Entamoeba gingivalis, enfermedad periodontal y VIH
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Este documento presenta los resultados de un estudio que encontró evidencia de variabilidad genética intraespecífica y la ocurrencia de Entamoeba gingivalis en pacientes VIH positivos. El estudio analizó muestras orales de 82 pacientes y encontró una prevalencia mayor de E. gingivalis en pacientes VIH positivos en comparación con pacientes VIH negativos. Además, el análisis genético reveló secuencias de nucleótidos diferentes en las muestras de pacientes en relación con la cepa de referencia,
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Entamoeba gingivalis, enfermedad periodontal y VIH
- 1. Primera evidencia genética de variabilidad intraespecífica y ocurrencia de Entamoeba gingivalis en pacientes VIH (+)/SIDA Sibeli B. S. Cembranelli*, Fernanda O. Souto, Kennio Ferreira-Paim, Tulio T. Richinho, Poliana L. Nunes, Gabriel A. N. Nascentes, Thatiana B. Ferreira, Dalmo Correia, Eliane Lages-Silva Alumna : Betty Rivera H. Docente: Trinidad Mujica. Sección 53
- 2. INTRODUCCIÓN Entamoeba gingivalis es considerado un comensal oral inofensivo en los seres humanos y se encuentra comúnmente en los cálculos y placa bacteriana. Se conoce poco de sus características genéticas y biológicas. Manifestaciones orales en pacientes VIH (+)/ SIDA Ascociada a enfermedad periodontal.
- 3. TAXONOMIA Entamoeba gingivalis Reino : protista Orden: mastigamoebida Familia: Entamoebidae Genero: Entamoeba Especie: Entamoeba gingivalis Solo se conoce el trofozoito de E.gingivalis Mide de 10 µ – 20 µ Ectoplasma bien diferenciado seudópodos Endoplasma con múltiples vacuolas Núcleo esférico CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Extraído de “Parasitosis humanas”, 5ªEd 2012 (1)
- 4. Entamoeba gingivalis CICLO DE VIDA
- 5. MÉTODOS Y RESULTADOS Locación : Clínica de Enfermedades Infecciosas y Parasitarias del Hospital de la Universidad Federal de Triángulo Minero , Brasil • Pacientes Población: 51 varones- 31 mujeres Media edad = 40 años Examen oral completo y evaluación de su aspecto gingival. se recolectaron muestras de la línea de las encías utilizando una torula y siendo posteriormente transferidas a tubos que contenían 1 mL de solución salina estéril al 0,9% • Recolección de muestras 20 seg 7840 rpm Pellet
- 6. Observación microscópica por examen directo al fresco cultivo • Medio bifásico Boeck – Drbohlav pH 6,7. • 0,1 ml incubado a 35ºC. • Subcultivos 48 hr. • solución de almidón de arroz al 0.6%. • Agregación de antibióticos Extraído de “culture of Entamoeba histolytica in vitro” ,2008 MÉTODOS Y RESULTADOS Resultado Crecimiento de E.gingivalis en 11 cultivos (29.7%) de 37 realizados
- 7. Extracción de ADN con técnica de fenol- cloroformo Volumen de muestra: 200 µL pellet Obtención de Ac. nucleico 25 µL ADN • Extracción de ADN MÉTODOS Y RESULTADOS
- 8. MÉTODOS Se obtuvieron 1400 bp la cuales fueron visualizadas y comparadas con Electroforesis en gel poliacrilamida y coloreadas con nitrato de plata 0.2% Desnaturalización Etapa de cebado Polimerización • PCR Volumen muestra 25 µL ADN Buffer 1x (10 mM Tris-HCl pH 8,5; 50 mM de KCl) Primers EGO-1 (5’-GAATAGGCGCATTTCGAACAGG-3’) y EGO 2 (5’ - TCCCACTAGTAAGGTACTACTC - 3’). Taq polimerasa
