Estandarización de Inmunoterapia Alérgeno Específica

Instituto Mexicano Del Seguro Social
Centro Médico Nacional SIGLO XXI
Edwin Daniel Maldonado Domínguez
R2 de Alergia e Inmunología Clínica
ESTANDARIZACIÓN
de inmunoterapia
alérgeno específica

Introducción:
Los extractos
de alérgenos
son mezclas
complejas de
biomateriales
naturales
Contienen:
proteínas,
carbohidratos,
enzimas y
pigmentos
Los alérgenos
pueden
constituir solo
una pequeña
proporción
Lockey R. Allergens and Allergen Immunotherapy: Subcutaneous, Sublingual and Oral. 6th Ed. 2020. Taylor & Francis Group.

Fabricación de extractos de
alérgenos
Los extractos de alérgenos se clasifican en:
Estandarizados
Se fabrican y etiquetan según el
contenido de alérgenos
específicos o la actividad
alergénica general, que reflejan la
comparación con los estándares
de potencia
No estandarizados
No tienen un estándar de
potencia y se fabrican en función
de la unidad de nitrógeno
proteico (PNU) o del peso de
material de origen extraído con
un volumen determinado de
líquido de extracción (p/v)
Preparation and Standardization of Allergen Extracts. Middleton's Allergy: Principles and Practice, 2020.29, 467-478.e1

Existen variaciones de un lote a otro en el contenido de
alérgenos que puede ser considerable
Las diferencias de
consistencia entre
los extractos
alergénicos
pueden reflejar la
naturaleza
inherente de las
materias primas
Polen y ácaro
tienen mayor
consistencia de lote
a lote
Moho, polvo
doméstico e
insectos tienen
menor consistencia

Los fabricantes pueden aumentar la consistencia de sus
productos mediante:
Técnicas de extracción y
fabricación reproducibles y
optimizadas
Aplicando fechas de
vencimiento basadas en
datos de estabilidad en
tiempo real
Sin embargo, la consistencia solo puede garantizarse
midiendo la potencia de cada lote de extractos y
comercializando solo aquellos lotes cuya potencia se
encuentre dentro de un rango aceptable

Estandarización:
J Allergy Clin Immunol. 2016; 137(2): 358-368.
El proceso de desarrollo de
métodos, unidades, normas
y materiales de referencia
para lograr uniformar la
producción de extractos y
vacunas de alérgenos.
Objetivo:
garantizar un
producto
reproducible y
de alta
calidad

¿Cuál es el propósito de la
estandarización?
Caracterizar la potencia de los extractos de alérgenos
Minimizar la variación entre lotes, incluso entre diferentes
fabricantes
Permitir al médico y paciente cambiar de un producto de un
fabricante a otro con riesgo mínimo de reacción adversa

En 1980-1981 la IUIS formuló directrices para el establecimiento de
normas internacionales (IS):
El subcomité seleccionó, caracterizó y produjo estándares internacionales
en forma de extractos de alérgenos de varias fuentes alergénicas
Ambrosía
artemisiifolia
Phleum
pratense
D.
pteronyssinus
Betula
verrucosa
Canis
familiares
Alternaria
alternata
Cynodon
dactylon
Lolium
perenne
Felis
domesticus
D. farinae
Sin embargo esta iniciativa fracasó.
Actualmente los estándares internacionales se obtienen del Instituto Nacional de Control y
Ciencia Biológica (NIBSC)

Desde 2001 a 2005 financió un
proyecto de estandarización de
alérgenos
Se tituló “Desarrollo de materiales
de referencia certificados para
productos alergénicos y validación
de métodos para su cuantificación”
Proyecto CREATE
Los objetivos: evaluar el uso
potencial de alérgenos
recombinantes purificados como
materiales de referencia
Evaluación de ensayos ELISA
disponibles para medición de
alérgenos principales
El resultado fue el establecimiento
de la base para los 2 primeros
alérgenos recombinantes rBet v 1 y
rPhl p 5.01

