicas bien definidas o, si no existen, dos o más entre las que se consideren como probablemente formadas por microorganismos del grupo coliforme y se las pasa a un tubo de fermentación con medio de lauril triptosa y a uno con agar en inclinado (este último no es necesario si se trata de muestras de agua potable). Si es necesario, utilice una lupa para colonias a fin de conseguir un aumento óptimo a la hora de tomarlas de las cajas de agar LES Endo o agar MacConkey. Cuando se transfiera las colonias, se eligen las que estén bien aisladas y se toca apenas su superficie con una aguja esterilizada a la llama, enfriada al aire para evitar en lo posible el peligro de transferir un cultivo mixto. Se incuban los tubos con el medio secundario (medio líquido de lauril triptosa con tubos durham de fermentación invertidos) a 35 °C ± 0,5 °C durante 24 h ± 2 h; si no se produce gas en este período se prolonga la incubación hasta 48 h ± 3 h. Se estudian microscópicamente las preparaciones teñidas con Gram y obtenidas en los cultivos de pendiente de agar a las 24 h, correspondientes a los tubos secundarios que muestren gas. Tinción de Gram. Si se trata de muestras de agua potable, se puede prescindir de la tinción de Gramn en la prueba completa, ya que es raro que existan bacterias gramnpositivas y microorganismos esporulados sobrevivientes en este método de detección selectiva. Existen varias modificaciones de la técnica de Gramn. Se utiliza la modificación de Hucker para teñir las extensiones de cultivos puros; se incluye un control para organismos grampositivos y otro para gramnegativos. Se preparan emulsiones ligeras distintas de los crecimientos bacterianos en estudio y de los cultivos de control positivos y negativos sobre el mismo porta, utilizando para ello gotas de agua destilada colocadas en el cristal. Se dejan secar al aire y se fijan pasando el porta sobre una llama, se tiñen por 1 min con la solución de oxalato de amonio cristal violeta. Se enjuaga con agua corriente y se aplica la solución de Lugol durante 1 min. Se lava de nuevo el porta teñido con agua corriente. Se decolora durante aproximadamente 15 s - 30 s con alcohol acetona, manteniendo el porta entre los dedos y deje que el alcohol acetona fluya por la extensión teñida hasta obtener un líquido incoloro. No decolore en exceso. Contraste con safranina durante 15 s, lave con agua corriente, seque con papel absorbente o al aire y examine microscópicamente. Los microorganismos grampositivos son azules y los gramnegativos rojos. Los resultados sólo son aceptables cuando los controles dan la reacción adecuada. 10
  • 14. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 Interpretación. El resultado positivo de la prueba completa requiere la formación de gas en los tubos secundarios con medio de lauril triptosa en 48 h ± 3 h y la demostración de bacterias alargadas gramnegativas no esporuladas procedentes de los cultivos con agar, lo que demuestra la presencia de un miembro del grupo coliforme. 9. EXPRESIÓN DE RESULTADOS 9.1 PRECISIÓN DE LA PRUEBA DE TUBOS DE FERMENTACIÓN A menos que se estudien numerosas porciones de la muestra, la precisión de la prueba de tubos de fermentación es muy baja. Por ejemplo, si sólo 1 ml es examinado en una muestra que contiene 1 coliforme/ml, casi un 37 % de los tubos de 1 ml pueden producir resultados negativos, debido a la distribución aleatoria de las bacterias en la muestra. Cuando en estas condiciones se utilizan cinco tubos, cada uno con 1 ml de la muestra, se puede esperar un resultado completamente negativo en alrededor de 1 % de las veces. Aunque se utilicen cinco tubos de fermentación, la precisión de los resultados no es muy elevada. Por tanto, hay que tener cuidado a la hora de interpretar el significado sanitario de los resultados de coliformes obtenidos cuando se utilizan pocos tubos con dilución de muestra, sobre todo cuando el número de muestras de una toma es limitado. 