- 9. MÉTODOS • Variabilidad genética y secuenciación de SSU 18S rRNA de E. gingivalis LSSP – PCR con un primer especifico correspondiente a EGO-1 • Muestra 9 pacientes VIH (+) y 2 VIH (-) • Se utilizo una parte de las 1400 bp obtenidas por PCR • Purificadas en un gel de agarosa 1,5% • Volumen de muestra 12 µL • Electroforesis en gel poliacrilamida 7.5%. • Analizados con un software Gel compar II Se utilizo un kit de secuenciación para SSU 18S • Las secuencias fueron editadas con un software de secuenciación para conocer la distancias y ramas en las que se encuentra en un árbol filogenético. • Se utilizo un estándar de E gingivalis de la cepa ATCC 30927. • Se encontraron secuencias de nucleótidos diferentes a las que presentaba el estándar ATCC 30927, siendo depositadas en un GenBank bajo los registros KF250433 y KF250436
- 10. RESULTADOS
- 12. CONCLUSIONES E.Gingivalis es considerado un comensal oral pero se ha asociado con compromiso periodontal , ya que no ha sido detectado en zonas sanas de la cavidad oral La prevalencia fue mayor en pacientes VIH (+) 22% comparado con un 7% encontrado en individuos VIH (-) Existen estudios publicados que asocian el potencial oportunista del parasito con la inmunosupresión y bajo recuento de linfocitos , sin embargo en este estudio no es posible concluir eso. Pueden existir otros factores que no están relacionados con el recuento de linfocitos tales como al hipercolesterolemia, debido a que en cultivos de especies de amebas el colesterol mantiene y estimula su patogenicidad. No se ha reportado casos de transmisión de VIH por contacto oral, sin embargo los protozoos con capacidad fagocitica podrían ingerir células infectadas y mantener la viabilidad del virus, esto aun es materia de investigación
- 13. BIBLIOGRAFIA 1 - “PARASITOSIS HUMANAS”; David Botero Marcos Restrepo ; Corporación para lnvestlgaciones Biológicas ; Medellín, Colombia; 5ta ed (2012) 2 - “CULTURE OF ENTAMOEBA HISTOLYTICA IN VITRO” ; Al-Emara , A. Sh. Al-Badran Vet.Med. University of Al- Basrah, Journal Of Vet. Med. Sci ; Vol. 7 ; No. 1 ;(2008) 3 -”THE NEIGHBOR-JOINING METHOD: A NEW METHOD FOR RECONSTRUCTING PHYLOGENETIC TREES” N Saitou and M Nei; Mol Biol Evol (1987): 406-425. 1.Mol Biol Evol (1987) 4 (4): 406-425.
Notas del editor
- Entamoeba gingivalis es considerado un comensal oral inofensivo en los seres humanos y se encuentra comúnmente en los cálculos y placas bacterianas. Sin embargo este es un dato muy controversial, debido a que poco se conoce de las características genéticas y biológicas de este parasito, ya que también ha sido asociada con la enfermedad periodontal. Las manifestaciones orales en pacientes inmunocomprometidos, especialmente afectados por el VIH o SIDA, ocurre debido a los cambios en la inmunidad celular y la producción de metabolitos que pueden influir en la proliferación de patógenos. Además, una mayor prevalencia de microorganismos oportunistas ha sido detectado en la Microflora subgingival de pacientes VIH ( +)/SIDA, y otros microorganismos como E. gingivalis, tienen el potencial de convertirse en patógenos oportunistas.
- Entamoeba gingivalis El trofozoíto mide de 10 a 20 micras posee ectoplasma bien diferenciado que da origen a seudópodos grandes, los cuales le permiten buena motilidad. El endoplasma contiene gránulos y bacterias y gran número de vacuolas. El núcleo esférico no se observa en fresco, es más pequeño que el de E. histolytica, pero con características morfológicas similares a ésta.
