Regulación de ligandos de NKG2D por IL-10 y su asociación con Calreticulina en trofoblasto y melanoma humano
•Descargar como PPT, PDF•
0 recomendaciones•386 vistas
Tesis para optar al grado de Doctor en Bioquímica
Recomendados
Más contenido relacionado
La actualidad más candente
La actualidad más candente (20)
Destacado
Similar a Regulación de ligandos de NKG2D por IL-10 y su asociación con Calreticulina en trofoblasto y melanoma humano
Similar a Regulación de ligandos de NKG2D por IL-10 y su asociación con Calreticulina en trofoblasto y melanoma humano (20)
Más de Antonio E. Serrano
Más de Antonio E. Serrano (20)
Último
Último (20)
Regulación de ligandos de NKG2D por IL-10 y su asociación con Calreticulina en trofoblasto y melanoma humano
- 1. ESTUDIO DE REGULACIÓN DEESTUDIO DE REGULACIÓN DE LIGANDOS DE NKG2D POR INTERLEUQUINA 10LIGANDOS DE NKG2D POR INTERLEUQUINA 10 Y SU ASOCIACIÓN CON CALRETICULINAY SU ASOCIACIÓN CON CALRETICULINA EN TROFOBLASTO Y MELANOMA HUMANOEN TROFOBLASTO Y MELANOMA HUMANO Tutores: Dra. Mª Carmen Molina Dr. Juan Carlos Aguillón Programa de Inmunología ICBM . Fac de Medicina T.M. Antonio E. Serrano G. Escuela de Graduados Fac. Cs Qcas. y Farmacéuticas U. de Chile Examen publico para optar al grado de Doctor en Bioquímica
- 2. Características de Cáncer y Tolerancia FetalCaracterísticas de Cáncer y Tolerancia Fetal
- 3. Evasión inmuneEvasión inmune Adaptado De Zwirner Et Al 2007 SinciciotrofoblastoEndometrio TGF-β IL-10 FAS/FASL VEGF TUMOR PLACENTA
- 4. -Inmunovigilancia -Equilibrio entre activación e inhibición -8 diferentes ligandos -Células estresadas -Mecanismos de Evasión SistemaSistema NKG2D/NKG2DLNKG2D/NKG2DL
- 5. Mecanismos de inducción de la expresión de NKG2DLMecanismos de inducción de la expresión de NKG2DL Adaptado de Mistry et al , 2008
- 6. Mecanismos de inhibición en la expresiónMecanismos de inhibición en la expresión de NKG2DLde NKG2DL Adaptado de Mistry et al , 2008
- 7. IL-10 en Embarazo y CáncerIL-10 en Embarazo y Cáncer Hanna, Journal of Immunology, Embarazo Cáncer Mocellin et al 2005 PrimerTrimestre SegundoTrimestre Término
- 8. CRT como regulador de la expresión de proteínasCRT como regulador de la expresión de proteínas Control Ad-CRT 1 2 La sobre expresión de Vasostatina, fragmento de Calreticulina, reduce la expresión de MICA (Liu et al 2006) Calreticulina regula la expresión en superficie de receptores de membrana Harada et al 2005
- 9. RacionalRacional •Se desconocen las proteínas chaperonas asociadas a MIC en su plegamiento y retención •Se ha descrito regulación de la expresión de MIC por parte de citoquinas. Se desconoce el efecto de IL-10, sobre la expresión de este ligando.