9.2 CÁLCULO Y REGISTRO DEL NMP Para calcular la densidad de coliformes, se calcula en términos del Número Más Probable (NMP). Las Tablas 2, 3 y 4 indican los valores del NMP para distintas series de siembras y resultados. En estas tablas se contemplan límites de confianza del 95 % para cada valor del NMP. Si los volúmenes de la muestra utilizados son los contenidos en las tablas, se reporta el valor correspondiente al número de resultados positivos y negativos en las series en forma de NMP/100 ml o se reporta como presencia o ausencia de coliformes totales o fecales. Los volúmenes de muestra indicados en las Tablas 2 y 3 están relacionados de forma más específica con las aguas terminales. La Tabla 4 ilustra los valores de NMP para combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se estudian volúmenes de cinco muestras de 10 ml, 1 ml y 0,1 ml. En caso de que las series de diluciones decimales sean distintas de las de la tabla, se seleccionan los valores de NMP de la Tabla 4 por la combinación de tubos positivos, calculando de acuerdo con la siguiente fórmula: 10 Valor del NMP (de la tabla) x = NMP / 100 ml Mayor volumen estudiado Cuando se utilice más de tres diluciones en series de diluciones decimales, sólo se tomarán los resultados de tres de ellas para calcular el NMP. 11
  • 15. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 Para seleccionar las tres diluciones por utilizar en la determinación del índice del NMP, se escoje la dilución más alta con resultado positivo entre las cinco estudiadas (no hay ninguna dilución menor que haya dado un resultado negativo) y las dos siguientes diluciones más altas. Se usan los resultados de estos tres volúmenes para calcular el índice del NMP. En el ejemplo siguiente, los resultados de la dilución significativa se dan en negritas. El numerador representa los tubos positivos y el denominador, el total de tubos estudiados; la combinación de positivos indica únicamente el número total de tubos positivos por dilución: Combinación Índice NMP / Ejemplo 1 ml 0,1 ml 0,01 ml 0,001 ml de positivos 100 ml a 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0 5 000 b 5/5 4/5 2/5 0/5 5-4-2 2 200 c 0/5 1/5 0/5 0/5 0-1-0 20 En c, se selecciona las tres primeras diluciones, de manera que se incluya el resultado positivo en la dilución media. Cuando se presenta un caso como el que se muestra a continuación en la línea d, en el que una dilución muestra un positivo mayor que las tres elegidas según la regla general, el resultado se incorpora a la mayor de las diluciones elegidas, como sucede en e: Combinación Índice NMP / Ejemplo 1 ml 0,1 ml 0,01 ml 0,001 ml de positivos 100 ml d 5/5 3/5 1/5 1/5 5-3-2 1 400 e 5/5 3/5 2/5 0/5 5-3-2 1 400 Si desea resumir en un solo valor de NMP los resultados de una serie de muestras, se recurrirá a la media geométrica o la mediana. En la Tabla 4 se muestran las combinaciones de tubos positivos más probables. Si aparecen combinaciones poco probables con una frecuencia superior al 1 %, hay que pensar que la técnica es inadecuada o que no se ha cumplido por completo el supuesto estadístico en que se basa el cálculo del NMP. El NMP para combinaciones que no aparecen en la tabla, o para otras combinaciones de tubos o diluciones, puede calcularse mediante la sencilla fórmula de Thomas: No. de tubos positivos NMP/100 ml = x 100 ml de muestra en los tubos negativos x ml de muestra en todos los tubos Aunque los cálculos del NMP se facilitan para su uso en la prueba de coliformes, también son aplicables para determinar el NMP de cualquier otro microorganismo, siempre que se disponga de los medios de estudio adecuados. 12