- No se han descrito quistes, por lo cual la trasmisión se hace por el paso directo de trofozoítos de persona a persona por via oral mediante besos o fómites (como por ejemplo utensilios para comer). Por saliva Los trofozoítos se localizan en las encías y espacios interdentales. Aunque pueden encontrarse en personas con buena higiene oral, es más frecuente cuando hay procesos inflamatorios como piorrea, caries o un mal aseo dental. Se alimentan de bacterias y otros residuos .
- El estudio incluyo 51 varones y 31 mujeres (n=82) media de edad: 40 años Triângulo Mineiro, estado de Minas Gerais, Brasil en la Clínica de Enfermedades Infecciosas y Parasitarias del Hospital de Clínicas de la Universidad Federal de Triângulo Mineiro , que es un centro de referencia regional para la lucha contra el SIDA. Fueron sometidos a un examen oral completo, en donde los pacientes fueron clasificados con gingivitis o periodontitis basados en su aspecto gingival, se recolectaron muestras por raspado en la línea de las encías con un palillo estéril y transferido a tubos que contenian 1 mL de solución salina estéril (0,9% de NaCl), luego , se centrifugaron por 20 seg 7840 rpm y se obtuvo un pellet (precipitado) que fue resuspendido en 350 µL de solucion salina esteril al 09%
- El Examen al fresco fue realizado en los portaobjetos añadiendo 5 µL de la suspensión de pellet y luego fue colocado un cubreobjetos y examinadas en un aumento de 40X para visualización de los trofozoitos. (El núcleo esférico no se observa en fresco) Imagen no es en fresco El cultivo se realiza en medio bifásico Boeck-Drbohlav modificado (BDM) [26] ajustado a pH 6.7 (Medio de Boeck y Drbohlav modificado: para el cultivo de amebas. Se prepara con cloruro de sodio, 9 g; cloruro de calcio, 0,2 g; cloruro de potasio, 0,4 g; bicarbonato de sodio, 0,2 g; glucosa, 2,5 g; agua, 1.000 mL.) . Para realizar el cultivo se tomaron 100 µL del pellet y se incubo a 35ºC [19,27], los subcultivos se realizaron cada 48 h. Después de las primeras 48 h de cultivo, se agrega a la fase liquida una solución de almidón de arroz al 0.6% que contiene penicilina (1.000 UI/mL), estreptomicina (500 mg/mL) y la nistatina (12 UI/mL) para evitar crecimiento de bacterias.
- Para realizar pcr se tomaron 200 microlitos del pellet Extracción del ADN : técnica de extracción con fenol-cloroformo. (GARDES & BRUNS, 1993) permite obtener un ADN libre de proteínas y enzimas. Se ha utilizado con aquellas muestras cuyo ADN amplificado se quería secuenciar y tanto a partir de las células obtenidas en cultivo. Ruptura de células mediante la adición de tampón de extracción TE b)Precipitación de las proteínas mediante adición de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico. Se agita y centrifuga 15 m a 14000 rpm y se recupera la fase superior en un microtubo estéril. c)Eliminación del fenol: Se añade 600 ul de cloroformo, se agita y se centrifuga 5mn a 14000 rpm. Se recupera la fase superior en un eppendorf estéril. Repetir este paso. d)Precipitación de los ácidos nucleicos: Se añade 1 mL de isopropanol. Se mezcla suavemente y se incuba al menos 1 h a -20°C. e)Lavado del precipitado: Se centrifuga 20 mn a 14000 rpm. Se elimina cuidadosamente el sobrenadante. Se lava con etanol 70% helado y se centrifuga 5 mn a 14000 rpm, se deja secar para eliminar las trazas de alcohol. El ADN así obtenido es rehidratado con agua destilada o tamponada -----Para obtención de ac. Nucleicos (ADN)