En Estados Unidos:
Desde la
década de
1980, se han
estandarizado
19 extractos de
alérgenos:
Lockey R. Allergens and Allergen
Immunotherapy: Subcutaneous,
Sublingual and Oral. 6th Ed. 2020. Taylor
& Francis Group.
Center for Biologics Evaluation and
Research (CBER)
Se encarga de la regularización

Productos estandarizados y
no estandarizados:
Procesos de extracción son esencialmente
idénticos
La diferencia es en el enfoque de la formulación
No estandarizados se formulan con base en p/v contenido de proteína,
mientras que los estandarizados con base en resultados de pruebas de
potencia

Extracción de extractos:
La recolección de
los materiales de
origen se debe
realizar por
personal calificado
Se deben utilizar
materiales de
origen alergénico
específicamente
identificados que
no contengan
sustancias
extrañas evitables
El procesamiento
y almacenamiento
de los materiales
de origen debe
realizarse de
manera que se
garantice que no
se introduzcan
sustancias no
deseadas en los
materiales

Se realiza en
presencia de
aditivos que
suprimen
crecimiento
microbiano
(glicerina
50%, fenol
0.4%)
El tiempo
prolongado
puede
aumentar la
recuperación
de proteínas
pero puede
desnaturalizar
alérgenos
Se puede usar
diálisis o
ultrafiltración
para eliminar
sustancias no
antigénicas de
bajo peso
molecular (<5
kD)

Polen:
La identidad del polen
se confirma mediante
inspección
macroscópica y
microscópica
El polen se obtiene
mediante la recolección
en la naturaleza,
campos cultivados o
invernaderos
La recolección se puede
realizar mediante varios
métodos, como pasar la
aspiradora o secar las
cabezas de las flores y luego
molerlas
Finalmente, el polen se
seca en condiciones
controladas y se
almacena en
contenedores sellados
a temperaturas <5°
El nivel máximo
aceptado de
contaminación con
polen de otras especies
es del 1%

Ácaros:
Se cultivan en condiciones controladas de temperatura y humedad
Recientemente, se ha descrito la identificación genética de especies de ácaros, lo que permite la
identificación a partir de fragmentos de ácaros e incluso partículas fecales
Se deben tomar las medidas adecuadas para evitar la contaminación con otros ácaros, y los cultivos de
ácaros deben estar libres de rastros visibles de mohos
Los materiales de origen de los ácaros son cultivos de ácaros enteros o fracciones de ácaros purificadas, por
ejemplo, cuerpos de ácaros y partículas fecales, que se pueden preparar antes de la fabricación de la
sustancia activa

Epitelio de animales:
Los alérgenos de origen animal pueden provenir de diversas fuentes: pelo, caspa, fragmentos de epitelio,
plumas, suero, saliva u orina
Los alérgenos a los que están expuestos los seres humanos
dependen del comportamiento normal del animal.
Los materiales de origen deben recolectarse solo de animales
declarados abiertamente sanos por un veterinario
La materia extraña (Ácaros y pulgas), suciedad y epitelios y
excrecencias de animales extraños, debe determinarse mediante
ensayos adecuados (microscopía, ELISA, etc.)
Lockey R. Allergens and Allergen Immunotherapy: Subcutaneous, Sublingual and Oral. 6th Ed. 2020. Taylor &
Francis Group.

Insectos:
Se selecciona todo el cuerpo
del insecto como fuente de
alérgenos
En el caso de los insectos
que pican, el veneno es la
fuente ideal de alérgenos
Las abejas se mantienen en
colmenas y pueden
electroestimularse para
administrar veneno al entrar
en la colmena
Las avispas deben disecarse
manualmente después de
congelarlas en hielo seco
para producir unos pocos
microlitros de veneno por
insecto
La especie se especifica por
características morfológicas,
y se describe el método de
recolección y extracción del
veneno
La identidad del material
fuente de veneno de
himenópteros se confirma
mediante análisis de
proteínas y ensayos de
actividad enzimática