  • 16. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 Tabla 2. Índice de NMP y límites de aceptación del 95 % para distintas combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se emplean cinco porciones de 20 ml No. de tubos que Límites de confianza del 95 % (aproximados) Índice dan reacción positiva de NMP/ un total de cinco 100 ml Superior Inferior de 20 ml c/u 0 <2,2 0,0 6,0 1 2,2 0,1 12,6 2 5,1 0,5 19,2 3 9,2 1,6 29,4 4 16,0 3,3 52,9 5 >16,0 8,0 Infinito Tabla 3. Índice de NMP y límites de aceptación del 95 % para distintas combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se emplean diez porciones de 10 ml No. de tubos que Límites de confianza del 95 % (aproximados) Índice dan reacción positiva de NMP/ un total de diez 100 ml de 10 ml c/u Superior Inferior 0 <1,1 0,0 3,0 1 1,1 0,03 5,9 2 2,2 0,26 8,1 3 3,6 0,69 10,6 4 5,1 1,3 13,4 5 6,9 2,1 16,8 6 9,2 3,1 21,1 7 12,0 4,3 27,1 8 16,1 5,9 36,8 9 23,0 8,1 59,5 10 >23,0 13,5 Infinito 13
  • 17. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 Tabla 4. Índice de NMP y límites de aceptación del 95 % para distintas combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan cinco tubos por dilución (10 ml, 1,0 ml, 0,1 ml) Índice Límites de confianza del 95 % (aproximados) Combinación NMP/ de positivos 100 ml Superior Inferior 0-0-0 <2 - - 0-0-1 2 1,0 10 0-1-0 2 1,0 10 0-2-0 4 1,0 13 1-0-0 2 1,0 11 1-0-1 4 1,0 15 1-1-0 4 1,0 15 1-1-1 6 2,0 18 1-2-0 6 2,0 18 2-0-0 4 1,0 17 2-0-1 7 2,0 20 2-1-0 7 2,0 21 2-1-1 9 3,0 24 2-2-0 9 3,0 25 2-3-0 12 5,0 29 3-0-0 8 3,0 24 3-0-1 11 4,0 29 3-1-0 11 4,0 29 3-1-1 14 6,0 35 3-2-0 14 6,0 35 3-2-1 17 7,0 40 4-0-0 13 5,0 38 4-0-1 17 7,0 45 4-1-0 17 7,0 46 4-1-1 21 9,0 55 4-1-2 26 12 63 4-2-0 22 9 56 4-2-1 26 12 65 4-3-0 27 12 67 4-3-1 33 15 77 4-4-0 34 16 80 Continúa . . . 14
  • 18. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 Tabla 4. (Final) Índice Límites de confianza del 95 % (aproximados Combinación NMP/ de positivos 100 ml Superior Inferior 5-0-0- 23 9 86 5-0-1 30 10 110 5-0-2 40 20 140 5-1-0 30 10 120 5-1-1 50 20 150 5-1-2 60 30 180 5-2-0 50 20 170 5-2-1 70 30 210 5-2-2 90 40 250 5-3-0 80 30 250 5-3-1 110 40 300 5-3-2 140 60 360 5-3-3 170 80 410 5-4-0 130 50 390 5-4-1 170 70 480 5-4-2 220 100 580 5-4-3 280 120 690 5-4-4 350 160 820 5-5-0 240 100 940 5-5-1 300 100 1300 5-5-2 500 200 2000 5-5-3 900 300 2900 5-5-4 1600 600 5300 5-5-5 >1600 - - 10. INFORME DE ENSAYO En el informe de ensayo se debe especificar el método usado, la temperatura seleccionada, y los resultados obtenidos. También se deben mencionar todos los detalles de las operaciones no especificados en esta norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles de cualesquier incidente que puedan haber influido en los resultados. En el informe de ensayo se debe incluir toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra. Método B Técnicas con sutrato enzimático 11. DEFINICION Para los propósitos de este método se aplican las siguientes definiciones: Bacterias Coliformes Totales Cuando se utiliza la técnica enzimática, el grupo Coliforme Total se define como toda bacteria que posea la Enzima β-D galactosidasa; la cual tiene la propiedad de abrir el substrato cromogénico, resultando en la liberación del cromógeno. 15