- PCR : amplificación in vitro de un fragmento de ADN es rxn enzimática catalizada por ADN pol , es copiar un fragmento de DNA . Se necesita un fragmento de ADN, que fue obtenido por la técnica de fenol cloroformo, donde se obtuvo 25 µL de ADN , se necesitan DNTPs (nucleótidos fosfatados) que son sustratos necesarios para síntesis de ADN, así como Iones magnesio y otras sales que se consiguen usando un tampón de reacción, en este caso se utilizo un buffer 1 x (10 mM Tris-HCl pH 8,5; 50 mM de KCl) Los cebadores reconocen una región especifica del genoma, lo que producirá la amplificación de ese fragmento . Y la enzima taq polimerasa Electroforesis: Es un método que permite la separación de moléculas, esta separación se realiza en un gel, que es una malla compleja de moléculas poliméricas. Los geles pueden ser de agarosa o poliacrilamida. La agarosa es conveniente para separar fragmentos de ácidos nucleicos en el rango desde unos pocos cientos, hasta aproximadamente 20000 pb . La poliacrilamida es preferible para la separación de fragmentos más pequeños de ácidos nucleicos y para separación de proteínas. El peso molecular de los ácidos nucleicos se mide con las siguientes unidades: ADN: en pares de bases o bp. 1: se incuban a 95 celcius 30 s a 1 min, mol de DNA dos cadenas de nucleótidos los puentes di H se rompen y se separan, amabas adenas sirven como moldes , desnayuralizacio 2: 50 60 grados incubación 30 s a 1 m los cebadores se unen a los extremos del frag de DNA, se unen solo si el fragmento de ADn especifico (el que se quiere estudiar) esta presente en la muestra se produce la amplicifacion, etapa de cebado 3: 72 graod 30 s 1 min t optima de acción de la DNA pol, esta une los dntp a los extremos de los cebadores y comenza copiar el fragmento de DNA, estapa dde polimerización Se obtiene 1 molecula de ADN copiada por cada molecula de ADN original aprox 30 ciclos electroforesis Marcador de peso molecular para conocer por comparacion del tamañao de fragmentos amplificados por PCR Permite separación de moleculas cargadas a través de un gel, moléculas pequeñas avanzan menos moléculas grandes quedaran retenidas, DNA moléculas con carga negativa, se mueve del polo negativo al polo positivo.
- El método DE LSSP – PCR consiste en una re amplificación de una amplificación, el procedimiento es el mismo que una PCR convencional. Cuadrado rojo 2 diferentes clúster que comparte un 68.3% de similaridad , los ailados C y E están asociados a pacientes Vih (-) Los aislados h4 y h14 comparten un 96.3% similaridad y h50 y h57 un 91.9 Sim embargo la relación entre los clúster , características epidemiológicas y clínicas de los pacientes no tienen relación co la edd genero origen geográfico carga viral o recuento de linfocitos
- Cuadrado rojo 2 diferentes clúster que comparte un 68.3% de similaridad , los ailados C y E (morado) están asociados a pacientes Vih (-) Los aislados h4 y h14 comparten un 96.3% similaridad y h50 y h57 un 91.9 Sim embargo la relación entre los clúster , características epidemiológicas y clínicas de los pacientes no tienen relación co la edd genero origen geográfico carga viral o recuento de linfocitos
- La verdad es que las graficas no las entiendo, pero de esto puedo sacar que existe un Un polimorfismo de un solo nucleótido o SNP (Single Nucleotide Polymorphism, pronunciado snip) que es una variación en la secuencia de ADN que afecta a una sola base (adenina (A), timina (T), citosina (C) o guanina (G)) de una secuencia del genoma. Sin embargo, algunos autores consideran que cambios de unos pocos nucleótidos, como también pequeñas inserciones y deleciones (indels) pueden ser consideradas como SNP, siendo entonces más adecuado el término Polimorfismo de nucleótido simple.1 Los SNP que se localicen dentro de una secuencia codificante pueden modificar o no la cadena de aminoácidos que producen; se llama SNP no-sinónimos a los primeros y SNP sinónimos (o mutaciones silenciosas) a los segundos. Los SNP que se encuentren en regiones no codificantes pueden tener consecuencias en el proceso de traducción, sobre todo en procesos como el splicing, la unión de factores de transcripción o modificar la secuencia de ARN no codificante.