- 10. HipótesisHipótesis Calreticulina se asocia con MICA en células de trofoblasto y de melanoma maligno e IL-10 disminuye la expresión de MICA en melanoma maligno, reduciendo la capacidad efectora de las células NK medida en un ensayo citotóxico
- 11. ObjetivoObjetivo Determinar nuevos mecanismos de regulación negativa de los ligandos del receptor NKG2D relacionados con la evasión inmune
- 12. Objetivos EspecíficosObjetivos Específicos • O.E.1: Localizar MIC en compartimentos intracelulares de células de trofoblasto y melanoma, colocalizando con proteínas chaperonas • O.E.2: Obtener la proteína MIC de células de trofoblasto por inmunoprecipitación en conjunto con las proteínas asociadas • O.E.3: Estudiar unión directa entre MIC y Calreticulina mediante análisis de interacción de proteínas recombinantes • O.E.4: Estudiar en un modelo de cultivo de melanoma maligno la modulación de la expresión de MIC por IL-10
- 13. Objetivos EspecíficosObjetivos Específicos • O.E.1: Localizar MIC en compartimentos intracelulares de células de trofoblasto y melanoma, colocalizando con proteínas chaperonas • O.E.2: Obtener la proteína MIC de células de trofoblasto por inmunoprecipitación en conjunto con las proteínas asociadas • O.E.3: Estudiar unión directa entre MIC y Calreticulina mediante análisis de interacción de proteínas recombinantes • O.E.4: Estudiar en un modelo de cultivo de melanoma maligno la modulación de la expresión de MIC por IL-10
- 14. HistopatologiaHistopatologia Firma Consentimiento Informado Ficha de Ingreso •Multiparidad •Patología asociada •Infecciones asociadas •Fiebre •Tipo de pérdida Mujeres con pérdida Diagnosticada¡ Tejido Melanoma Inmunohistoquimica Microscopia Confocal
- 15. MICA y MICB se expresan en trofoblasto de 1er trimestre
- 16. MICA y MICB se expresan en melanoma malignoMICA y MICB se expresan en melanoma maligno
- 17. MICA y MICB se expresan en citoplasma de célulasMICA y MICB se expresan en citoplasma de células sinciciotrofoblasto y se superponen con moléculassinciciotrofoblasto y se superponen con moléculas chaperonas en placenta de primer trimestrechaperonas en placenta de primer trimestre
- 18. MICA y MICB se expresan en citoplasma de célulasMICA y MICB se expresan en citoplasma de células de melanoma y se superponen con moléculasde melanoma y se superponen con moléculas chaperonaschaperonas
- 19. ResumenResumen O.E.1.O.E.1. Localizar MIC en compartimentos intracelulares de célulasLocalizar MIC en compartimentos intracelulares de células de citotrofoblasto, colocalizando con proteínas chaperonasde citotrofoblasto, colocalizando con proteínas chaperonas • MICA y MICB se ubican en citoplasma de sinciciotrofoblasto y melanoma. • MICA y MICB se superponen con CRT, CNX y ERP57 en células de melanoma maligno y trofoblasto de primer trimestre
- 20. Objetivos EspecíficosObjetivos Específicos • O.E.1: Localizar MIC en compartimentos intracelulares de células de trofoblasto y melanoma, colocalizando con proteínas chaperonas • O.E.2: Estudiar la interacción de MIC y Calreticulina por inmunoprecipitación • O.E.3: Estudiar unión directa entre MIC y Calreticulina mediante análisis de interacción de proteínas recombinantes • O.E.4: Estudiar en un modelo de cultivo de melanoma maligno la modulación de la expresión de MIC por IL-10
- 21. MICA co-inmunoprecipita con la molécula chaperonaMICA co-inmunoprecipita con la molécula chaperona Calreticulina en células de melanoma maligno humano yCalreticulina en células de melanoma maligno humano y en trofoblasto tempranoen trofoblasto temprano A B MICA (42): Molécula relacionada a la cadena A de MHC CRT (48): Calreticulina SNC: Suero normal de conejo
- 22. Interacción MIC/CRT BSA MICA recombinate E.coli Y YAcPo anti CRT Anti Conejo -HRP
- 23. Interacción MIC/CRT • Ensayo de ELISA de interacción rCRT / rMICA . Placa de ELISA sensibilizada con rMICA y analizada con varias concentraciones de rCRT BSA MICA recombinate E.coli Y YAcPo anti CRT Anti Conejo -HRP
- 24. ResumenResumen O.E.2O.E.2 y O.E.3: • CRT inmunoprecipita MICA en melanoma maligno y trofoblasto • MICA inmunoprecipita CRT en melanoma maligno • CRT y MICA recombinante de origen procarionte interactuan en un ensayo de ELISA • Adicionalmente, En biacore MICA de origen eucarionte y CRT recombinante no interactuaron directamente.
- 25. Objetivos EspecíficosObjetivos Específicos • O.E.1: Localizar MIC en compartimentos intracelulares de células de trofoblasto y melanoma, colocalizando con proteínas chaperonas • O.E.2: Obtener la proteína MIC de células de trofoblasto por inmunoprecipitación en conjunto con las proteínas asociadas • O.E.3: Estudiar unión directa entre MIC y Calreticulina mediante análisis de interacción de proteínas recombinantes • O.E.4: Estudiar en un modelo de cultivo de melanoma maligno la modulación de la expresión de MIC por IL-10
- 26. Niveles de los Ligandos de NKG2D y analisis de la LisisNiveles de los Ligandos de NKG2D y analisis de la Lisis por accion de LAK a tres líneas de melanoma incubadaspor accion de LAK a tres líneas de melanoma incubadas con IL-10con IL-10 Citometría de Flujo de la expresión de superficie de MICA, MICB ,MHC-1, ULBP1, ULBP2 y ULBP3
- 27. Sobreexpresión de IL-10 decrece localización deSobreexpresión de IL-10 decrece localización de MICA en superficie celularMICA en superficie celular *** P<0.001 * P<0.05 ** P<0.01
- 28. IL-10 cambia niveles de expresión de MICA y MICB enIL-10 cambia niveles de expresión de MICA y MICB en líneas de melanoma FMS.líneas de melanoma FMS. * P<0.05 * P<0.05 * P<0.05 ** P<0.01
- 29. IL-10 modifica la lisis de celulas de melanoma mediadaIL-10 modifica la lisis de celulas de melanoma mediada por NKG2Dpor NKG2D * P<0.05
- 30. • IL-10 expresada endogenamente y agregada exógenamente disminuye la localización en superficie y la expresión de mRNA de MICA afectando la citotoxicidad medidada por células LAK • rIL-10 aumenta localización en superficie y la expresión de mRNA de MICB ResumenResumen O.E.4.O.E.4.