  • 19. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 Escherichia coli Cuando se utiliza la técnica enzimática, la Escherichia coli es definida, como toda bacteria que da respuesta positiva al grupo Coliforme Total y además posee la enzima β-glucoronidasa, la cual tiene la propiedad de abrir el substrato fluorogénico, resultando en la liberación del fluorógeno. 12. PRINCIPIO Bacterias Coliformes Totales Substratos cromogénicos tales como Orto-nitrofenil-β-D-galactopiranosido (ONPG) o clorofenol rojo β-D-galactopiranósido (CPRG) son utilizados para detectar la enzima β-D- galactosidasa la cual es producida por las Bacterias Coliformes Totales. La enzima β-D-galactosidasa hidroliza el substrato y produce un cambio de color, lo cual indica una prueba positiva para Coliformes totales en 24 h (ONPG) o 28 h (CPRG) sin procedimientos adicionales. Escherichia coli Un substrato fluorogénico tal como 4-metil-umbeliferil-β-D-glucoronido (MUG) es utilizado para detectar la enzima β-glucoronidasa la cual es producida por E.coli. La enzima β-glucoronidasa hidroliza el substrato y da un producto fluorescente cuando es revelado bajo luz ultravioleta de onda larga (366 nm). La presencia de fluorescencia indica una prueba positiva para E.coli. El medio de cultivo utilizado se basa en la tecnología del substrato definido, el cual emplea nutrientes - indicadores que producen color y/o fluorescencia al ser metabolizados por los microorganismos Coliformes Totales y E coli; los cuales son detectados simultáneamente. El reactivo proporciona dos nutrientes indicadores específicos: ONPG (O- nitrofenil -β-d- galactopiranósido) y MUG ( 4-metil-umbeliferil-β- D- glucorónido). Durante la metabolización de éstos nutrientes por la enzima Coliforme β-D galactosidasa y β- glucoronidasa de E. coli, se produce un color amarillo (del ONPG) y fluorescencia (del MUG). Con lo cual queda confirmada la presencia de Coliformes totales y de E coli respectivamente. Interferencias La técnica del substrato enzimático ONPG-MUG tiene limitaciones, particularmente en aguas con alta turbiedad; para tales aguas es conveniente hacer diluciones con agua destilada estéril. Además, si la muestra tiene un color de fondo, se debe comparar bolsas o tubos según el formato utilizado, que contienen muestra con medio de cultivo inoculado, contra un blanco de control de la misma muestra de agua y para este caso se recomienda usar CPRG-MUG. Bacterias no Coliformes tales como Aeromonas y especies de Pseudomonas, pueden producir pequeñas cantidades de la enzima β- D-galactosidasa, pero son suprimidas y generalmente no producen una respuesta positiva dentro del tiempo de inoculación a menos que estén presentes mas de 104 UFC/ml. Algunas cepas de Shigella spp también pueden producir una respuesta positiva a la fluorescencia, pero debido a que este microorganismo es un conocido patógeno humano, se considera que no va en detrimento para la prueba de calidad sanitaria de agua. 16
  • 20. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 13. EQUIPOS Y MATERIALES 13.1 Autoclave 13.2 Cabina de flujo laminar 13.3 Incubadora a 35,5 °C ± 0,5 °C 13.4 Pipetas Bacteriológicas estériles de 0,1 ml, 1 ml y 10 ml 13.5 Frascos o bolsas estériles de 100 ml 13.6 Tubos tapa rosca ó Bolsas multiceldas 13.7 Sellador para bolsas multiceldas 13.8 Pipeteador 13.9 Lámpara UV de 366 nm y 6 watios de intensidad 14. MEDIOS DE CULTIVO Medio substrato Comercialmente se encuentran formulaciones predispensadas para el procedimiento de tubos múltiples o de botellas por 100 ml para el ensayo presencia ausencia. 15. PROCEDIMIENTO 15.1 PROCEDIMIENTO DE TUBOS MÚLTIPLES Se selecciona el número apropiado de tubos por muestra con medio predispensado para prueba de tubos múltiples. Se siguen las instrucciones del fabricante para preparar seriales de diluciones para varias formulaciones. Asépticamente, se agregan 10 ml de muestra a cada tubo, se tapa ajustadamente y se mezcla vigorosamente para disolver. La mezcla permanece sin color con la prueba con base en ONPG y se torna amarilla en el formato CPRG. Algunas partículas pueden permanecer indisolubles durante la prueba; esto no afecta el comportamiento del ensayo. Se incuba a 35 °C ± 0,5 °C por el periodo especificado por el fabricante del substrato. El procedimiento también puede desarrollarse agregando la cantidad apropiada de substrato a la muestra, mezclando completamente y dispensando en 5 o 10 tubos estériles. Se incuba como se establece para el procedimiento de tubos múltiples, utilizando las series establecidas en el Método A. 17