Hongos:
Se obtienen cultivando el moho en condiciones controladas
La identidad del material de origen del moho debe confirmarse mediante inspección
macroscópica y microscópica y análisis de proteínas
Los materiales de origen recolectados consisten en micelios y esporas, así como
componentes liberados en el medio de cultivo
Debido a las dificultades para mantener una composición constante de cultivos de mohos, un
extracto debe derivarse de al menos cinco cultivos independientes de la misma especie

Pruebas de control de calidad:
Se realizan después de la filtración para asegurar:
Calidad Seguridad Esterilidad
Las pruebas de control de calidad incluyen la evaluación de
la potencia ya sea en el proceso o en la etapa de liberación a
granel estéril
Se evalúa: Contenido de proteínas
Contenido de alérgenos
específicos
Actividad alergénica

Los extractos de alérgenos:
Deben ser
estériles
La esterilización se logra mediante
filtración a través de un filtro
esterilizador con un poro de 0.2 µm
Deben contener
un conservante
Cuando son alérgenos en viales de
dosis múltiples. Los más empleados:
fenol 0.4% o glicerina 50%

Para establecer la consistencia de lote a lote, se realizan
una o más de las siguientes pruebas en cada lote
Proteína total
Perfil de proteínas
mediante métodos de
electroforesis adecuados
Perfil de alérgenos basado
en la identificación de
componentes alergénicos
relevantes mediante
reactivos de anticuerpos
específicos de alérgenos
Contenido de alérgenos
principales mediante un
método inmunoquímico
adecuado, como ELISA
Actividad alergénica total
por inhibición de IgE o
método in vitro
equivalente adecuado
Posible prueba específica
para el material fuente en
cuestión

Estados
Unidos
Europa
• Las pruebas de liberación de
lotes para extractos
estandarizados se realizan
utilizado un único estándar
de potencia nacional o
preparación de referencia
• Las pruebas de liberación de
lotes para extractos
estandarizados emplean la
preparación de referencia
interna del fabricante derivada
de un ciclo de producción de
acuerdo con el proceso de
fabricación validado y autorizado

En los Estados Unidos:
La estandarización de alérgenos comprende
2 componentes importantes:
La selección de una
preparación de
referencia de extracto
alergénico
La selección de los
procedimientos para
comparar los
productos
manufacturados con el
extracto de referencia

Se le asigna una unidad específica que
posteriormente se puede asignar a todos los
extractos de alérgenos de la misma fuente
en función de la potencia relativa (PR) con
respecto a la referencia utilizando el método
cuantitativo de potencia in vitro establecido
Una vez que se tiene la preparación de
referencia:

Elección de la mejor prueba de
potencia:
Depende el extracto de alérgeno a estandarizar
Ambrosía
Medición de 1
solo alérgeno
inmunodiminante
(Amb a 1)
Pelo de gato
Medición de 1
solo alérgeno
inmunodiminante
(Fel d 1)
Piel de gato
Se verifica la
presencia de 2
alérgenos como
Fel d 1 y
albúmina
Veneno de
himenópteros
Hialuronidasa y
fosfolipasa A2
Para cada lote

Método para evaluación inicial de alergenicidad:
Método de pruebas
intradérmicas seriadas de
individuos altamente alérgicos
Se usa el tamaño de eritema
en respuesta a la inyección
intradérmica
Este método se denomina “La dilución intradérmica
para 50 mm de suma de eritema que determina las
unidades de alergia bioequivalentes” (ID50EAL) y se
puede utilizar para comparar la alergenicidad de los
extractos independientemente de la fuente.