- 31. ConclusionesConclusiones . • MICA y MICB se expresan en melanoma maligno y en trofoblasto temprano y colocalizan intracelularmente con Calreticulina • IL-10 expresada endogenamente y agregada exógenamente disminuye la localización en superficie y la expresión de mRNA de MICA afectando la citotoxicidad medidada por células LAK
- 32. Agradecimientos • Realizado en: Programa de Inmunologia. ICBM Facultad de Medicina. Universidad de Chile • Dra. María Carmen Molina. • Dr. Juan Carlos Aguillón • Dr. Arturo Ferreira. • Dra. Carolina Ribeiro. • Dr. Flavio Salazar • Dra. Mercedes López Division of Structural Biology . Nuffield Department of Clinical Medicine. University of Oxford. • Prof. Yvonne Jones • Dr. Max Crispin
Notas del editor
- One of the most important cells to the immunosurelvilance, are the Natural killer cells. This NK ( EN KEI ) cell recognizes and reacts against aberrant cells arising within the body. For example in the viral infections, and tumors. The NK have a lot of receptors in the surface divided in two families. The activating inhibitory receptors and the receptor with activator activity one of the most important activator receptor is NKG2D. This receptor has the following characteristic: NKG2D can bind six different ligands on the surface on the target cell. MICA, MICB ulpb1, 2, 3, and 4, ULBPS are more important in viral infecctions, this is the reazon because i focused in 2 of the 6 ligands,… MICA and MICB. when the cells they are stressed… normally MICA and MICB are expressed on the surface. -Evade, primero la inmunovigilancia -Evaden la inmunidad antitumoral
- It been desribed a lot of mechanisms about up regulation of NKG2D ligands, including heat shok citoquines and tunoginenesis, But actually the down rregulation mecanisms it not clear. I our lab we are focused in the studies of de evation mechanisms of the target cell to the killing action of NK I have tried to describe some possible mechanisms to the down regulation of the surface expression of MICA and MICB The tumour cells create mechanisms to evade the surveillance, 3 main systems 1) down regulation 2)The secretion of soluble forms 3)And the intracellular retention.
- It been desribed a lot of mechanisms about up regulation of NKG2D ligands, including heat shok citoquines and tunoginenesis, But actually the down rregulation mecanisms it not clear. I our lab we are focused in the studies of de evation mechanisms of the target cell to the killing action of NK I have tried to describe some possible mechanisms to the down regulation of the surface expression of MICA and MICB The tumour cells create mechanisms to evade the surveillance, 3 main systems 1) down regulation 2)The secretion of soluble forms 3)And the intracellular retention.
- Es conocido la influencia de IL10 en la IL-10 induce baja de MHC-1 en membrana IL-10 induce baja de MHC-2 membrana IL-6 induce baja de MHC-2 en membrana (Stat3) INF-g aumenta MHC I en membrana (TAP y LPM2/7) MHC-II aumento transactivador CIITA
- It Has been described some phenomena about the possible role of calreticulin as a negative regulator for example in the surface expression of CFTCR where the over expression of CRt causes of the intracelluar reteintion of these surface molecules. On the other hand the over expression of VAsostatin… a calreticulin fragment. Causes a enhanced malignant characteristic. And
- All this background Tap, a heterodimer composed of tap1 and tap2 assocated with the nascient MHC-I/b2 microglobulin, dimers trought interactions in the peptide-loading complex, this complex includes, the transmembrane glycoprotein Tapasin, calreticulin … a lectine-like chaperone that bind a monoglucosylated N-linked glycan on the MHC-I heavy chain… and Erp57 a thiol oxido reducataase non covalently associated with calreticulin and disulfide linked to tapasin. All this background leads me to think the following hypothesis MICA and MICB interact with Calreticulin. CAN BE A MECHANISM FOR RETENTION OF MICA AND MICB IN THE INTRACELLULAR COMPARTMENT. POSSIBLY AS A MECHANISM OF MODULATION OF NK ACTIVITY The folding proteins associated to NKG2D ligands are unknown
- En base a los antecedentes.. Y resultados… les propongo las siguiente hipotesis..