  • 21. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 15.2 PROCEDIMIENTO MULTICELDA El procedimiento multicelda es desarrollado con paquetes desechables estériles de medio. Se agrega la muestra a un recipiente de 100 ml, luego se agrega el substrato, se agita vigorosamente y se vierte dentro de la bolsa. El sellador de bolsa dispensa la muestra dentro de los pozos y la sella. Se incube a 35 °C ± 0,5 °C por el período especificado por 24 h. El valor del NMP es obtenido de la tabla suministrada por el fabricante. 15.3 PROCEDIMIENTO PARA PRESENCIA/AUSENCIA (P/A) Asépticamente, se agrega el medio enzimático previamente pesado a 100 ml de muestra ,en un recipiente de vidrio borosilicato no fluorescente y estéril o en una botella equivalente. Opcionalmente, se agrega 100 ml de muestra al substrato enzimático, en un recipiente estéril suministrado por el fabricante. Asépticamente, se tapa y se mezcla completamente para disolver el substrato. Se incuba a 35 °C ± 0,5 °C por 24 h. 16. INTERPRETACIÓN Bacteria Coliforme Total Después del período de incubación mínima apropiada se examinan los tubos o los recipientes para el cambio de color apropiado (véase la Tabla 5). El ONPG es hidrolizado por la enzima de la bacteria para producir un color amarillo. El CPRG es hidrolizado por la enzima de la bacteria para producir un color rojo o magenta. Si la respuesta de color no es uniforme a través del tubo ó la bandeja multicelda, se mezcla invirtiéndolo antes de leer. Se leen las instrucciones del fabricante como guía para la interpretación. Algunos fabricantes sugieren comparar los tubos ó bandeja multiceldas de muestra contra un comparador de color disponible suministrado por el fabricante. Las muestras son negativas para Coliformes totales si no se observa color en el ensayo con ONPG o si el tubo es amarillo cuando se utiliza CPRG. Si hay una respuesta cromogénica cuestionable después de 18 h o de 24 h para ONPG, se incuba por un tiempo adicional de 4 h. Si la respuesta es negativa después de 28 h para el CPRG se incuba hasta por un tiempo adicional de 20 h. Si el cromógeno se intensifica la muestra es positiva para Coliformes Totales. Si no la muestra es negativa. Escherichia coli Se examinan los tubos positivos de Coliformes totales o los recipientes para fluorescencia usando una lámpara de luz ultravioleta (preferiblemente de 6 watios, de onda larga (366 nm). Se compara cada tubo ó bandeja multicelda contra el comparador de referencia disponible. La presencia de fluorescencia es una prueba positiva para E. coli. Si la fluorescencia es cuestionable se incuba por un periodo adicional de 4 h para la prueba con ONPG y hasta por un periodo adicional de 20 h para las pruebas con CPRG; la fluorescencia intensificada es una prueba de resultado positivo. 17. INFORME DEL ENSAYO Si se desarrolla un procedimiento tubos múltiples, calcule el NMP para Coliformes totales y E. coli del numero de tubos positivos como se describe en el numeral 9. Si se desarrolla el procedimiento de bandeja multiceldas, calcule el NMP para Coliformes y E. coli tomando como referencia la tabla suministrada por el fabricante. Si se sigue un procedimiento de presencia ausencia, se reportan los resultados como presencia/ausencia de Coliformes totales y E. coli en 100 ml de muestra. 18