Considera que 10,000 unidades/ml biológicamente estandarizadas son equivalentes a una
dosis de alérgeno que provoca una roncha igual (en milímetros cuadrados) a la provocada
por 10 mg / ml de histamina
El método ID50EAL (método de dilución intradérmica para la suma de 50
mm de eritema que determina las unidades de alergia bioequivalente):
Las pruebas in vivo consisten: en punción cutánea con varias diluciones en
al menos 20 sujetos alérgicos
La dilución del extracto que en promedio produce una induración de 50
mm se le asigna de manera arbitraria una potencia de 10,000 unidades de
alérgenos bioequivalentes (BAU/mL)
A los extractos con una D50 media de 14, que se encuentra entre la dilución en serie de 3
veces 13 y 15 del extracto de referencia, se les asigna arbitrariamente el valor de 100.000
BAU / ml.
J Allergy Clin Immunol. 2016; 137(2): 358-368.

Método de bioensayo en línea paralela:
Ayuda a determinar las dosis bioequivalentes de extractos de pruebas de
la misma fuente que el extracto de referencia
Los sujetos altamente alérgicos se
prueban con el método ID50EAL con
extractos de referencia y de prueba.
Si las dos líneas se superponen, los
extractos de prueba y de referencia
son bioequivalentes. Si las dos
líneas son paralelas pero no se
superponen, sus potencias difieren.
Preparation and Standardization of Allergen Extracts. Middleton's Allergy: Principles and Practice, 2020.29, 467-478.e1

Métodos para estandarización in vitro
Aunque las pruebas cutáneas son un componente esencial del
programa de estandarización de alérgenos, no están
diseñadas para el uso rutinario en las pruebas de lotes de
extractos fabricados antes de su liberación
Los métodos sustitutos pueden basarse en:
Cuantificación del
contenido total de
proteínas
Contenido de
alérgenos específicos
dentro de los
extractos de alérgenos
Inhibición de la unión
de IgE de sueros
alérgicos combinados
al alérgeno de
referencia

Ejemplo: Ambrosía
Las unidades de potencia para los
extractos cortos de polen de
ambrosía se asignaron
originalmente en función de su
contenido de Amb a 1
Los datos posteriores sugieren que 1 unidad de Amb a 1 es
equivalente a 1 µg de Amb a 1, mientras que 350 unidades
de Amb a 1/mL es equivalente a 100,000 BAU / mL

Ejemplo: Gato
Los extractos de gato se estandarizaron originalmente
en función de su contenido de Fel d 1, con unidades
arbitrarias (llamadas "unidades de alergia" o AU / mL)
ligadas a las determinaciones de Fel d 1.
Las pruebas de ID50EAL posteriores
dieron como resultado la asignación de
10,000 BAU / mL unitarios a extractos
de gato, que contenían 10-19.9 Fel d 1
U / mL

Ensayo de inmunodifusión radial
Se utiliza para determinar las potencias de productos en los que se han
identificado y definido los alérgenos inmunodominantes (Amb a 1 y Fel d 1)
Se agrega antisuero
específico para el alérgeno
en una solución de agar, que
luego se solidifica
Se perforan los pocillos en el
agar y se coloca el alérgeno
de prueba en los pocillos
A medida que el alérgeno
específico se difunde fuera de los
pocillos y dentro del agar, se forma
un anillo de precipitina que
delimita la zona de equivalencia
para la unión antígeno-anticuerpo.

Ensayos enzimáticos
Ejemplo: extractos de alérgenos de veneno se estandarizan mediante
ensayos enzimáticos que estiman el contenido de hialuronidasa y
fosfolipasa en función de su actividad enzimática.
En estos ensayos, se prepara una solución de agar con el sustrato
enzimático apropiado y luego se añaden las muestras de prueba a los
pocillos del agar.
A medida que la enzima presente en la muestra se difunde en el agar,
digiere el sustrato, formando zonas de limpieza alrededor de los pocillos.
A continuación, se mide el radio de las zonas claras y se calcula como el
logaritmo de la concentración de la enzima presente en la muestra.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzimas de competición
Se utiliza para extractos de alérgenos estandarizados para los que no
existe consenso sobre los componentes inmunodominantes.
La potencia se determina
comparando la unión global
a IgE humana en sueros
combinados de sujetos
altamente alérgicos y
comparándolo con un
extracto de referencia
Después de cubrir los
pocillos de la placa con el
extracto de alérgeno de
referencia, se añade a los
pocillos una mezcla del
extracto de alérgeno que se
está analizando y los sueros
combinados
El extracto de prueba en
solución compite por la IgE
en los sueros combinados
con el alérgeno de referencia
unido, de modo que cuanto
más alérgeno
inmunorreactivo en la
mezcla, menos anticuerpo
IgE del suero se unirá al
alérgeno inmovilizado en la
placa
Una vez más, la
concentración de alérgenos
en el extracto de alérgeno se
determina por comparación
con el extracto de alérgeno
de referencia