- Estos son los objetivos planteados para cocntestar al hipotesis. Evidenciar con placenta y… Mostrar.
- Estos son los objetivos planteados para cocntestar al hipotesis. Evidenciar con placenta y… Mostrar.
- 1) Caracteristicas: La placenta humana. Es un órgano temporal Protección física y de mecanismos de defensa Suministro de nutrientes al feto y Retiro de desechos. Órgano endocrino: Progesterona mantiene el embarazo. 2) Histologia: Esta formada por la estrecha interrelación de células provenientes de 2 genotipos diferentes, de la madre y el feto. 3) Implantacion: Después de ocurrida la fecundación el huevo se implanta en el tercio superior del útero de la madre en donde células del polo vegetal comienzan a invadir el estroma endometrial, formando así el Citotrofoblasto. Esta capa se divide y comienza a profundizar en el estroma. Al entrar en contacto con células de las glandulas endometriales, se fusionan con estas formando un sincicio conformado por núcleos provenientes del feto y de la madre, llamado Sinciciotrofoblasto. Mas tarde se generan las llamadas vellosidades coriales que son masas de tejido conjuntivo revestidas por células del trofoblasto, a lo que a su vez se forman espacios intervellosidades que se van fusiononando entre si creando un verdadero laberinto de redes lacunares, al penetrar el crecimiento corial llega a las arteriolas del útero que se encuentran dilatadas y se produce el llenado de sangre materna en los espacios intervellosidades, estableciéndose la circulación uteroplacentaria. 4) Barrera Placentaria: Es aquí donde se forma la llamada Barrera Placentaria conformada por, el sinciciotrofoblasto, el citotrofoblasto, el tejido conectivo del centro de la vellosidad, la membrana basal del capilar fetal y las células endoteliales. Es en el trofoblasto donde ocurre contacto directo entre la sangre materna y las células del trofoblasto fetal, poniéndose en juego elementos de evasion inmune, principalmente de mecanismos innatos por ser la primera línea de acción de la inmunidad, por tratarse de un escape de tipo Alogénico, ya que células del sistema inmune de la madre reconocen y tolerizan a antigenos provenientes del feto.
- I could also detect other chaperones PAPER ¡¡
- Estos son los objetivos planteados para cocntestar al hipotesis. Evidenciar con placenta y… Mostrar.
- Exite una union dosis depdendiente y saturable. Porque depende del la cantidad de crt o de mic.. La union aumenta. Controles… tsin R MICA. Control……. Sin RCrt … sin Mica ..sin CRT y sin anticuerpos. Backgroud restado Quise calcular la constante de afinidad e mica y crt por biacore. Ambas proteinas de origen E coli.
- Exite una union dosis depdendiente y saturable. Porque depende del la cantidad de crt o de mic.. La union aumenta. Controles… tsin R MICA. Control……. Sin RCrt … sin Mica ..sin CRT y sin anticuerpos. Backgroud restado Quise calcular la constante de afinidad e mica y crt por biacore. Ambas proteinas de origen E coli.
- Cambio conformacional O calcio Esto lo mostre en el worshop reciente de CRT. Y me suguirieron que pegara. CRT en la placa y realizar experimento inverso.
- Estos son los objetivos planteados para cocntestar al hipotesis. Evidenciar con placenta y… Mostrar.
- Calreticulina se asocia con las moléculas MICA en células de trofoblasto y de melanoma maligno . MICA y MICB se expresan en melanoma maligno y en trofoblasto temprano, preferencialmente en el citoplasma, con bajos niveles en membrana celular IL-10 endógena y exógena, disminuyen la expresion de MICA a nivel de transcrito y de proteína en superficie en líneas de células de melanoma IL-10 afecta tambien a MICB y ULBP2 Il-10 reduce en el decrecimiento de la citotoxicidad celular mediada por células citolíticas activadas It been desribed a lot of mechanisms about up regulation of NKG2D ligands, including heat shok citoquines and tunoginenesis, But actually the down rregulation mecanisms it not clear. I our lab we are focused in the studies of de evation mechanisms of the target cell to the killing action of NK I have tried to describe some possible mechanisms to the down regulation of the surface expression of MICA and MICB The tumour cells create mechanisms to evade the surveillance, 3 main systems 1) down regulation 2)The secretion of soluble forms 3)And the intracellular retention. La profundizacion de los estudios interaccion proteina proteina