  • 22. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 Tabla 5 Cambios de Color para varios medios Substrato Coliforme Positivo E. Coli Positivo Resultado Negativo Color demasiado pálido/ ONPG- MUG Amarillo Azul fluorescente No fluoresce CPRG- MUG Rojo o Magenta Azul fluorescente Amarillo/ No fluoresce 18. CONTROL DE CALIDAD Se prueba el comportamiento de cada lote de medio adquirido, inoculando con tres baterías de control: Escherichia coli, una Coliforme total diferente a E. coli (por ejemplo Enterobacter cloacae) y una no Coliforme. También, se agrega un control de agua estéril. Si el control de agua estéril presenta tinte fluorescente o tinte de resultado positivo Coliforme se descarta y se utiliza un nuevo lote de substrato. Se debe evitar utilizar un inóculo pesado. Si se utiliza Pseudomonas como el no Coliforme se selecciona una especie no fluorescente. Se incuba estos controles a 35 °C ± 0,5 °C como se indicó antes. Se lee y se registra los resultados. 19. APÉNDICE 19.1 NORMAS QUE SE DEBEN CONSULTAR Las siguientes normas contienen disposiciones que, mediante la referencia dentro de este texto, constituyen la integridad del mismo. En el momento de su publicación eran válidas las ediciones indicadas. Todas las normas están sujetas a actualización; los participantes, mediante acuerdos basados en esta norma, deben investigar la posibilidad de aplicar la última versión de las normas mencionadas a continuación. NTC 4092:1997, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Reglas generales para los análisis microbiológicos. (ISO 7218:1997). NTC-ISO 5667-3:1995 Gestión Ambiental. Calidad de agua. Muestreo. Directrices para la Conservación y manejo de las muestras. NTC-ISO 5667-5:1996 Gestión Ambiental. Calidad de agua. Guía para el muestreo de agua potable y agua utilizada para alimentos y procesamiento de bebidas. NTC-ISO 5667-14:1999 Calidad de agua muestreo. Parte 14: Guía para el control de la calidad en el muestreo y en el manejo ambiental del agua. 19.2 DOCUMENTO DE REFERENCIA AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION; WATER ENVIRONMENT FEDERATION. Standard Methods For The Examination of Water and Wastewater, 20 TH EDITION.1998.Washington Multiple Tube Fermentation Technique for Members of the Coliform Group (SM 9921) and Enzyme Sustrate Coliform Test (SM 9223). 19
  • 23. NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4939 Anexo A (Normativo ) Esquema de las pruebas presuntiva, confirmativa y completa para la detección de coliformes totales Inocular caldo lauril triptosa o caldo presencia asencia en tubos de fermentación o botellas e incubar a 24 +/- 2 horas a 35 +/- 0,5°C (1) Producción de gas y/o crecimiento ácido. (2) Ausencia de gas o ácido. Transferir a fase confirmatoria a caldo bilis lactosa Incubación adicional 24 horas verde brillante. Incubar 48 +/- horas a 35 +/- 0,5°C (total 48 +/- 3 horas) (a) Gas producido. Transferir a agar (b) No gas producido. LES Endo o agar MacConkey. Prueba negativa. Grupo (a) Gas o ácido producido. Incubar a 24 +/- 2 horas a 35 +/- 0,5°C coliforme ausente. continue en (1a) (b) Crecimiento ácido (1,1) Colonias de coliformes típicas o atípicas. Confirmar como en (1) Transferir a agar blando y tubos de (1,2) Colonias negativas. fermentación con caldo lauril triptosa. Incubar Grupo coliforme ausente agar blando 18 a 24 h y caldo lauril triptosa (c) no producción de ácido de 24 +/- 2h a 48 +/- 3h a 35 +/- 0,5°C y gas. Prueba negativa Grupo coliforme ausente (a') Producción de gas. (b') Ausencia de gas. teñir con gran parte Prueba negativa del crecimiento en agar blando Ausencia de grupo coliforme. (1,11) Presencia de bacilos gramnegativos. Ausencia de esporas. Prueba completa: (1,12) Presencia de esporas o esporas y presencia de grupo coliforme. bacilos grampositivos. Prueba completa: Presencia de bacilos gramnegativos y Ausencia de grupo coliforme grampositivos. Repetir el procedimiento comenzando en 1,1 20