Establecimiento y uso de preparados
de referencia en casa (IHRP) (Europa)
Habiendo establecido un proceso de producción que incluye el control de
las materias primas, la estandarización de lote a lote se lleva a cabo en
relación con un IHRP
Se debe caracterizar
minuciosamente mediante
métodos de laboratorio in
vitro para demostrar una
complejidad adecuada así
como un contenido
apropiado de alérgenos
principales
La potencia debe
determinarse mediante
métodos in vivo, como
pruebas cutáneas, y lo
ideal es determinar el
contenido de alérgenos
principales en cantidades
absolutas
Sirve como modelo del
extracto de alergia que se
combinará con cada lote
siguiente

La estandarización de un lote a otro se puede realizar
mediante el siguiente procedimiento de tres pasos:
1.- Determinación de la composición de alérgenos para asegurar
que estén presentes todos los alérgenos importantes
2.- Cuantificación de alérgenos específicos para asegurar que los
alérgenos esenciales estén presentes en proporciones constantes
3.- Cuantificación de la actividad alergénica total para asegurar que la
potencia general del extracto sea constante (in vivo y/o in vitro)

Calidad del extracto
alergénico
Es una medida de la complejidad de la
composición, incluida la concentración de cada
componente, especialmente los principales
alérgenos
La complejidad de la composición de los extractos
se puede evaluar mediante varias técnicas:

Electroforesis en gel de
poliacrilamida con
dodecilsulfato de sodio
(SDS-PAGE)
• Las proteínas se
separan, pero solo
después de la
desnaturalización,
según el tamaño.
Enfoque isoeléctrico
(IEF)
• Es una técnica
electroforética
cualitativa que separa
las proteínas según su
carga (puntos
isoeléctricos
Inmunoelectroforesis
cruzada (CIE)
• Es una técnica
mediante la cual se
distinguen antígenos
individuales en geles de
agarosa en forma de
precipitados antígeno-
anticuerpo en forma de
campana
• El método proporciona
información sobre las
concentraciones
relativas de varios
antígenos importantes
en un solo experimento

Cuantificación de alérgenos
específicos:
Habiendo determinado una complejidad adecuada en la
composición, un extracto de alérgeno todavía puede ser
teóricamente deficiente en el contenido de alérgeno principal
Importante evaluar de forma independiente el contenido de
alérgenos principales, ya que la dosis de mantenimiento
contiene una cantidad definida de alérgeno principal

Dosis de mantenimiento de algunos alérgenos:
Se pueden aplicar
varias técnicas
inmuno-
electroforéticas
para la
determinación
cuantitativa de
alérgenos
individuales

Determinación de la eficacia
clínica:
La potencia de los extractos de alérgenos utilizados debería expresarse
idealmente en unidades que describan la eficacia clínica, ya que no existe
relación entre la dosis terapéutica y la potencia de la prueba cutánea
Se han realizado enfoques para
relacionar la potencia del extracto y
la eficacia clínica en los Estados
Unidos y Europa
Para varias vacunas estandarizadas,
varios ensayos han establecido una
dosis de mantenimiento óptima
cuando se usa para el tratamiento
subcutáneo (5-20 µg de alérgeno
principal)

Diferencias en los procesos de
estandarización en USA y Europa

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